PLoS ONE: Sporadisk tidlig debut Tyktarmskræft er en specifik Sub-type kræft: en morfologisk, Molekylær og Genetik Study

Abstrakt

Sporadisk tidlig debut kolorektal carcinom (EOCRC), som har per definition ikke identificeret arvelig prædisposition er et voksende problem, der forbliver dårligt forstået. Molekylær analyse kunne forbedre identifikationen af ​​forskellige undertyper af tarmkræft (CRC) med terapeutiske implikationer og dermed kan bidrage til at etablere, at sporadisk EOCRC er en selvstændig enhed. Fra 954 patienter resektion for CRC på vores institution, blev 98 patienter valgt. Patienter i alderen 45-60 år blev udelukket for at hjælpe med at definere “unge” og “gamle” grupper. Tredive-ni tilfælde af sporadisk EOCRC (patients≤45 år med mikrosatellitmarkørerne stabile tumorer) blev sammenlignet med både mikrosatellitmarkørerne stabile tumorer fra ældre patienter (36 sager, patienter 60 år) og til grupper af patienter med mikrosatellit ustabilitet. Hver gruppe blev testet for

TP53

,

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

mutationer og tilstedeværelsen af ​​en methylator fænotype. Genekspressionsprofiler blev også anvendt til pathway analyse. Sammenlignet med mikrosatellit stabil CRC fra gamle patienter blev sporadisk EOCRC præget af distal placering, hyppige synkrone metastaser og sjældne synkrone adenomer, men havde ikke specifikke morfologiske karakteristika. En familiær historie med CRC var mere almindelig i sporadiske EOCRC patienter på trods af en mangel på identificerede arvelige forhold (p = 0,013). Genetiske undersøgelser viste også fraværet af

BRAF

mutationer (p = 0,022) og methylator fænotype (p = 0,005) i sporadisk EOCRC forhold til ældre patienter. Genanalyse impliceret centrale veje såsom Wnt /beta catenin, MAP kinase, vækstfaktor signalering (EGFR, HGF, PDGF) og TNFR1-vejen i sporadisk EOCRC. Wnt /beta catenin signaleringsaktivering blev bekræftet ved afvigende nuklear beta catenin immunfarvning (p = 0,01). Denne undersøgelse antyder kraftigt, at sporadisk EOCRC er en klar klinisk-molekylær enhed præsentere som en distal og aggressiv sygdom forbundet med kromosom ustabilitet. Endvidere har flere signalveje herunder TNFR1 pathway blevet identificeret som potentielle biomarkører for både diagnose og behandling af denne sygdom

Henvisning:. Kirzin S, Marisa L, Guimbaud R, De Reynies A, Legrain M, Laurent -Puig P, et al. (2014) Sporadisk tidlig debut Tyktarmskræft er en specifik Sub-type kræft: en morfologisk, Molekylær og Genetik Study. PLoS ONE 9 (8): e103159. doi: 10,1371 /journal.pone.0103159

Redaktør: Peh Yean Cheah, Singapore General Hospital, Singapore

Modtaget: Marts 18, 2014 Accepteret: 26 juni 2014; Udgivet: 1. august, 2014

Copyright: © 2014 Kirzin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Data er tilgængelige på NCBI, GEO repository tiltrædelse nummer:. GSE39084

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Ligue régionale Contre le Cancer, Comité du Gers og programmet Carte d’Identité des Tumeurs fra Ligue Nationale Contre le Cancer. Forfatterne takker Institut National Contre le Cancer for deres støtte af den kliniske og laboratorie genetiker. Forfatterne takker Cancéropôle Grand Sud-Ouest for at levere kliniske anmærkninger. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er mest almindeligt ses hos ældre voksne med en median alder ved diagnose af 70 år [1]. Men ifølge amerikanske registre forekomsten af ​​CRC hos unge voksne er konstant stigende, med en sats på 1,5% om året mellem 1992 og 2005 i voksne i alderen 20-49 [2]. Tidlig debut CRC (EOCRC) er en aggressiv sygdom med dårlig differentiering og er klassisk placeret i venstre colon. Enkeltpersoner kan være disponeret for EOCRC gennem arvelighed og inflammatoriske tarmsygdomme. De mest veldefinerede arvelige former af CRC er Lynch syndrom og familiær adenomatøs polypose (FAP), der tegner sig for 2-4% og mindre end 1% af de samlede CRC tilfælde henholdsvis [3]. Den relative bidrag af inflammatoriske tarmsygdomme og FAP til EOCRC er beskeden, da begge betingelser let kan identificeres ved deres kliniske funktioner og forvaltes af screening og profylaktisk behandling efter fastlagte retningslinjer. I modsætning hertil har Lynch-syndrom ikke vise en bestemt fænotype og ofte fører til karcinom, der udgør en tredjedel af EOCRC tilfælde [4]. Således er størstedelen af ​​EOCRC er sporadiske tilfælde, der mangler genetiske markører angiver disposition

