PLoS ONE: Anvendelse af ovariecancerceller fra patienter, der gennemgår operation for at generere Primære kulturer kan undergå Funktionel Analysis

Abstrakt

Anvendelse af cellelinjer eller dyremodeller har betydelige ulemper, når der beskæftiger sig med et sæt af heterogen sygdomme, såsom epitelovariecancer. Dette har klinisk relevans i at biomarkører udviklet ved hjælp af cellelinje eller dyremodeller er ofte ikke overføres til den kliniske indstilling. I denne undersøgelse beskriver vi udviklingen af ​​en robust protokol for at udvikle primære kulturer af ovariecancer, der vil overvinde nogle af disse vanskeligheder. Kvinder, der gennemgår operation for kræft i æggestokkene blev rekrutteret og prøver af ascites og solide tumorer indskud blev brugt til at udvikle primære kulturer. Celler blev karakteriseret ved anvendelse af et panel af immunfluorescerende antistoffer før anvendelse i en række assays, herunder funktionel vurdering af DNA-reparationsveje. I løbet af undersøgelsen fireårig periode, levedygtige kulturer, bekræftet at være epitelial oprindelse blev genereret fra 156 af 172 (91%) tilfælde rekrutteret. Karakterisering blev udført under anvendelse af et panel af antistoffer, herunder pancytokeratin, CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 og vimentin. Ældning opstod mellem 2

nd og 8

th passager i alle kulturer undtagen en, hvor spontan immortalisering indtraf. Celler kan med held dyrkes selv efter en periode med opbevaring ved 4 ° C og dyrkede celler var i stand til at blive anvendt til en lang række applikationer, herunder funktionelle assays. Ved funktionel vurdering der var minimal intra-tumor heterogenitet. Det er derfor muligt at udlede levedygtige ovariekræft cellekulturer hos størstedelen af ​​patienter, der gennemgår kirurgi. Celler dyrket direkte fra patientens kræft give en præcis og yderst forskellige model

Henvisning:. O’Donnell RL, McCormick A, Mukhopadhyay A, Woodhouse LC, Moat M, Grundy A, et al. (2014) Brug af ovariecancerceller fra patienter, der gennemgår operation for at generere Primære kulturer kan undergå Funktionel analyse. PLoS ONE 9 (3): e90604. doi: 10,1371 /journal.pone.0090604

Redaktør: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, USA

Modtaget: November 13, 2013; Accepteret: 2 feb 2014; Udgivet: 6 marts 2014

Copyright: © 2014 O’Donnell et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den førende årsag til gynækologisk dødelighed kræft. verdensplan [1], og på trods af megen forskning i behandling af ovariecancer den samlede dødelighed har ændret sig lidt i løbet af de seneste 20 år med en 5-års samlet overlevelse på 30-39% [2]. Det har længe været anerkendt af klinikere, at kræft i æggestokkene er et sæt af heterogene sygdomme, men på trods af dette ovariecarcinom fortsat behandles klinisk som en enkelt sygdom ved hjælp af en kombination af debulking kirurgi og platinbaseret kemoterapi. Den observerede variation i den kliniske adfærd af ovariecancer ved siden af ​​de voksende data rapportering molekylær heterogenitet tyder på, at en heterogen model for studiet af kræft i æggestokkene er længst. Det nye begreb skræddersyet medicin baseret på biomarkører for reaktion på nye behandlinger rettet mod specifikke defekter i tumor DNA-reparation er kun muligt, hvis biomarkører kan testes ved hjælp af en realistisk model.

Etablerede cellelinjer giver et uvurderligt redskab til at studere biologiske funktioner på det molekylære og cellulære niveau. Eksisterende humanovarie cancercellelinier besidder den fordel, høj proliferativ kapacitet, clonogenecity og forlænget levetid i kultur. Men de fleste har erhvervet betydelige genetiske ændringer fra deres celler af oprindelse, herunder sletning af vigtige regulatoriske cellecyklus gener understøtter udødelighed. Desuden er der tegn på, at mange cellelinjer indeholder betydelig fejlagtig identifikation, dobbeltarbejde, og tab af integritet [3].

