PLoS ONE: Menneskelig phosphatidylethanolamin protein 4 fremmet Radioresistance for Human endetarmskræft ved Aktivering Akt i en ROS-Dependent Way

Abstrakt

Menneskelig phosphatidylethanolamin-bindende protein 4 (hPEBP4) er et nyt anti-apoptose molekyle forbundet med modstanden af ​​tumorer til apoptotiske agenter. Her søgte vi at undersøge den rolle, hPEBP4 i radioresistance af endetarmskræft. Immunhistokemi analyse viste hPEBP4 blev udtrykt i 27/33 af rektal cancer prøver, men kun i 2/33 af nabolandet normal slimhinde. Deaktivering udtryk for hPEBP4 med siRNA reducerede signifikant klonogene overlevelse og forbedret apoptose af rektal cancerceller på bestråling. I stedet tvinges overekspression af hPEBP4 fremmet dens overlevelse og reducerede apoptose. Western blot viste hPEBP4 kunne øge strålingsinduceret Akt aktivering, for hvilken der kræves reaktive ilt prøve (ROS). Den radioresistance effekt af hPEBP4 blev vendt efter given LY-294002 til at hæmme Akt aktivering eller antioxidant at afskaffe ROS produktion. Vi bekræftede også, at effekten af ​​hPEBP4 in vivo med nøgne mus. konkluderede derfor vi, at hPEBP4, specifikt udtrykt i rektal cancerceller, er forbundet med radioresistance af endetarmskræft, hvilket indebærer, at modulation af hPEBP4 kan have vigtige terapeutiske implikationer i strålebehandling af endetarmskræft

Henvisning:. Qiu J, Yang G Lin A, Shen Z, Wang D, Ding L (2014) Humant phosphatidylethanolamin protein 4 fremmet Radioresistance for human endetarmskræft ved Aktivering Akt i en ROS-Dependent Way. PLoS ONE 9 (3): e90062. doi: 10,1371 /journal.pone.0090062

Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA

Modtaget: August 6, 2013; Accepteret: 28 Januar 2014; Udgivet: 3 marts 2014

Copyright: © 2014 Qiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Fund Kina (projekt nummer 81.101.876), Medical Research Fund af Zhejiang Provincial Health Department (projekt nummer 2011RCA035), og Natural Science Fund i Zhejiang-provinsen (projektnummer Y2110782) og Medicinsk forskningsfond af videnskab teknologi afdeling af Zhejiang-provinsen (projekt nummer 2012C33SA100045). Ovennævnte finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest fremherskende kræft i hele verden. Det anslås, at der er næsten 1,2 millioner mænd og kvinder, der bor i USA med en tidligere diagnose af kolorektal cancer, og yderligere 143.460 vil blive diagnosticeret i 2013 [1]. Blandt de patienter, lokale fremskredne rektal cancer udgør en stor del af dem. Dag præoperativ chemoradiation terapi er blevet en integreret komponent i behandling for lokal fremskreden rektal cancer, som menes at være i stand til at reducere risikoen for lokalt recidiv og øge sandsynligheden for sphincter-konservering [2] kirurgi. Desværre er det ikke alle de rektale cancere er følsomme over for strålebehandling. Eksempelvis anslås det, at kun omkring 20% ​​af patienterne opnå fuldstændig patologiske reaktioner på præoperativ strålebehandling [3]. Så uddybe forståelsen af ​​radioresistace kan hjælpe os med at vælge radiosensitive rektal kræftpatienter til at modtage præoperativ strålebehandling, undgå forsinkelse af kirurgi for radioresistance patienter og endda overvinde radioresistance med nye radiosensitive strategier.