CRC er en heterogen sygdom, som er klassisk inddelt i tre undertyper [5], i henhold til de molekylære mekanismer der driver sin forvandling:. ( i) Kromosomal ustabilitet (CIN), det fremherskende middel, som er karakteriseret ved mikrosatellit stabile tumorer (MSS), tab af heterozygositet og større kromosomale ændringer i tumorsuppressorgener og onkogener [9]; (Ii) en epigenetisk forandring kendt som CpG island methylator fænotype (CIMP), som forårsager transkriptionel silencing ved methylering af CpG-rige regioner i promotoren af ​​tumorsuppressorgener. CIMP er ansvarlig for det store flertal af sporadiske MSI tumorer gennem lyddæmpning af promotoren af ​​MMR-genet

hMLH1

[7], [8]; (Iii) mikrosatelitter ustabilitet (MSI), som er kendetegnende for Lynch syndrom og er kendetegnet ved akkumulering af rammeskift mutationer i mikrosatellit sekvenser på grund af en mangel i fejlparringsreparation (MMR) gener [6]. Men denne øjeblikket anvendes molekylære klassificering af CRC baseret på kun et par fælles DNA-markører.

Som endnu de molekylære markører for sporadisk EOCRC ikke blevet grundigt undersøgt, og deres individuelle bidrag til carcinogenese er ikke blevet karakteriseret. Genome udtryk profil (GEP) analyse kunne forbedre den molekylære klassificering af CRC og bidrage til at identificere kliniske enheder og biomarkører, der kunne forudsige respons på behandlingen. Vi har for nylig brugt denne form for tilgang til at identificere seks molekylære undertyper af CRC, der opstår gennem distinkte biologiske veje [10].

Formålet med dette studie var at undersøge sporadisk EOCRC ved hjælp af en integreret tilgang, der kombinerer udtømmende clinico -pathological data med genetiske analyser for at bestemme den specifikke kliniske funktioner og molekylære profiler af denne enhed. For denne undersøgelse først identificeret vi en homogen gruppe af sporadisk EOCRC der blev defineret ved at have en kræftdiagnose på under 45 år, der ikke har nogen identificeret arvelig disposition til CRC, og som har en MSS-profil. Vi sammenlignede næste specifikke genetiske, epigenetiske og genekspression data fra denne gruppe med, at der fra andre veldefinerede grupper af CRC.

Materialer og metoder

Denne undersøgelse blev designet til at undersøge sporadiske EOCRC sager ( MSS tumorer fra unge patienter) og sammenligne dem med counterpart MSS tumorer fra ældre patienter. Vi inkluderede også CRC med MSI (både fra unge og gamle patienter), da de udgør en velkarakteriseret model af CRC onkogenese.

Patient og stikprøveudvælgelse

Mellem april 1999 og december 2005 954 patienter blev behandlet og fulgt op for CRC på vores institution. Patienter under 45 år (fra herom benævnt “unge” patienter) og over 60 ( “gamle”) blev anset for sammenligning. Eksklusionskriterier var: ikke tilgængelig frosne væv; diagnosticering af FAP eller IBD; præoperativ kemo /strålebehandling; prøver indeholdende mindre end 50% af tumorcellerne; og ukendt MMR-status. På grund af en høj andel af fase IV MSS tumorer fra unge patienter blev MSS tumorer fra unge og gamle patienter matchet efter tumor stadie. Efter prøven udvælgelse, 98 patienter var tilgængelige for undersøgelse, som vist i figur 1. Fire grupper af patienter blev defineret: MSS-Y (MSS-tumor 45 år), 39 tilfælde; MSI-Y (MSI tumor 45 år), 9 tilfælde; MSS-O (MSS tumor 60 år), 36 tilfælde; og MSI-O-gruppen (MSI tumor 60 år)., 14 tilfælde