Primære celler isoleret fra patienter er ofte betydeligt forskellig fra etablerede cellelinjer af lignende oprindelse. Evnen til kultur og karakterisere frisk isoleret OSE (ovarie overflade epitel) og EOC (epitelovariecancer) celler fra patienter giver en vigtig eksperimentelt system, der har potentiale til at ligne patienten situationen mere præcist [4], [5].

der er to kilder til klinisk materiale, som er blevet anvendt til at generere primære kulturer i ovariecancer: ascitesvæske og fast tumor væv. Genekspressionsstudier har indikeret forskellige biologiske profiler i cancercellerne afledt fra disse to kilder fra den samme patient i form af metastase, invasion og angiogenese [6]. Ascitesvæske har flere fordele i forhold fast tumor væv i generering primære kulturer. Ascitesvæske er relativt let at opnå og dyrke de suspenderede celler er teknisk ligetil. Ascites-kulturer er blevet vist at frembringe en homogen epitelcelle rig population sammenlignet med dem opnået fra faste væv. Betydelige patienter med kræft i æggestokkene til stede på et fremskredent stadium og har store mængder af ascitesvæske, der kan opnås under kirurgi eller paracentese. Men som de fleste patienter med stort volumen ascites har tumorer af en høj kvalitet serøs histologisk subtype, vil kun prøveudtagning ascites underrepresent de andre histologiske undertyper. Dyrkning af fast tumor, især i fravær af ascites er derfor også nødvendigt at indfange en repræsentativ gruppe af prøver.

primær cellekultur fra begge kilder kunne give en ressource til afprøvning af molekylære profil og udførelse funktionelle studier af individuelle cancere. I de senere år sammenhængen mellem tumor molekylær heterogenitet, overlevelse og /eller respons på behandling er blevet anerkendt [7] og har næret søgningen efter biomarkører til at forudsige respons på nye behandlingsformer rettet mod DNA reparation veje dereguleret i kræft i æggestokkene.

Adskillige fremgangsmåder til kulturen af ​​primære ovariecancerceller isoleret fra ascites er blevet beskrevet [8]. Disse fremgangsmåder kræver imidlertid komplekse multi-trin procedurer. Dunfield

et al

og Shepherd

et al

beskrive en mere enkel og pålidelig dyrkningsmetode involverer blanding ascites direkte med medium, som resulterer i epithelcellekultur [4], [9]. Denne teknik er blevet tilpasset af vores gruppe til brug i forskning i den funktionelle status af DNA reparationsmekanismer og her vi rapporterer vores oplevelse af denne teknik.

Metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af de lokale etiske komité (UK IRAS North West etiske komité – 12 /NW /0202). og alle patienter gav skriftligt informeret samtykke

Reagenser

Rucaparib var en gave fra Clovis (USA) og er en potent inhibitor af PARP-1 og -2 proteiner (med en inhibering konstant i 5 nm). Alle andre kemikalier og vævskultur reagenser var fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, UK), medmindre andet er angivet.

Cell Culture

prøvetagning.

Ascites og solid væv blev indsamlet fra samtykke patienter, der gennemgår operation for kræft i æggestokkene på Queen Elizabeth Hospital, Gateshead, UK. Kliniske detaljer blev registreret og prøver registreret og håndteret i overensstemmelse med den menneskelige Tissue Act. Prøverne blev tildelt en PCO (Primary Kultur Æggestok) referencenummer at bevare anonymitet.

Sample transport og forberedelse.

Ascites blev opsuget direkte fra patienten i en steril sug flaske. Fast tumor blev anbragt i en steril universel indeholdende dyrkningsmedium (RPMI 1640 medium suppleret med 20% FCS, 20 mM L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin) forvarmet til 37 ° C. Prøverne blev transporteret fra hospitalet til laboratoriet straks i overensstemmelse med UK Kategori B regulativer UN3373.

Primær Culture fra ascites.