hPEBP4 er et nyt medlem af PEBP familie [4]. Overekspression i en lang række solide tumorer, herunder brystcancer, ovariecancer og prostatacancer, er hPEBP4 blevet påvist at inhibere apoptose af cancerceller ved at regulere nedbrydningen af ​​apoptotiske molekyler, såsom Bcl-2 /Bcl-XL og caspase-3 [ ,,,0],5] – [8]. I betragtning af at unddragelse af apoptose er et af kendetegnene af humane cancere [9] og radioterapi-induceret cytotoksicitet formidles, i vid udstrækning, ved induktion af apoptose i cancerceller [10], [11], vi spekulere at hPEBP4 kan deltage i modstanden af ​​rektal cancer til præoperativ strålebehandling. Faktisk vores seneste undersøgelse udviser hPEBP4 var en uafhængig prædiktiv biomarkør for respons endetarmskræft til præoperativ strålebehandling, hvilket tyder på, at opregulering hPEBP4 kunne være en potentiel mekanisme, hvormed rektal kræftceller undgår de ødelæggende virkninger af bestråling [12]. Men er der stadig ingen direkte eksperimentel bevis om den rolle, hPEBP4 i redioresistance af endetarmskræft hidtil.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi udtrykket status hPEBP4 i rektal kræft prøver og den tilstødende normale slimhinde samt ved immunhistokemi og udforskes, om hPEBP4 har en rolle i radioresistance af humane rektale cancerceller. Vores data indikerer hPEBP4 blev relativt udtrykt i rektal cancer væv og deltog radioresisitance af endetarmskræft, som var Akt og ROS afhængige. Vores undersøgelse indebærer, at farmakologisk eller genetisk modulation af hPEBP4 kan have vigtige terapeutiske implikationer forbedre helbredende virkning af præoperativ strålebehandling for endetarmskræft.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle dyr blev rejst ved hjælp af protokoller, der var blevet godkendt af Animal Care og brug Udvalg af Third Folks Sygehus af Hangzhou, Kina i henhold til relevante nationale og internationale retningslinjer og Animal Care og brug Udvalg også godkendt denne undersøgelse til at udføre. Skriftligt informeret samtykke fra donor blev opnået for brug af humane væv i denne forskning, som også blev godkendt af Etik Udvalg af Third Folks Sygehus af Hangzhou.

Reagenser og Cell Culture

Lipofectamine reagens og DCF-DA var fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Antistoffer specifikke for phospho-Akt (Ser473) og total Akt var fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). PI 3-kinase-inhibitorer, blev LY-294002 opnået fra Calbiochem. N-acetyl-Lcysteine ​​(NAC) antioxidant (Sigma) blev anvendt til at inhibere ROS-produktion. Alle humane colorektale cancerceller blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og opretholdt i DMEM-medium (Gibco, USA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt kalveserum, 4,5 g /liter D-glucose, uvæsentlige aminosyrer (100 uM hver), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin og 2 mM glutamin ved 37 ° C i en 5% CO2 atmosfære.

Immunhistokemi Analyse af hPEBP4 ekspression i humane Rektal Cancer

Alle patologisk bekræftede humane rektal cancer og tilstødende kræft væv blev opnået fra radikalt resektion tumor prøver med informeret samtykke fra hver patient i afdelingen for kolorektal kirurgi, den tredje Folkets Hospital i Hangzhou, Kina. Prøverne blev fikseret med formalin, indlejret i paraffin, og immunfarvet med anti-hPEBP4 antistof [4] med avidin-biotin peroxidase kompleks metode (Cybrdi, Xi’an, Shanxi, Kina). Immunoreaktivitet blev evalueret baseret på procenten af ​​positive-farvede celler. Intensiteten er udpeget som 0, når ingen tumorceller farvning (negativ), 1, når 10-20% af cellerne farvning (svag farvning), 2, når 20-50% af cellerne farvning (moderat farvning), og 3, når mere end 50% af celler farvning (stærk farvning). Til statistiske analyser, væv udføre 2 og 3 blev kombineret som konkret positiv og væv udføre 0 og 1 blev udpeget som negative.

Cell transfektion

hPEBP4 ekspressionsvektor konstrueret som beskrevet tidligere [4] blev transficeret i SW480-celler ved anvendelse af Lipofectamine reagens med pcDNA3.1 /Myc-His (-) B som en mock kontrol. 48 timer efter transfektion blev cellerne screenes under 0,8 mg /ml G418 (Merck, Darmstadt, Tyskland) i tre uger.