Consort afbilder udvælgelsen af ​​patienter fra en enkelt institution, på grundlag af de foreliggende frosne væv og efter anvendelse af udelukkelseskriterier. Fire grupper blev defineret ved at tage hensyn alder og MMR status. Undersøgelsen er designet til at tillade sammenligning af MSS tidlig debut CRC med andre veldefinerede grupper af CRC. FAP: familiær adenomatøs polypose. IBD: inflammatorisk tarmsygdom. MMR status: Mismatch status Repair. MSS: mikrosatelitter stabil. MSI:. Mikrosatelitter ustabil

Etiske Komité Godkendelse

Alle patienter blev prospektivt registreret i en central sikret database er anmeldt til Kommissionen Nationale Informatique et Liberté (1.365.952). Brugen af ​​de indsamlede tumorer blev godkendt af Toulouse Hospital bord (CRB-Cancer Toulouse, DC-2008-463, AC-2008-820, CPP2). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag.

Studerede parametre

Nioghalvfjerds variabler af interesse blev udtrukket og analyseret. Disse omfattede kliniske data (familiær stamtavle, kræft websted, klinisk præsentation på diagnose, behandlingsmodaliteter, overlevelse) og tumor egenskaber (komplet patologiske data, tilstedeværelse af synkron adenom i resektion prøve, MMR status, tilstedeværelse af genetiske og epigenetiske ændringer). Klinisk opfølgning af patienter blev udført ifølge offentliggjorte nationale retningslinjer [11]. Overlevelseskurver blev etableret fra datoen for diagnose ifølge Kaplan-Meier beregninger. Nærmere oplysninger om undersøgte variabler tilvejebringes i tabel S1.

MMR status og familiær stamtavle

MMR status blev bestemt ved diagnose (tidligere til undersøgelsen) ved at vurdere mikrosatellit ustabilitet status ved hjælp af en pentaplex PCR og ved anvendelse af immunhistokemi (IHC) for at teste for ekspression af MLH1, MSH2 og MSH6, som tidligere beskrevet [12]. Mismatch reparation mangler (dMMR tumorer) blev defineret af MSI og /eller tab af ekspression af et af de MMR-proteiner, hvorimod dygtige MMR (pMMR) tumorer svarede til MSI-lav eller MSS tumorer, der udtrykker de MMR-proteiner.

stamtavlen over alle unge patienter blev vurderet ved en enkelt klinisk genetiker (RG). Gentest for de 2 store MMR gener

hMLH1

hMSH2

blev udført i tilfælde af MSI tumorer eller når personlig eller familiær kræft historie var til stede i unge patienter. Diagnosen Lynch-syndrom blev formelt bekræftet af identifikation af en skadelig kimlinie mutation i et MMR-gen. Tilfælde af MSI tumorer, der udviser et fravær af MSH2 eller MSH6 farvning med IHC blev betragtet som sandsynlig Lynch-syndrom.

Mutationsanalyse

Genotypning af centrale mutationer forekommer i kolorektal cancer (

KRAS

,

BRAF

,

TP53

PI3KCA

) blev udført efter DNA-ekstraktion fra frosne væv. De syv mest hyppige mutationer på kodon 12 og 13 i

KRAS

og codon V600E mutation i

BRAF

blev vurderet ved allel hybridisering under anvendelse Taqman prober, som beskrevet tidligere [13]. Direkte sekventering af

TP53

exonerne 5 til 9 og

PI3KCA

exon 9 og 20 blev udført parallelt ved anvendelse af Sanger-teknikken (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA).

Methylator fænotype vurdering

CIMP profiler blev bestemt ved hjælp af et panel af fem markører som beskrevet af Weisenberger

et al

:

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

SOCS1

. Efter DNA bisulfitbehandling blev to multiplex methylering-specifikke PCR’er udført. Fragment analyse blev udført ved kapillær elektroforese på en automatisk sekvenator (Beckman Coulter, Danvers, MA, USA). Methylator fænotype-positive tilfælde (CIMP +) havde 3 eller flere methylerede initiativtagere mens CIMP-negative dem havde mindre end 2 denatureret initiativtagere, defineret i henhold til fastlagte kriterier [14].