Celledyrkning blev udført ved hjælp af en aseptisk teknik i et indeslutningsniveau II laminar flow mikrobiologisk sikkerhed kabinet. 20 ml ascites blev sat til 20 ml opvarmet dyrkningsmedium (RPMI med 20% FCS, som ovenfor) i T75-kolber (Corning, USA) og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2, 95% befugtet luft . Mediet blev aspireret, og 13 ml opvarmet frisk medium blev erstattet på dag 3 til 5. Mediet blev udskiftet hver 4 til 5 dage, indtil cellerne nærmede konfluens. Celler blev passeret, frosset og optøet som beskrevet tidligere [10]. Cellekulturer blev sat i karantæne i en primær inkubator at afvente formelle resultater patologisk undersøgelse og sikre, at inficerede prøver ikke blev indført i generel kultur.

Primær kultur fra solid tumor.

Når i laboratoriet, den faste tumor blev dissekeret i -3 mm

3 stykker med en steril skalpel og overført til T25 kolber indeholdende tilstrækkelig collagenase /dispase (Roche, UK) opløsning (1 mg /1 ml i fuld medium) til fuldt ud at fordybe prøven. Cellerne blev inkuberet i 2 timer ved 37 ° C på en orbitalryster (IKA-Vibrax-VKR) ved 2 × G. Cellesuspensionen blev overført til en universel beholder, centrifugeret ved 400 x g i 5 minutter, PBS vasket, resuspenderet i fuld medium og anbragt i en T25-kolbe i 30 minutter for at tillade fibroblast podning. Den epitelcelle suspension blev overført til en T25 kolbe for løbende cellekultur.

Kultur optimering

Direkte dyrkning på dækglas.

Tid fra indsamling til funktionel vurdering kan være op til 14 dage. For at reducere længden af ​​kultur og håndtering før brug, blev medier og ascitesvæske (01:01 v:v) tilsættes direkte på sterilt dækglas til øjeblikkelig analyse.

Cytospinning.

Ascitisk væske blev cytospun direkte på objektglas efter optimering af centrifugering hastighed, prøvevolumen og berigelse af ascitesvæske ved hjælp af tilsætning af røde blodlegemer lysisbuffer. Efter cytospining, objektglas blev lufttørret, fikseret med 100% methanol og opbevaret ved -20 ° C til senere karakterisering.

Karakterisering

Ovariecancer er et sæt af heterogene sygdomme. Derudover indeholder ascitesvæske en række celletyper og en enkelt markør er derfor insufficent til pålideligt skelne epiteliale ovariecancerceller fra andre celletyper. En karakterisering panel bestående af cellekultur morfologi, immunfluorescensfarvning af fikserede celler, samt standard patologisk og immunhistokemi undersøgelse blev kombineret for at sikre nøjagtig epitel karakterisering af hver kultur. Salg

Morfologi.

morfologiske træk blev undersøgt under et Olympus CK40 omvendt mikroskop ved 20 × forstørrelse. Billeder blev taget med VisiCam software (VWR, USA).

Immunofluorescens.

Standard teknikker til immunofluorescens blev brugt til farvning for pancytokeratin, epitelial celleadhæsionsmolekyle (EpCAM), kræft antigen 125 (CA125 ), epitelial relateret antigen (MOC-31), D2-40 og vimentin, tabel 1. Ingen af ​​de positive markører udtrykkes ensartet på alle EOC celler, men fortolket i kombination gør det muligt at vælge hensigtsmæssige kulturer.

Formel histopatologisk

Formel patologisk og cytologisk undersøgelse af ascites og solide tumorer prøver fra patienter, som giver PCO prøver blev udført og anvendt til yderligere at karakterisere kulturer.

Når alle karakteriseringer var i tråd med epitelial oprindelse ovariecancer, blev prøverne derefter anvendt i efterfølgende eksperimenter. Hvis resultaterne var i overensstemmelse med epitelial oprindelse, blev kulturer kasseret.

Imagestream

X karakterisering

Etablerede PCO kulturer og friske ascites.