Individuel G418-resistente kolonier blev subklonet som SW480 /hPEBP4 og SW480 /Mock. Den hPEBP4 udtryk blev bestemt ved RT-PCR og Western blot-analyse.

hPEBP4 RNA Interference Assay

For stabil lyddæmpning af hPEBP4 udtryk i humane rektal cancer HRT-18 celler, cellerne blev transficeret med den hPEBP4-siRNA eller Neo plasmid under anvendelse af lipofectamin-reagens som beskrevet tidligere [5]. 48 timer efter transfektion blev cellerne screenes under 0,6 mg /ml G418 i 25 dage. Individuelle G418-resistente kolonier blev subklonet som HRT-18 /Mock og HRT-18 /hPEBP4-siRNA, og silencing resultat af hPEBP4 blev bestemt ved RT-PCR og Western blot-analyse.

RT-PCR for hPEBP4

RNA blev opsamlet med TRIzol (Invitrogen) og cDNA blev syntetiseret med 1 ug af total RNA under anvendelse af første streng cDNA-syntese kit-ReverTra Ace-α (Toyobo) ved 42 og 99 ° C i 20 og 5 min. PCR-reaktionen blev udført i et 10 pi reaktionsvolumen, som bestod af et indledende denatureringstrin ved 95 ° C i 30 sekunder og efter amplifikation af 30 cykler ved 95 ° C i 5 sek, 56 ° C i 30 sek. Primers til hPEBP4 var 5′-GGGTTGGACAATGAGGCTG-3 ‘(sense) og 5′-TGTGCTTGGGCTCGCTGGC-3’ (antisense).

Apoptose Assay

Celler blev vasket, resuspenderet i farvningen puffer og farvet med Annexin V /PI Apoptose (Invitrogen) eller R123 (R-302, Molecular Probes) ifølge producentens instruktioner. Farvede celler blev analyseret ved fluorescens-cellesortering (FACScalibur, Becton Dickinson, Mountain View, CA) .Experiments blev gentaget tre gange.

Western blot analyse

BCA Protein Assay Reagent Kit ( Pierce) blev anvendt til måling proteinkoncentration. Prøver indeholdende lige store mængder af protein blev separeret med 12% SDS-PAGE og overført til Protran nitrocellulosemembraner. Blots blev probet med de angivne antistoffer med passende peberrodsperoxidasekonjugeret antistoffer som sekundære antistoffer (Cell Signaling Technology). SuperSignal West Femto maksimal følsomhed substrat (Pierce) blev anvendt til den kemiluminescerende visualisering af proteiner [5].

Klonogen Survival Assay

Eksponentielt voksende rektale cancerceller i monolagskultur blev bestrålet i 100-mm petriskåle ved hjælp af en 250-kVp røntgen (0,61 Gy /min) ved en enkelt eksponering stråling. Efter udsættelse for ioniserende bestråling blev cellerne høstet til klonogene overlevelse analyse. Overlevelse efter stråling blev defineret som evnen af ​​cellerne til at opretholde deres klonogene kapacitet og til at danne kolonier. Kort beskrevet efter udsættelse for stråling blev celler trypsineret, talt og podet til kolonidannelse i 100-mm petriskåle på 500-1000 celler /skål. Efter inkubation intervaller på 21 dage blev kolonier farvet med krystalviolet og talt manuelt. Kolonier bestående af mere end 50 celler blev bedømt, og tredobbelte skåle blev talt for hver behandling. Eksperimenter blev udført mindst 3 gange for alle datapunkter. De eksperimentelle resultater blev korrigeret for virkninger induceret af den ikke-bestrålede kontrol. Forsøg blev gentaget tre gange.

caspaseaktivering Assay

HRT /Mock og HRT /siRNA-celler blev udpladet i 96-brønds plader (10.000 celler per brønd) og bestrålet (8Gy). Efter 24 timers inkubation blev aktiveringen af ​​cellulære caspaser 3/7 målt med et fluorescencebased assay (Apo-ONE Homogen Caspase-3/7 assay; Promega). Seks brønde pr behandling tilstand blev brugt til at opnå gennemsnitlige fluorescens-signaler og normaliseret til sham-behandlede kontrol HRT celler.