RNA ekstraktion og microarray analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) og kontrolleres for renhed, integritet og mængde. Prøver blev derefter amplificeret, mærket og hybridiseret på en Affymetrix Human Genome U133 Plus2 GeneChip, efter fabrikantens én-cyklus target mærkning protokol (Affymetrix, Santa Clara, CA). De chips blev scannet med en Affymetrix GeneChip Scanner 3000 og rå intensiteter blev udvundet fra de efterfølgende billeder ved hjælp af GCOS 1.4 software (Affymetrix). Data blev normaliseret ved hjælp af den Robust Multiarray Gennemsnitsberegnings (RMA) metode, implementeret i R pakke affy [15]. Data er tilgængelige på NCBI Gene Expression Omnibus repository (tiltrædelse nummer: GSE39084).

Unsupervised analyse

Klasse opdagelse blev udført ved konsensus gruppering af udtryk profiler, som tidligere beskrevet [16]. Probesæt blev først filtreret for at holde dem, der udtrykkes (dvs. med en normaliseret intensitet værdi over 15) i mindst 10% af prøverne med en varians betydeligt højere end medianen varians af alle probesæt (p 0,01). Derefter blev 7 lister opnået som omfattede 1% til 50% af de mest variant probesæt (baseret på den robuste variationskoefficient). For hver probe sæt liste blev prøver grupperet hjælp 1-Pearson korrelation for distance metrisk og Ward kobling, hvilket giver 7 dendrogrammer. Skillevægge i k klynger (k fra 2 til 8) blev afledt fra hver dendrogram og konsensus partition blev beregnet for hver værdi af k, hvilket giver 7 konsensus partitioner.

Overvåget analyse

Foreninger mellem klinisk og molekylære anmærkninger og prøve grupper blev testet for statistisk signifikans under anvendelse af chi i anden-test eller Fisher eksakt test efter behov. Gener udtrykkes differentielt mellem tumorer fra unge og gamle MSS patienter blev udvalgt på baggrund af Limma modereret t-test p-værdier korrigeret for multipel testning af Benjamini Hochberg metode ( 0,05) [17]. Veje fra Biocarta databasen blev testet for berigelse af deregulerede gener ved at kombinere de følgende metoder: Globaltest (R pakke globaltest), SAM-GS, og Tuckey [18], [19]. P-værdierne for hver metode blev omdannet til rækker, og den gennemsnitlige rang blev beregnet til ordre veje.

Beta catenin signalvej aktivering

Immunhistokemi blev udført på formol-fikserede og paraffin-indlejrede blokke fra de 98 patienter i studiet med det monoklonale muse-antistof beta catenin (Klon 14, BD Biosciences, fortynding 1/200, Ventana XT autostaineren (Tucson, AZ, USA). Alle objektglas blev revideret af to patologer blindet til grupper af patienter ( JS og SK). Aktivering af beta catenin signalering pathway blev defineret ved stærk kernefarvning i over 50% af tumorcellerne, med eller uden diffus cytoplasmatisk farvning og med et tab af cellemembran-farvning [20].

Resultater

klinisk-patologiske karakteristika sporadisk EOCRC

Den sporadiske EOCRC gruppe bestod af 39 patienter, fordelt som følger: 17 var 40-45 år, 13 var 35-40 år, 5 var 30-35 år, 2 var 25-30 år, og to var under 25 år. en sådan fordeling i alder er i overensstemmelse med data offentliggjort i det amerikanske register [1]. I sammenligning med tumorer fra MSS gamle patienter, sporadiske EOCRC (MSS unge patienter) viste særlige kendetegn. Rektale tumorer var mere rigelige i sporadisk EOCRC (41% versus 8,3%, p = 7,4

e-04) med mindre hyppige adenomer ses på operativt fjernede prøver (8% versus 33%, p = 0,013). Især 15 (38%) sporadiske EOCRC patienter havde en familie historie (første eller anden grads slægtning) i CRC sammenlignet med 3 (9%) i gruppen af ​​MSS gamle patienter (p = 0,013). En stamtavle analyse af disse 15 patienter viste, at tre af dem havde en klar autosomal dominant transmission arv mønster med flere familiemedlemmer, der er berørt. To af de 3 var fra samme familie, men ingen kimcellelinje mutation er blevet identificeret til dato. De resterende 12 patienter havde en ubestemt form for transmission med kun ét medlem af ascendant familien har CRC, som regel i en fremskreden alder ( 60 år). I overensstemmelse med franske anbefalinger,