PCO celler, dyrkede hjælp af de metoder ovenfor, blev trypsiniseret, fikseret med 0,4% paraformaldehyd i 20 minutter ved 4 ° C, og permeabiliseres med BD Phosflow Perm /vask i (BD Biosciences, USA; 01:10 v:v destilleret vand).

i friske ascites blev ti ml ascitesvæske filtreret for at udelukke stort affald (180 um porestørrelse nylonfilter, Millipore, UK). Som ascitesvæske ofte er kontamineret med blod, tilføjelse af et fiksativ indeholdende røde blodlegemer lysepuffer (01:05 v:v BD Phosflow Lyse /Fix røde blodlegemer lyseringsbuffer, BD Biosciences, USA) aktiveret udtømning af røde blodlegemer. Celler blev permeabiliseres med BD Phosflow Perm /vask I og prøven yderligere beriget ved depletering af hvide blodlegemer under anvendelse EasySep Humant CD45 Depletion Kit (StemCell teknologier, Frankrig), i henhold til producentens anvisninger.

Alle prøver blev derefter inkuberet med immunoflourescent-mærkede antistoffer i 12 timer ved 4 ° C inklusive pancytokeratin, EpCAM, CA125, DRAQ5 nuklear farvning og fælles leucicytoe antigen (CD45) for at identificere hvide blodlegemer. Prøverne blev behandlet ved hjælp Imagestream

X (Amnis, USA) med IDEAS software bruges til at kvantificere andelen af ​​celler, der udtrykker de tre epitel markører, samt giver en vurdering af co-ekspression.

Vækst og cytotoksicitet assays Salg

SRB.

En rutinemæssig sulforhodamin B (SRB) assay blev anvendt til at vurdere cytotoksicitet og cellevækst som beskrevet tidligere [11]. Kort fortalt blev cellerne podet ved en koncentration på 1000 celler /brønd og efter adhærens, behandlet med forskellige koncentrationer af rucaparib i 10 dage før fiksering, farvning og spektrofotometer vurdering.

klonogene assays.

Klonogen assays betragtes guldstandarden til vurdering af cytotoksicitet. 50.000 celler /brønd blev podet i en 6-brønds plade i 24 timer. Celler blev derefter inkuberet i 24 timer med forskellige koncentrationer af det cytotoksiske middel før reseeding i koncentrationer på 2.500, 5.000 og 10.000 celler for hver lægemiddelbehandling. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C i 14 dage. Mediet blev aspireret, pladerne blev vasket i PBS og herefter fikseret ved hjælp af Carnoys fiksativ (eddikesyre: methanol 1:3 v /v).. Efterfulgt af farvning med 1% krystalviolet

Agar clonogenics

50.000 celler blev podet i brønde indeholdende medie og behandles som ovenfor i 24 timer i agarose medier. Celler blev derefter trysinised, vasket og re-udsået i halvfast agarose (Promega, UK) medier, ved forskellige koncentrationer og inkuberet i 14 dage. Kolonier blev farvet ved anvendelse 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT).

Cell transfektion

Luciferase udtrykkende plasmid pGL2 (Promega, USA ) blev transficeret under anvendelse af to metoder. For det første blev producentens protokol (Invitrogen, USA) til transfektion af celler med lipofectamin TM LTX med Plus reagens, der anvendes til at transficere PCO kulturer med 1-6 ug DNA per brønd. For det andet 250 pi PCO celle suspension indeholdende 1 x 10

6 celler /ml blev blandet med 1-5 ug pGL2 plasmid i 4 mm elektroporation kuvetter (Eurogentec, Belgien). Elektroporering blev udført under anvendelse af et EPI-2500 elektroporator på 100-500 volt. Transfektanterne fra begge fremgangsmåder blev høstet 48 timer efter transfektion og analyseret for luciferaseaktivitet.

Endvidere blev PCO kulturer transficeret under anvendelse MISSION ™ shRNA lentiviral transduktion partikler (Sigma-Aldrich, USA), i henhold til producentens protokol.