Måling af ROS

For indholdsanalyse ROS, ubehandlet og IR-behandlet (8Gy ) adhærente rektale cancerceller blev først analyseret for levedygtighed ved trypanblåt-udelukkelse og inkuberet med 4 pM DCF-dA i 45 minutter ved 37 ° C.Then cellerne blev analyseret ved flowcytometri som tidligere [13] beskrevne. Eksperimenter blev udført mindst 3 gange for alle datapunkter.

In vivo stråling undersøgelser

Male athymiske nu /nu mus (4 uger gamle) købt fra Experimental Animal Center i Shanghai og blevet rejst ved hjælp af protokoller, der var blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg. 48 mus blev tilfældigt opdelt i fire grupper. Mus blev injiceret subkutant med 2 × 10

6 HRT-18 /Mock og HRT-18 /siRNA celler på højre fod pad hhv. Når tumorer var ca. 0,5-0,8 cm i den længste diameter, blev musene bestrålet med 2 Gy Cs-strålekilde hver tredje dag i tre gange som tidligere beskrevet [14]. Tumorer blev overvåget og målt med formlen V = (a x b

2) /2 hver tredje dag. Observation blev lukket, når den gennemsnitlige mængde af tumor i enhver gruppe nåede ca. 2,0 cm

3. Alle mus blev udskåret 33 dage efter bestråling og tumorstørrelse tidskurven samt apoptose af tumorvæv blev analyseret.

TUNEL Assay

Tumorer opnået blev fikseret i 10% formalin og indlejret i paraffin efter mus blev udskåret. Efter afparaffinering blev tumorprøverne strippet af protein ved inkubation med 20 mg /ml proteinase K (Sigma Chemical) i 15 minutter ved stuetemperatur. TUNEL-farvning blev udført under anvendelse af en apoptose in situ detektion kit (Roche) ifølge producentens protokoller. Kernerne blev farvet med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI; blå fluorescens), og TUNEL-positive celler blev visualiseret ved grøn fluorescens. Mere end 200 DAPI-positive celler blev undersøgt i 5 tilfældige områder af hver gruppe, og TUNEL-positive celler blev talt for at beregne in situ apoptose.

Statistical Analysis

Data er udtrykt som middelværdi værdier ± SD. Statistisk signifikans af forskelle mellem grupper blev testet ved Students t-test eller envejs ANOVA. Forskel i hPEBP4 udtryk intensitet mellem menneskers rektal kræft væv og tilstødende normale rektal væv blev analyseret ved hjælp af Pearson chi-square test. En p-værdi på mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Øget ekspression af hPEBP4 i Human endetarmskræft

For at belyse udtryk mønster af hPEBP4, vi først undersøgt udtryk for hPEBP4 både i humane rektal cancer væv og normale tilstødende rektal væv med resektion prøver efter radikal kirurgi ved hjælp af immunhistokemisk analyse. hPEBP4 udtryk var til stede i en meget høj procentdel af endetarmskræft væv (78,8%, 26/33), sammenlignet med de meget lave procenter i matchede normale rektal væv (6,1%, 2/33; p 0,001, tabel 1, fig 1A , B). Dataene demonstrerer den foretrukne udtryk mønster af hPEBP4 i humane rektal kræft væv. For at undersøge funktionen af ​​hPEBP4 som reaktion på bestråling af human rektal cancer, blev ekspressionen af ​​hPEBP4 i to kolorektale cancercellelinjer modeller undersøgt, viser hPEBP4 var stærkt udtrykt i HRT-18-celler, men meget moderat udtrykt i SW480-celler (Fig 1C) .