MUTYH

mutation analyse blev udført for kun 1 patient, som præsenteres med 8 adenom, men denne analyse var negativ [21]. En personlig historie om CRC blev kun observeret i gamle patienter (herunder både MSS og MSI tumorer). Alle tumorer fra MSI unge patienter opstod i forbindelse med Lynch-syndrom, og 3 patienter (21,5%) fra MSI gamle gruppe var også Lynch patienter. Når man overvejer hele studiepopulationen, blev de andre signifikante forskelle observeret mellem grupper knyttet til MMR-mangel, nemlig hyppigere proksimale placering (p = 2,0

e-05), dårlig celledifferentiering (p = 0,033) og hyppig mucinøs komponent ( p = 0,012). De vigtigste karakteristika ved den undersøgte population er rapporteret i tabel 1.

Sporadisk EOCRC er en aggressiv sygdom ofte præsentere med metastaser på diagnosetidspunktet. Placeringen af ​​metastatiske tumorer var overvejende i leveren og lungerne, som observeret for CRC. En specifik overlevelse profil blev observeret for hver gruppe af patienter, med samlede overlevelse bedre til MSI end MSS patienter. På trods af en høj belastning af metastaser (med 23,1% mod 5,6% at have flere metastatiske steder ved diagnose), sporadiske EOCRC patienter havde en bedre 5-års samlet overlevelse end MSS gamle patienter, selv om dette ikke var signifikant (69% mod 42%, p = 0,09). Den femårige samlede overlevelsesrate var nogenlunde det samme for MSI patienter, selv om MSI unge patienter oplevede hyppigere tidlig recidiv (figur 2).

Hver gruppe havde en specifik samlet overlevelse profil selv om ingen var signifikant forskellige fra hinanden (p = 0,15). MSS: mikrosatelitter stabil. MSI: mikrosatelitter ustabil

Genetiske og epigenetiske egenskaber ved sporadiske EOCRC

mutations profiler af

KRAS

,

BRAF

TP53.

og CIMP status blev fastlagt for alle patienter (tabel 2).

PI3KCA

genotypebestemmelse blev udført for 74 tumorer. Den mutations profil sporadiske EOCRC tumorer var ligner MSS tumorer fra gamle patienter til

KRAS

,

TP53

og

PIK3CA

gener, men var klart forskellig for

BRAF

mutationer og CIMP profiler. Sporadiske EOCRC tumorer hverken indeholdt

BRAF

mutationer (p = 0,022) og heller ikke vist en CIMP + profil (p = 0,005) i sammenligning med tumorer fra MSS gamle patienter. MSI tumorer i gamle patienter havde en høj grad af

BRAF

mutation (36%) og ofte vises en CIMP + profil (62%). MSI unge patienter adskilte sig fra MSI gamle patienter ved fraværet af en methylator fænotype (p = 0,006) og

BRAF

mutationer.

Transkriptomet analyse

mikroarraydata var opnået for 70 patienter. Ukontrollerede analyser viste, at, uanset antallet af klynger og procentdelen af ​​variantgener anvendes, blev de underliggende partitioner konsekvent og stærkt forbundet med MMR status og grupper. Andre variabler signifikant forbundet med de ukontrollerede partitioner var tumor placering, CIMP status og muteret BRAF. Disse variabler blev selv tæt forbundet med MFR-status. Alder var lidt associeret med nogle ukontrollerede partitioner (opnået ved anvendelse af 5% og 20% ​​af de mest forskellige gener). Konsensus partition i de 5 klynger var mest tæt forbundet med de fire grupper, der er defineret på MFR status og alder (figur 3). Cluster 1 (C1) blev næsten udelukkende består af defekte MMR tumorer. Klynge C2 blev beriget med dygtige MFR og BRAF-muterede tumorer. Klynger C3 og C4 indeholdt mere CIMP +, C4 bliver næsten udelukkende består af dygtige MMR tumorer fra gamle patienter. Cluster 5 (C5) blev beriget med sporadiske EOCRC tumorer findes i venstre colon