Homolog rekombination assay

Celler blev podet på dækglas og behandlet med 2Gy ioniserende stråling og rucaparib ved 10 uM koncentration i 24 timer for at inducere dobbelte strengbrud (DSB). Alle eksperimenter blev udført sideløbende ubehandlede kontroller med tilsvarende 0,1% DMSO. Celler blev derefter fikseret og rehydreret før farvning med monoklonalt 1:100 muse anti-γH2AX (Upstate, Millipore Corp., USA) og 1:100 gede polyklonalt anti-RAD51 (Calbiochem, EMD Biosciences, Inc., USA) antistoffer med passende sekundære fluorochrom konjugerede antistoffer, som tidligere beskrevet [5].

Billede J optælling software [12], [13] blev anvendt til at tælle γH2AX og RAD51 nukleinsyre foci. Cellerne blev klassificeret som homolog rekombination (HR) kompetent, hvis der var mere end en 2 gange stigning i RAD51 foci efter DNA-skade, bekræftes af en 2 gange stigning i γH2AX.

Resultater

Generering af primære kulturer fra ascites

ascites blev indsamlet fra 172 æggestokkene kræftpatienter i primær (67%) eller forsinket primær kirurgi (efter tre til fire cyklusser platinbaseret neo-adjuverende kemoterapi, 33%) mellem 2008 og 2013 . Levedygtige kulturer blev genereret på 166/172 (97%) tilfælde. Erythrocytter og cellerester fra ascites ikke adhærerede til kulturen kolben og blev fjernet følgende medier forandring. Generelt udseendet af hver kultur var den for en brosten monolag mønster, figur 1 (A), som beskrevet af Dunfield

et al

[4]. Ascitesvæske består af flere cellulære bestanddele og for at bekræfte eksklusiv vækst af cancerceller karakterisering af dyrkede celler er påkrævet. Immunoflourescent karakterisering af kulturerne blev udført ved hjælp af panelet af antistoffer mod detetct ekspression af pancytokeratin CA125, EpCAM, MOC-31, D2-40 og vimentin, figur 1 (B-F). 10/166 (6%), blev afvist, da de ikke kunne påvise mere end 95% cytokeratin positivitet. Den overordnede succesrate derfor for at skabe ascitiske epitelial primære kulturer fra patienter, der gennemgår kirurgi var 156/172 (91%). Rutinemæssig histopatologisk undersøgelse af FFPE væv fra hver patient blev gennemført, tabel 2. Den mest fremherskende histologiske undertype var høj kvalitet serøs kræft

A:. Lysfelt demonstrerer brosten monolag; immunoflourescent billeder med antistoffer rettet mod: B: FITC-anti-pancytokeratin; C: AlexaFluor 596 anti-CA125; D: Alexflour 488 anti-EpCAM; E: AlexaFluor 596 anti-MOC 31; F: Alexaflour 596 anti-vimentin

I en undergruppe af prøver blev immunoflourescent vurdering af CA125 udtryk i PCO prøve i forhold til CA125 udtryk på immunhistokemisk analyse af FFPE væv fra den samme patient , Figur 2. Korrelation af resultater fra de to vurderinger blev set i 8/11 (72%) tilfælde. I de resterende tre tilfælde, to viste IHC udtryk for CA125 kun, mens man viste IF udtryk kun

PCO 158 A:. Immunhistokemisk påvisning af CA125 i FFPE væv; B: Immunofluourescent påvisning af CA125 med Alexaflour596 fra tilsvarende primære kultur

Cellulær morfologi blev undersøgt over tid, og det blev set, at de fleste kulturer var af brosten morfologi men sene passage-celler (typisk efter passagen 4 /5) udviklet en mere mesenkymale fænotype, bliver langstrakt og udviser en markant reduceret vækstrate. Ældning fandt sted mellem den 2. og 8. passager, oftest mellem 4. og 5

th, hvilket gør yderligere karakterisering ved sen passage umulig. Kulturer blev fremsat uden held, når ingen vækst blev set efter 28 dage. En kultur spontant udødeliggjort og er blevet vokset til mere end 20 passager. Det er ikke klart, hvorfor kultur fra ascites mislykkes i en del af tilfældene, hvorfor ældning sker ved variable passager eller hvorfor kun én kultur har udødeliggjort. Det er sandsynligt, dog, at dette er en konsekvens af en mangel på væsentlige faktorer nødvendige for vækst, der er forsynet

in vivo

af de komplekse interaktioner inden tumor mikromiljø, og som mangler i den kunstige kultur miljø.