A, B

udtryk for hPEBP4 i human endetarmskræft og tilstødende normale rektal væv med immunhistokemi (× 200);

C

udtryk for hPEBP4 af humane endetarmskræft cellelinjer målt med western blot.

hPEBP4 forfremmet Klonogen Overlevelse af endetarmskræft celler som reaktion på Stråling

for at undersøge, hvilken rolle hPEBP4 i radioresistance af endetarmskræft, vi først etableret stabile transfektanter banker ned hPEBP4 udtryk og overekspression hPEBP4 i HRT-18 og SW480 celler hhv. Effektiviteten af ​​overekspression eller stilhed hPEBP4 blev bekræftet ved RT-PCR (figur 2A). Derefter udførte vi kolonidannelse analyser i de to cellelinjer at vurdere effekten af ​​hPEBP4 på celle overlevelse efter stråling. Vi fandt, at den klonogene overlevelse af HRT-18 celler som respons af stråling var signifikant kompromitteret efter hPEBP4 blev stille, mens overekspression af hPEBP4 forstærkede den som vist i SW480-celler (Fig 2B, C). For at bekræfte radioresistance effekt af hPEBP4, vi gentog ovennævnte eksperimenter med HT-29 og LoVo celler som gen knockdown og overekspression modeller (fig 2D). Vi fandt, at den klonogene overlevelse af HT-29-celler var signifikant kompromitteret efter hPEBP4 blev stille, mens overekspression af hPEBP4 forbedret overlevelse LoVo celler efter bestråling (fig 2E).

A,

RT-PCR for at bekræfte den stabile overekspression af hPEBP4 i SW480 celler og stilhed hPEBP4 i HRT-18 celler;

B, C,

virkning hPEBP4 om clogenical overlevelse HRT-18 og SW480 celler;

D

, Western blot for at bekræfte den stabile stilhed hPEBP4 i HT-29 celler og overekspression af hPEBP4 i LoVo celler;

E

, effekt af hPEBP4 på clogenical overlevelse HT-29 og LoVo celler ved hPEBP4 stilhed og overekspression hhv. *, P. 0,05

hPEBP4 var involveret i modstandsbevægelsen for Strålebeskyttelse-induceret apoptose af Rektal Kræftceller

Som vist i fig. 3

En

, SW480 /mock celler var følsomme for stråling-induceret apoptose. Imidlertid SW480 /hPEBP4 celler, der overudtrykker hPEBP4 var relativt resistente over for stråleinduceret apoptose, hvilket indikerer, at hPEBP4 bibringer strålingsresistansen i rektal cancer. Derfor efter hPEBP4 blev stille, HRT-18 celler blev mere følsomme for stråling-induceret apoptose sammenlignet med de HRT-18 /mock-celler (fig. 3

B

). Ovenstående virkning hPEBP4 blev også gentaget i en anden knockdown og overekspression eksperiment med HT-29 og LoVo celler som modeller (fig. 3C), hvilket yderligere bekræfter virkningen af ​​hPEBP4 på strålingsmodstand i rektale cancerceller. hPEBP4 kan hæmme strålingsinduceret apoptose ved at indskrænke aktiveringen af ​​caspase3 og 7 (fig. 3D). I betragtning af at efter caspasekaskaden aktivering af den specifikke proteolytiske spaltning af PARP-protein er en vigtig begivenhed for forekomst af apoptose, blev virkningen af ​​hPEBP4 på PARP undersøgt efter bestråling. Med hPEBP4 lyddæmpning kombineret med stråling, blev der observeret en tydelig nedbrydning af 116 kDa PARP i en 85 kDa fragmentering protein sammenlignet med stråling alene (Fig 3 E), hvilket bekræfter, at hPEBP4 inhiberer strålingsinduceret apoptose af rektale cancerceller, ved aktivering af caspase-3 og proteolytisk PARP spaltning

A,

repræsentant resultat af FCM at vise effekten af ​​hPEBP4 på bestråling-induceret apoptose af SW480 celler.;

B,

repræsentativt resultat af FCM at vise effekten af ​​hPEBP4 på bestråling-induceret apoptose af HRT-18 celler; C, Histogram at opsummere effekten af ​​hPEBP4 på bestråling-induceret apoptose af HRT-18 (hPEBP4-siRNA), HT-29 (hPEBP4-siRNA), SW480 (hPEBP4 overekspression) og LoVo celler (hPEBP4 overekspression);