Unsupervised klassificering af udtryk profiler:. Dendrogram af den nærmeste klyngedannelse til konsensus partition for k = 5. Legend: io, MSI /Gammel ; iy, MSI /Young; så, MSS /Gamle; sy, MSS /Young; d, mangelfuld MMR; p, dygtige MMR; R, højre colon; L, venstre colon; Re, rektum; M, muteret; . W, vildtype

Vi næste foretaget en overvåget analyse af MSS tumorer (n = 54), der leveres en liste med 297 probe sæt tegner sig for 219 meget diskriminerende gener (p 0,001). Dette sæt leveres en klar sondring mellem sporadiske EOCRC tumorer og tumorer fra gamle MSS patienter (Figur 4). En omfattende beskrivelse af disse gener er tilvejebragt i tabel S2. Den eneste nøgle CRC onkogenese gen, der var stærkt dereguleret i sporadisk EOCRC var beta catenin (

CTNNB1

). Det høje antal af diskriminerende gener tilladt os at udføre sti analyser til bedre at forstå sporadisk EOCRC carcinogenese. Fyrre-ni veje var signifikant beriget for differentiel genekspression i sporadisk EOCRC forhold til MSS tumorer fra gamle patienter. En fuldstændig beskrivelse af dem er fastsat i tabel S3. Blandt dem var 20 involveret i cellesignalering, 10 i inflammation og apoptosis, 7 i adhæsion og /eller motilitet, 7 i udviklingsbiologi og 3 i celleproliferation (figur 5). Flere veje som var opreguleret i sporadisk EOCRC var relateret til de store signalveje involveret i CRC såsom MAP-kinase og PI3KCA /AKT eller er relateret til vækstfaktorer (EGF, HGFR og PDGF) og angiogenese (VEGF). To primære veje i adhæsion og /eller motilitet regulering (integrin signalveje og celle-til-celle adhæsion signalering) var opreguleret i sporadisk EOCRC. Interessant, de fleste af de veje relateret til inflammation og /eller apoptose, der blev fundet op reguleret i sporadisk EOCRC er direkte eller indirekte knyttet til TNF-R1 vejen (TNFR1 vej, HIV-1Nef, FAS signalvejen, TNF /Stress Relateret signalering) .

varmen kortet viser ekspressionen af ​​219 gener. Baseret på ekspressionsniveauer blev gener grupperet i fire klynger af meget overudtrykte gener (røde kasser omgivet af en sort kant) og en klynge af underexpressed gener i MSS tumorer (blå bokse omgivet af en sort kant) fra unge patienter sammenlignet med MSS tumorer fra ældre patienter. MSS: mikrosatelitter Stabil. MSI:. Mikrosatelitter ustabilitet

Pathway analyse gruppering de 49 mest markant beriget veje for differentiel genekspression mellem sporadiske EOCRC og MSS tumorer fra gamle patienter. Veje blev inddelt i fem hovedkategorier, nemlig celleadhæsion /motilitet, inflammation /apoptose, celleproliferation, cellesignalering og udviklingsmæssige biologi. Fordelingen af ​​de vigtigste kanoniske veje blandt kategorier er detaljeret samt deres rang orden. Denne rangorden er angivet med symbolet # efterfulgt af rækken nummer (# 1 betyder, at denne vej er den mest dereguleret blandt de 49 veje).

Beta catenin immunhistokemi

microarray data ovenfor identificerede beta catenin at være den eneste nøgle CRC onkogenese gen dereguleret i sporadisk EOCRC. Vi søgte derfor at vurdere beta catenin aktivering ved hjælp immunhistokemi. Alle tilfælde af MSS tumorer fra unge patienter (39 tilfælde) og 33 tilfælde (33/36) af MSS tumorer fra gamle patienter blev valideret for beta catenin aktivering ved hjælp immunhistokemi. Beta catenin aktivering blev identificeret i 17 tilfælde (44%) fra MSS-unge patienter og 5 tilfælde (15%) fra MSS-gamle patienter (p = 0,01) med en nuklear +/- cytoplasmatisk farvning (figur 6).