Kultur vækst

Vækstrater på 30 PCO kulturer, der dyrkes i RPMI medier suppleret med 20% FCS, blev målt ved SRB assays under anvendelse tidlige passage celler til at generere fordobling gange. Fordobling gange mellem PCO kulturer blev meget varierende med en median fordoblingstid på 100 timer (interval 79 til 195 timer), Figur 3. Dog celler fra testet på forskellige passage den samme kultur viste minimal variation i fordoblingstid (gennemsnitlig forskel på 0,9 timer ; SEM 4.8). Ingen korrelation blev demonstreret mellem vækstraten, histologisk undertype eller stadium af sygdommen ved præsentationen. Den relativt langsomme vækstrate set kan også være en konsekvens af articial culturee miljø og mangel på faktorer fra tumoren micronvironment.

Middel- og SD af 6 gentagelser for hvert tidspunkt er plottet, normaliseret til dag 1.

Primær kultur fra solid tumor

sideløbende med ascites, blev fast væv opsamlet fra 11 patienter og behandles som beskrevet. Etablering af cellekulturer fra vævseksplantater blev opnået i 100% af tilfældene. Eksplantatet morfologi blev tabt 72 timer efter podning som celler erhvervet et monolag brosten udseende med tiden og passage. Cultures viste en tilsvarende morfologisk udseende til sådanne afledt af ascites-cellekultur, Figur 4. fibroblast kontaminering blev minimeret ved udpladning af cellerne i 30 minutters inkubation før fjernelse af epitel rige supernatant og genudpladning, figur 5.

A: Passage 0 ved 48 timer; B: Passage 0 efter 72 timer; C: Passage 1 ved 14 dage

A: epitelcelle vækst fra supernatanten fjernet 30 minutter efter den første plating (× 20 forstørrelse); B: Celler klæber under den indledende 30 minutters inkubation var næsten udelukkende fibroblastisk (× 10 forstørrelse)

Sample transport

Transport optimering

Sted for prøvetagning.. er ofte fjernt fra laboratoriefaciliteter. For at kunne bruge denne model i samarbejde translationel arbejde vellykket etablering af kultur efter transport skal overvejes. Vi sammenlignede derfor succes kultur karakterisering og funktionelle assays efter forskellige transportmetoder

Gruppe 1 – Friske ascites (n = 10):. Transport til laboratoriet med behandling inden for 6 timer efter opsamling, ved hjælp af den ovenfor beskrevne metode .

Gruppe 2 – stuetemperatur prøver (n = 7):. ascites blev opbevaret ved stuetemperatur i en steril beholder i 24 timer før blanding 01:01 med medierne i en kolbe som ovenfor

Gruppe 3 – køle- prøver (n = 10): ascites blev opbevaret ved 4 ° C i 24 timer før blanding 1:01 med medium som ovenfor

Gruppe 4 – Frosne prøver (n = 6):. parrede sæt af 50 ml portioner af ascitesvæske blev centrifugeret ved 400G i 5 minutter. De fremkomne cellepellets blev frosset, opbevaret ved -80 ° C og -120 ° C og optøet ved 6 uger og 6 måneder.

Vellykket kulturer blev opnået fra alle transport- grupper dog i tilfælde med forsinket kultur det var at foretrække at opretholde kulturer ved 4 ° C. Der var ingen forskel i morfologien af ​​kulturer dyrket fra hver gruppe, tabel 3.

