PLoS ONE: Prospective Validering af Candidate SNPs af VEGF /VEGFR Pathway i metastatisk kolorektalkræft Patienter behandlet med First Line FOLFIRI Plus Bevacizumab

Abstrakt

Formål

De potentielle virkninger af forskellige SNPs af

VEGF /VEGFR

pathway på det kliniske resultat af FRK patienter, der fik bev-holdige regimer er blevet undersøgt i retrospektive erfaringer med kontrasterende resultater. Vi har tidligere rapporteret foreningen af ​​

VEGFA

rs833061 C /T varianter med PFS i metastatisk kolorektal kræftpatienter behandlet med første-line FOLFIRI plus bevacizumab. Det primære formål med dette arbejde var at fremadrettet validere, at retrospektiv fund. En genfremsat analyse af andre SNP’er af

VEGF /VEGFR

syntesevejsgener var inkluderet.

Eksperimentel design

For at detektere en HR for PFS på 1,7 til

VEGFA

rs833061 T /T i forhold til C- varianter i metastatisk kolorektal kræftpatienter behandlet med første-line FOLFIRI plus bevacizumab, indstilling tosidet α = 0,05 og β = 0,20, 199 hændelser var påkrævet.

VEGFA

rs699946 A /G, rs699947 A /C,

VEGFR1

rs9582036 A /C og rs7993418 A /G,

VEGFR2

rs11133360 C /T, rs12505758 C /T og rs2305948 C /T og

EPAS1

rs4145836 A /G blev også testet. Kimlinjekonfiguration DNA blev ekstraheret fra perifert blod. SNPs blev analyseret ved PCR og sekventering.

Resultater

Fire-100-24 pts blev inkluderet. På univariat analyse, ingen forskelle i henhold til

VEGFA

rs833061 C /T varianter blev observeret i PFS (p = 0,38) eller OS (p = 0,95). Blandt analyserede SNP’er, kun

VEGFR2

rs12505758 C- varianter i forhold til T /T, var forbundet til kortere PFS (HR: 1,36 [1,05-1,75], p = 0,015, dominant genetisk model) og OS, med en tendens til signifikans (HR: 1,34 [0,95-1,88], p = 0,088). I multivariat model, denne forening beholdt signifikans (HR: 1,405 [1,082-1,825], p = 0,012) i PFS, der gik tabt ved at anvende multiple test korrektion (p = 0,14)

Konklusion

.

Dette prospektive erfaring undladt at validere hypotese forudsigende effekt af

VEGFA

rs833061 varianter. Retrospektive resultater på forskellige kandidat SNPs blev ikke bekræftet. Kun

VEGFR2

rs12505758 varianter, hvis prognostisk og ikke prædiktiv effekt er tidligere rapporteret, korreleret med PFS. I betragtning af kompleksiteten af ​​angiogenese, er det snarere i modsætning, at en enkelt kim-line SNP kan være en god indikator for gavn af bevacizumab

Henvisning:. Loupakis F, Cremolini C, Yang D, Salvatore L, Zhang W, Wakatsuki T, et al. (2013) Prospektiv Validering af kandidatlandene SNPs af

VEGF /VEGFR

Pathway i metastatisk kolorektalkræft Patienter behandlet med First Line FOLFIRI Plus Bevacizumab. PLoS ONE 8 (7): e66774. doi: 10,1371 /journal.pone.0066774

Redaktør: Xiao-Ping Miao, MOE Key Laboratory for Miljø og Sundhed, Institut for Folkesundhed, Tongji Medical College, Huazhong Universitet for Videnskab og Teknologi, Kina

modtaget: 30 marts 2013; Accepteret: 10 maj 2013; Udgivet: 4 jul 2013

Copyright: © 2013 Loupakis et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

hæmning af angiogenese, gennem blokaden af ​​VEGF /VEGFR vej, er en effektiv strategi i behandlingen af ​​metastatisk kolorektal cancer (mCRC). Ikke kun den anti-VEGFA monoklonalt antistof bevacizumab (BV) [1], [2], men også, i de allersidste måneder, VEGF og PIGF fælde aflibercept [3] og multikinasehæmmer, regorafenib [4] har vist betydelige fordele i form af overlevelse.