D,

effekt af hPEBP4 på bestråling-induceret capase3 /7 aktivering af endetarmskræft HRT-18 celle;

E,

effekt af hPEBP4 på bestråling-induceret PARP cleavge af rektal cancer HRT-18 celler. *, P 0,05; **, P. 0,01

hPEBP4-medieret Radiation-modstand Rektal kræftceller Var Akt og ROS Afhængig

Akt aktivering har vist sig at være involveret i radioresistance af talrige tumorer [15] – [17]. Så vi undersøgt rollen af ​​Akt i hPEBP4-medieret resistens over for stråleinduceret apoptose. For det første, vi undersøgte Akt aktivering efter stråling. Vi fandt Akt blev dramatisk aktiveret efter stråling i rektale cancerceller, hvilken blev fremmet af hPEBP4 (Fig 4A). For at bestemme om hPEBP4-medieret radioresistance kræver Akt aktivering, vi derefter præinkuberes rektale cancerceller med 20 pM LY-294002 i 1 time, og behandledes cellerne med stråling. Vi fandt, at LY-294002 næsten vendt den inhibitoriske virkning af hPEBP4 på stråling-induceret apoptose i både HRT-18 og SW480-celler (fig. 4B). Som generering af reaktive oxygenarter (ROS) er blevet rapporteret at spille en vigtig rolle i stråling-induceret apoptose af cancerceller [18], blev virkningen af ​​hPEBP4 på den intracellulære redox-status også vurderet. Som det fremgår af flowcytometrisk analyse med DCFH-DA, hPEBP4 alene havde ingen effekt på den intracellulære redox status. Men eksponering for stråling forårsagede en signifikant stigning i akkumulering af intracellulære peroxider i rektale cancerceller. Men der var ingen signifikant ændring for niveauet af intracellulære peroxider i rektal kræftceller efter hPEBP4 blev bragt til tavshed eller overeksprimeres (Fig4 C, D). Alligevel samtidig brug af antioxidant NAC (forbehandling for 4 timer ved en koncentration på 5 mM) med stråling næsten vendt effekten af ​​hPEBP4 på stråling-induceret apoptose af rektal kræftceller (Fig 4E). Interessant, samtidig brug af NAC og strålebehandling hæmmede også reguleringen af ​​Akt af hPEBP4 (Fig 4F), der foreslog, at ROS kræves af hPEBP4 at modulere Akt i forbindelse med stråling-induceret apoptotiske begivenheder. Tilsammen disse resultater viste, at hPEBP4 fremmet radioresistance af rektal kræftceller ved at handle i midten af ​​ROS og Akt signal pathway, som yderligere kan aktivere Caspaser at udløse apoptose.

A,

Western blot at vise effekten af ​​hPEBP4 på aktiveringen af ​​Akt efter bestråling med HRT-18 og SW480 rektal cancerceller;

B,

Annexin V /PI farvning at vise Akt aktivering var påkrævet i radioresistance effekt af hPEBP4 i HTR-18 og SW480 celler ved hPEBP4 stilhed og overekspression henholdsvis;

C

, repræsentant ROS farvning resultat at vise hPEBP4 havde ingen effekt på den intracellulære niveau af ROS i HRT-18 rektal cancerceller;

D

, histogram at vise hPEBP4 havde ingen effekt på den intracellulære niveau af ROS i både HRT-18 og SW480 rektal kræftceller ved hPEBP4 stilhed og overekspression henholdsvis;

E

, Resultat af Annexin V /PI farvning at vise ROS var påkrævet i radioresistance effekt af hPEBP4; .