Ascitisk celle pellets (gruppe 4) opbevaret ved -80 ° C og -120 ° C, blev optøet ved 6 uger og 6 måneder. Kulturer lykkedes vokset fra begge opbevaringsforhold efter 6 uger uden observeret i morfologi, vækstrate eller funktionel vurdering forskel. Men efter 6 måneders opbevaring blev observeret en signifikant forskel i succes efterfølgende kultur fra de to betingelser. Ascitiske pellets opbevaret ved -120 ° C blev med succes dyrket i 83% tilfælde. Ingen kulturer opbevaret ved -80 ° C kan med held dyrkes.

dækglas kulturer

Den morfologiske udseende dækglas cellekulturer var beslægtet med parallelle kulturer behandles ved hjælp af standardmetoden. Immunoflourescent karakterisering var konsistent på tværs af alle PCO sager mellem dækglas og traditionelle metode kulturer. Optimal immunoflourescent farvning for karakterisering blev opnået, hvis udført mere end 24 timer efter podning.

Cytospinning

De optimale parametre for at skabe balance mellem maksimal celle vedhæftning med bevarelse af nukleare morfologi var 200 pi ascitesvæske (koncentration 10 × 10

4 celler pr ml) cytospun ved 80 x g i 5 minutter. Trods skridt at nedbryder ascitesvæsken prøve af uønskede ikke-epitelceller og snavs, forblev slides stærkt forurenet, bekræftet ved suboptimal cytokeratin farvning og dårlig CA125 udtryk. Forurening lavet vurdering af morfologi, immunoflourescent karakterisering og funktionel vurdering af HR-status mislykkedes.

Imagestream

X vurdering af PCO kulturer

Indførelsen af ​​Imagestream

X-teknologi med sin evne til at kombinerer flowcytometri med høj opløsning immunoflourescent mikroskopi tilladt vurderingen af ​​ekspression af en række immunfluorescerende-mærkede markører inden for de enkelte celler samtidigt ved høj hastighed og høj opløsning. Immunoflourescent påvisning af de tre epiteliale æggestokkene markører (pancytokeratin, EpCAM og CA125), vurderet ved anvendelse af standard fast immunofluorescens og Imagestream

X teknologi var konsistent i 13/15 tilfælde (87%), tabel 4. Desuden Imagestream

X muliggjorde kvantificering af procentvise udtryk og vurdering af co-ekspression.

Imagestream

X vurdering af friske ascites prøver

Ti ml frisk ascites blev indsamlet og analyseret fra syv æggestokkene kræftpatienter bruger Imagestream

X. Cellerne blev klassificeret som epitelial hvis de blev nukleeret, negativ for CD45 og positiv for EpCAM, CK eller CA125. Epitelcellen populationen i hver ascitisk prøve kunne opdeles i et antal subpopulationer baseret på det mønster af antistof mærkning, figur 6a og b og udvist stor inter-tumor heterogenitet. Andelen af ​​celler der farves positive for EpCAM var meget variabel med en median på 52% (0-98%). Der var ingen korrelation mellem Imagestream

X bestemmes ekspression af epiteliale markører og status som bestemt ved fast immunofluorescens (ROC-kurve, der ikke er vist, AUC på 0,5). Det er muligt, at nogle af disse subpopulationer kan repræsentere ikke-epiteliale celler (dvs. mesotelceller), men det også muligt, at de faktisk epitelceller og undergår fænotypiske forandringer som følge af kulturen metode; eller at dyrkningsmetode positivt vælger ud subpopulationer. Cell sortering med efterfølgende molekylær profilering af hver af de delpopulationer vil afklare dette og muliggøre yderligere molekylære forskelle i delmængder af EOC, der skal udforskes

A:. ImagestreamX celle plot af repræsentative celler demonstrerer de tre store cellulære subpopulationer inden ascitesvæske,; i) CK positivt kun, ii) CK og CA125 positive og iii) EpCAM, CK og CA125 positive. B: Sub-populationer identificeret i epitelcelle befolkning EOC ascitesvæske (n = det samlede antal epitelceller identificeret i 10 ml ascites)

Cell transfektion

A. antal funktionelle assays kræver transfektion af vektorer i celler [14], [15]. Trods optimering, både Lipofectamine og elektroporation transfektionsfremgangsmåder undladt at give en tilstrækkelig høj transfektion effektivitet for funktionelle assays.