A. Tværsnit af en tumor fra en MSS-gammel patient viser kun membranfarvning. B. Tværsnit af en tumor fra en sporadisk EOCRC (MSS-Young) patient viser stærk cytoplasmatisk og nuklear farvning med et tab af membran farvning, hvilket afspejler Wnt /beta catenin aktivering.

Diskussion

resultaterne af den foreliggende undersøgelse tyder på, at sporadisk EOCRC er et særskilt klinisk og molekylær enhed. For første gang, vi leverer en integreret analyse af både omfattende kliniske data og genomik fra et omhyggeligt screenet række konsekutive patienter, der var blevet behandlet og fulgt op på en enkelt institution. Denne translationel tilgang har givet os mulighed for at forfine tidligere begrænset beskrivelse af denne særlige form for CRC og kaste indsigt i dens specifikke tumor biologi.

I øjeblikket er der ingen accepteret klar definition af tidlig alder for debut i marken af CRC. Derfor er de fleste undersøgelser rapporterer om dette emne omfatter patienter i de 40-50 år af aldersgruppe [22], [23]. Men der er en progressiv stigning i hyppigheden af ​​CRC mellem 40 og 50 år, så det er sandsynligt, at i disse undersøgelser er der en blanding af specifik EOCRC enhed og sen begyndelse CRC. For at løse dette problem har vi brugt en mere restriktiv definition af både tidlig og sen debut CRC: patienter mellem 45 og 60 år blev udelukket for at sikre en klar opdeling af de to enheder og undgå overlapninger af disse to former for CRC. En anden forvirrende faktor i analysen af ​​EOCRC i mange undersøgelser er manglen på sondring mellem de arvelige former af CRC, især Lynch syndrom og den sande sporadiske form af CRC. Men Lynch-syndrom selv tegner sig for en tredjedel af EOCRC tilfælde [24]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse en fuld stamtavle blev etableret af en klinisk genetiker for alle unge patienter. Lynch syndrom sager blev identificeret ved hjælp af robuste kriterier og var klart adskilt fra sporadisk EOCRC. På trods af dette, i denne undersøgelse sporadiske EOCRC patienter havde en høj familiehistorie (38%). Et mindretal af dem præsenteret med en autosomal dominant transmission nedarvning (8%), der sandsynligvis svarer til en arvelig sygdom, som der endnu ikke er blevet identificeret gen modtagelighed (X-syndrom). På den anden side er det i stigende grad erkendes, at et par mindre prædisposition loci kunne være ansvarlig for en kompleks form for CRC arvelighed [25]. Derfor kunne en sådan genetisk disposition også være involveret i nogle patienter med EOCRC. Denne hypotese understøttes af den lave synkron adenom vi observeret i sporadiske EOCRC patienter, som kunne afspejle accelereret carcinogenese sekundært til prædisponerende forhold.

Det har længe været erkendt, at de morfologiske særlige forhold EOCRC er fattige celledifferentiering, kolloid komponent og lymfocytisk stroma reaktion [22], [26] – [29]. Igen er disse data sandsynligvis forvirret ved inddragelse af Lynch syndrom patienter, der typisk er forbundet med disse histologiske træk. I de to eneste undersøgelser, der specifikt har analyseret MSS-unge patienter (en med 24 og en med 55 tilfælde), var der ingen sammenhæng mellem mucinous histologi, dårlig differentiering, tumor-infiltrerende lymfocytter og tidlig debut af sygdom [30], [ ,,,0],31]. Vores undersøgelse har bekræftet disse oplysninger, og vi viser endvidere, at dårlig celledifferentiering og en mucinøs komponent klart er forbundet med MSI status uanset alder af patienten. I modsætning hertil har vi ikke observere en sammenhæng mellem lymfe invasion, perineurale invasion eller signetring celle histologi med sporadisk EOCRC, som blev rapporteret i de to tidligere undersøgelser, der er nævnt ovenfor (data ikke vist) [30], [31].