F

blev Repræsentant resultat af western blot at vise ROS kræves i aktiveringen af ​​Akt af hPEBP4 efter bestråling med HRT-18 som studie model *, P. 0,05

hPEBP4 Deltager den Radioresistance af Rektal kræftformer i vivo

for at bestemme om hPEBP4 også kan mægle radioresistance af kolorektal cancer in vivo undersøgte vi effekten af ​​stråling alene, hPEBP4 tavshed alene, eller i kombination på væksten af ​​subkutan HRT-18 xenograft rektale tumorer i nøgne mus (fig 5A). Fra den femtende dag, tumorvolumenet i den kombinerede gruppe behandling var signifikant lavere end i strålingen eneste gruppe. Vækst forsinkelse efter den kombinerede behandling var mere end det skyldes nogen af ​​de andre behandlinger (Fig 5B). Repræsentative billeder af tumorvolumen på den femtende dag er illustreret i fig 5C. Vi observerede også apoptose af tumorceller in situ, hvilket indikerede, at der var en dramatisk højere apoptose indeks i HRT /hPEBP4-RNAi gruppen end i HRT /Mock gruppe (Fig 5D, E).

A,

flowdiagram af de in vivo forsøg;

B,

vækstkurve for virkningen af ​​hPEBP4 på det transplanterede humane rektal tumor in vivo efter bestråling;

C,

repræsentativt billede af den transplanterede rektal tumor i trædepuden af ​​nøgne mus for hver gruppe 15 dage efter bestråling;

D,

repræsentative TUNEL billede til at vise in situ apopatosis af de transplanterede rektale tumorer for hver gruppe efter musene blev aflivet;

E

, In vivo apoptose resumé efter bestråling for hver gourp mus.

Diskussion

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme virkningen af ​​hPEBP4 på radiosensitivitet af kolorektal cancer. Vores resultater tyder på, at hPEBP4 øger radioresistance af kolorektal cancer celler både in vitro og in vivo, som blev formidlet ved at fremme ROS-afhængige aktivering af Akt.