Men cellerne fortsatte med at vokse i puromycin medier efter transfektion hjælp MISSION ™ shRNA lentiviral transduktion partikler tyder vellykket transfektion. Langsigtet transfektion kunne ikke vurderes på grund af den kortsigtede levetid af PCO kulturer.

Funktionelle homolog rekombination assays og cytotoksicitet

RAD51 assay for HR DNA-reparation status blev succesfuldt udført i alle primære kulturer, der blev dyrket med succes fra alle transport grupper. HR status for kulturer fra den samme PCO donor hjælp direkte plettering på dækglas og ascitiske kulturer var alle konsekvent. Dyrkning direkte på dækglas reduceret tidsforbruget fra indsamling til bestemmelse HR status fra ca. 14 til 5 dage.

Som forventet GI

50 værdier efter behandling med rucaparib for hver PCO kultur var variabel, men en klar differentiering af følsomme og resistente prøver blev betragtet som tidligere beskrevet [5]. I de fleste tilfælde, som forventet, PCO prøver med defekt HR status var følsomme over for rucaparib, mens de med kompetente HR status var resistente, tabel 5.

Trods optimering af flere standard klonogene teknikker, koloni dannelse sås ikke, og derfor klonogene assays opgivet i PCO kulturer. Cell line arbejde har tidligere demonstreret en lineær sammenhæng mellem resultater fra SRB og clonogenics, og derfor SRB blev vedtaget som standard teknik i denne undersøgelse [16].

Diskussion

Evnen til at generere og udnytte primære kulturer af ovariecancer har flere fordele frem for andre modeller, herunder etablerede cellelinier og dyremodeller. Det er nu erkendt, at mange cellelinjer i langsigtet kultur vil gennemgå yderligere genetiske afvigelser gør dem forskellige fra deres væv af oprindelse. Endvidere endda et stort panel af cellelinier kan kun gentages den enorme heterogenitet, der er set i epitelial ovariecancer. Mange dyremodeller blot xenotransplantater udnytte disse cellelinjer og derfor stadig have det samme sæt af problemer. Transgene mus modeller tendens til at der er blevet genereret ved at integrere et lille antal mutationer [17], og derfor ikke vise den massive kromosomale ustabilitet, der er en anerkendt kendetegnende for ovariecancer [18].

Her har vi beskrevet vores egne resultater til generering primære kulturer af ovariecancer, ved hjælp af celler afledt fra både ascites og faste aflejringer af sygdom. Evnen til kultur fra begge disse materialer er vigtigt, da, afhængig af den kliniske omgivelser, kan kun ét af disse materialer være til rådighed. For eksempel, i recidiverende sygdom er det ikke usædvanligt at se ascites i fravær af store faste aflejringer i modsætning til den første præsentation indstilling, hvor kun solid sygdom kan være til stede. Vi har rapporteret en sekventiel sæt prøver at demonstrere succesraten for generering kulturer. 156/172 (91%) prøver indsamlet resulterede i en levedygtig kultur af epitelceller. Dette tal er tilstrækkelig høj til at retfærdiggøre den mulige anvendelse af disse teknikker i almindelig klinisk praksis, hvis diagnostiske test blev udviklet til brug med dette materiale.

Ofte, og faktisk i vores egen sag, kan der være en betydelig geografisk adskillelse mellem operationsstuen og den diagnostiske laboratorium. Evnen til at transportere prøver uden tab af integritet er derfor afgørende, og vi har beskrevet teknikker som viser, at disse prøver sikkert kan holdes på enten 4 ° C eller -20 ° C i op til 24 timer før dyrkning. Desuden mulighed for at lagre kulturer lang sigt i flydende nitrogen giver mulighed for samarbejde om forskning eller

post hoc

diagnostisk analyse.

Specielt ved høje fase, hvor tumorer er formidlet i hele bughulen og ud, vil mange tumorer demonstrerer signifikant intra-tumor heterogenitet [19], [20], selv ofte disse ændringer er mere relateret til lokal stromal reaktion end af tilstedeværelsen eller fraværet af centrale driver mutationer [21].