fra et klinisk synspunkt, vores resultater er enige med den kliniske beskrivelse af sporadisk EOCRC nylig offentliggjort af Chang et al .: sporadiske EOCRCs stede som tumorer med distal placering og hyppige metastatisk sygdom [30]. I den foreliggende undersøgelse var påfaldende høje synkron metastatisk sygdom i EOCRC gruppen (41%) førte os til at matche MSS gamle patienter til tumor stadium for ikke at forspænde genekspression sammenligninger. Selvom det ikke er statistisk signifikant, unge patienter tendens til at have bedre overlevelsesrater efter den fase af sygdommen sammenlignet med ældre patienter. Selvfølgelig yngre patienter sandsynligvis gennemgå mere aggressiv behandling inklusive kemoterapi eller gentagen kirurgisk resektion for metastatisk sygdom, der kan forbedre dårligere prognose givet for EOCRC. Selvom delvis modstridende med ældre undersøgelser, hvoraf nogle var globale analyser baseret på registre, den nuværende arbejde giver pålidelige resultater for de samme nævnte grunde [32] – [35]. Samlet set sporadiske EOCRC præsenterer som en aggressiv sygdom med distal placering, høj tumor scenen og ingen klar histologisk specificitet.

Den foreliggende undersøgelse er den første til at give et overblik over hyppigheden af ​​en standard panel af genmutationer samt som epigenetiske ændringer specielt til sporadisk EOCRC. Etablerede kolorektale carcinogenese klassifikationer, ved hjælp af en kombination af KRAS og BRAF-mutationer med CIMP og MSI-status, gøre det muligt at identificere tre til fem forskellige molekylære undergrupper af CRC [36], [37]. For eksempel er KRAS og p53-mutationer klassisk forbundet med CIN-tarmkræft henviser BRAF mutationer er stærkt forbundet med sporadiske former af CIMP + /MSI + CRC. Enkelte studier har undersøgt mutationsrater i sporadiske EOCRC sager og vist, at 0 til 8% har

BRAF

mutationer, 0 til 4%

PIK3CA

mutationer, 6 til 78%

KRAS

mutationer, og 64%

TP53

mutationer [30], [31], [37] – [40]. Vi identificerede en sats for

KRAS

TP53

mutationer (henholdsvis 37% og 44%) som svarer til CIN tumorer, men med et fravær af

BRAF

mutationer og ingen tegn på en methylator fænotype [41]. De uoverensstemmelser med data fra litteraturen om mutationsrater i EOCRC kan være forbundet med manglen på en klar skelnen mellem MSS og MSI tumorer i ældre undersøgelser, som kan have påvirket mutationsrater, især for

KRAS

BRAF

[39], [40]. Samlet set vores genetiske undersøgelse favoriserer den hypotese, at sporadisk EOCRC er en undergruppe af CIN tumorer med hverken

BRAF

mutation eller methylator fænotype.

opnået ved ukontrollerede analyser klyngedannelse viste, at forskelle i gen udtryk profiler (GEP) blev primært bestemt af MMR status og i mindre grad af CIMP status, mens alder haft ringe effekt. Disse resultater er tidligere blevet påvist ved undersøgelser, der viser, at MSI og MSS tumorer har differentiel ekspression profiler, der validerer de foreliggende resultater [42]. Men selv om GEPs var stærkt signifikante i overvågede analyser begrænset til MSS tumorer, som viser et sæt af 219 gener adskiller unge fra gamle patienter, skal resultaterne af udtryk arrays betragtes med forsigtighed, da gen lister ofte undgå at blive reproduceret. I modsætning hertil har pathway analyser vist sig at være reproducerbar, og bringe den biologiske betydning for genekspression arrays [43]. Talrige veje klassisk involveret i CRC onkogenese opreguleret i sporadisk EOCRC, såsom MAP-kinase, mTOR og VEGF /angiogenese, men veje relateret til vækstfaktorsignalering er også involveret (EGF, HGF-receptor og PDGF). Vi har også identificeret

CTNNB1

som en af ​​de mest over-udtrykte gener i MSS-unge patienter i forhold til MSS-gamle patienter og brugte immunhistokemi at vise, at dette fører til en over-aktivering af beta catenin i sporadisk EOCRC.