Præoperativ strålebehandling er blevet en standard del af den omfattende behandling af lokalt fremskreden endetarmskræft. Men mange patienter af rektal cancer er faktisk resistente over for strålebehandling på grund af heterogeniteten af ​​rektal cancer bestråling respons. For de patienter, præoperativ strålebehandling ikke blot forsinker øjeblikkelig assistance for kirurgi, men også kan forårsage alvorlige toksiciteter, såsom anastomotiske lækage, perineale sår infektion, og påvirke den anale sphincter funktion efter sphincter-bevarelse kirurgi [19], [20]. Så udforskning af mekanismen i radioresistance af rektal cancer er meget vigtigt at forbedre behandlingen effektivitet. Det er blevet påvist, at stråling-induceret apoptose er en vigtig mekanisme af radiosensitivitet i et panel af cancerceller, herunder colorectal cancer [21], [22]. Således kan et middel, der er i stand til at forbedre strålingsinduceret apoptose af tumorceller har potentiale til at udvikle sig til et strålingssensibiliserende middel. hPEBP4 er et hidtil ukendt medlem af phosphatidylethanolaminebinding proteinfamilie, der er konstateret fra humane stromale knoglemarvsceller [4]. Overekspression af hPEBP4 i bryst, prostata og ovariecancere er blevet vist at inhibere apoptose af cancerceller [4] – [8]. Så vi spurgte, om hPEBP4 spille en rolle i den reaktion endetarmskræft til strålebehandling. Faktisk i en nylig arbejde, havde vi vist, at hPEBP4 udtryk i en forbehandling biopsiprøve som en uafhængig prædiktor for reaktion på præoperativ strålebehandling hos patienter med endetarmskræft og vi fandt en dramatisk opregulering af hPEBP4 udtryk i rektal kræft væv efter præoperativ strålebehandling comprared med biopsiprøve under koloskopi undersøgelse, tyder på, at hPEBP4 kunne spille en rolle i radioresistance af endetarmskræft, selvom en direkte forbindelse mellem hPEBP4 og radioresistance ikke blev leveret på det tidspunkt [12]. Nu med den nuværende arbejde, kendetegnet vi den relativt specifikt udtryk for hPEBP4 i rektal kræftformer sammenlignet med tilstødende normale rektal væv og forudsat den direkte eksperimentelle bevis om radioresistance effekt af hPEBP4 i endetarmskræft. Vi skitserede også den underliggende mekanisme denne retning som bør konvergere på ROS-Akt signalvej. Men vi ikke kender den nøjagtige signal begivenhed nedad af ROS, hvorigennem hPEBP4 aktiveret Akt at fremme radioresistance af rektal tydning. For stråling med lav lineær energioverførsel, der oftest anvendes i radioterapi af rektal cancer i dag, oxygen og dets derivater, såsom frie radikaler og reaktive oxygenarter (ROS) er meget vigtige i drab af tumorceller snarere end et direkte angreb på DNA fra radioaktive stråler [23]. Men den rolle af ROS i radioterapi af tumoren er lidt kompliceret. På den ene side ROS er kritiske formidlere af ioniserende stråling-induceret celle ødelæggelse, og på en anden hånd ROS kan yde tumorceller med overlevelse fordel over normale modparter under stressede tilstand. Faktisk ROS er vigtige intracellulære signalmolekyler regulerer balancen mellem overlevelse og celledød [18], [24] – [26]. AKT syntes at være en kritisk faktor i radioresistance ved regulering af apoptose, cellevækst, glukoseoptagelse og udnyttelse, og proteinsyntese, såsom bcl-2 familiemedlemmer, Caspase-3/9, FKHRL1, frigivelse af cytochrom c fra mitokondrier [27 ] – [30]. Krydstale mellem ROS og Akt signalvej er blevet påvist at eksistere i mange tumorceller. Ioniserende stråling i det terapeutiske dosisinterval kan fremkalde en reversibel mitokondrie permeabilitet overgang og stimulere en forbigående cellulær generation af ROS, som derefter kan virke som sekundære budbringere i signaltransduktion [31] – [32]. Vores nuværende undersøgelse viste, at aktiveringen af ​​Akt af hPEBP4 i rektale cancerceller ved bestråling blev afskaffet efter antioxidant blev givet til at hæmme produktionen af ​​ROS, men hPEBP4 havde ingen effekt på den intracellulære niveau af ROS, hvilket tyder på, at hPEBP4 specifikt fremmer aktiveringen af Akt af ROS efter bestråling i rektale cancerceller. Faktisk kan både en overlevelse og apoptotisk effekt findes også for den Akt signalvejen efter aktiveres af ROS [33] – [36]. Baseret på de data, vi fik fra denne undersøgelse, mener vi, at hPEBP4 kan repræsentere en overlevelse signal molekyle ved at aktivere ROS-Akt signalvej i forbindelse med strålebehandling af endetarmskræft. Specielt overudtrykt i kræftceller, hPEBP4 hjælper kræftcellerne skæv til at modstå stråling-induceret drab ved selektivt at styrke overlevelse signal nedstrøms af ROS efter strålebehandling. Vi kan endda gøre en dristig spekulationer om, at Src kinase kan være den mellemliggende stillads for samspillet mellem hPEBP4, ROS og Akt siden vi har givet direkte beviser for sammenhæng mellem hPEBP4 og Src i et andet værk med brystkræftceller og Src var godtgjort at være nødvendig i aktiveringen af ​​Akt af ROS tidligere [32], [37].

sammenfattende er det den allerførste rapport antyder en rolle hPEBP4 i radioresistance af endetarmskræft og vi også foreløbigt spores ud den molekylære mekanisme af denne virkning. Plus den prædiktive værdi af hPEBP4 i radioresistance af endetarmskræft med kliniske tumor prøver i vores seneste rapport [12], mener vi hPEBP4 kan være et potentielt mål at øge følsomheden af ​​strålebehandling for endetarmskræft. Yderligere arbejde er nødvendigt for at påvise effekten af ​​hPEBP4 målrettet terapi i at fremme strålebehandling i dyremodeller af endetarmskræft og afsløre den sorte boks af signal begivenhed mellem ROS og Akt, som hPEBP4 integrerer at spille sin rolle.

tak

Vi takker professor Wang Fan for hans nyttige diskussion og Miss Yu for hendes støtte i at arbejde tidsplan.