ved et klinisk perspektiv, den relativt lille absolutte fordel, som disse nye agenter, samt tilgængeligheden af ​​et stigende antal terapeutiske muligheder gør identifikationen af ​​prædiktive biomarkører et væsentligt behov for at optimere brugen af ​​antiangiogeniske midler. Desværre, op i dag, dette behov er stadig uløst

Med hensyn til BV, på trods af flere forsøg spænder fra den farmakodynamiske til det billeddannende metode [5] -. [6], ingen biomarkører for fordele eller modstand er blevet identificeret indtil nu. Ser man på biologi angiogenese, stigende beviser fremhæve bidrag tumor mikromiljø til kræft progression. Den såkaldte “niche” [7] – [8], herunder endotel og mesenchimal celler, spiller en central rolle i væksten af ​​nye fartøjer, der er derfor et stort set vært-medieret, foruden tumor-medieret, fænomen. Baseret på disse overvejelser, det farmakogenetiske tilgang, som evaluerer effekten af ​​kim-line variation om narkotika ‘effekt, tjente succes som et lovende redskab til at afsløre potentielle indikatorer for fordel. Ikke desto mindre op i dag, har flere retrospektive erfaringer forudsat ufyldestgørende og endda modstridende resultater [9] – [14].

Vores gruppe retrospektive undersøgelser sammenslutningen af ​​4

VEGFA

SNPs med overlevelse parametre i en kohorte af 111 FRK patienter behandlet med upfront FOLFIRI plus BV og i et historisk, ikke-randomiseret, kohorte af 107 FRK patienter behandlet med upfront FOLFIRI alene [10]. En væsentlig sammenslutning af

VEGFA

rs833061 C /T allele varianter med PFS og OS blev rapporteret i BV-gruppen, men ikke i kontrolgruppen. Ved behandling med BV, patienter bærer

VEGFA

rs833061 T /T-genotypen havde signifikant kortere PFS sammenlignet med dem med mindst én C- allel, både i univariate og i den flerdimensionale model. Desuden er betydningen af ​​en sonderende interaktion test, selvom påvirket af den manglende randomisering bias, foreslået, at denne forening kan faktisk relateret til effekten af ​​BV.

Vores mål var at validere fremadrettet foreningen af ​​denne SNP med resultat i et klinisk forsøg designet og drevet for at bekræfte SNP som en prædiktiv biomarkør i en population af tidligere ubehandlet mCRC modtager førstevalg FOLFIRI plus BV, ligesom befolkningen indgår i den retrospektive kohorte.

i i mellemtiden blev nye tiltalende resultater, som den største farmakogenetiske analyser relateret til BV og resultatet af patienter med forskellige solide maligniteter, randomiseret til at modtage eller ej antiangiogen lægemiddel i første linje randomiserede fase III-forsøg [15]. Blandt 158 ​​undersøgte SNP’er i potentielt relevante gener, Lambrechts et al. identificeret nogle lovende SNPs i

VEGFA, VEGFR1 /2

og

EPAS1

. Vi har derfor medtaget som sekundære endepunkter vores prospektiv undersøgelse evaluering af alle de SNPs, der viste en mulig sammenhæng med resultatet i retrospektiv undersøgelse præsenteret af Lambrechts et al.

Her præsenterer vi den første prospektive evaluering af kandidat SNPs af VEGF /VEGFR vej som potentielle prædiktorer for kliniske resultater i en stor og klinisk homogen kohorte af FRK patienter behandlet med første-line FOLFIRI plus BV. I øjeblikket tilgængelige beviser om den potentielle prædiktive og /eller prognostisk effekt af undersøgte SNP’er er opsummeret i tabel 1.

Patienter og metoder

Kriterier for berettigelse og Undersøgelse Procedurer

Patienter med histologisk bekræftet diagnose af metastatisk kolorektal adenocarcinom blev indrulleret i forsøget, hvis de var mere end 18 år gammel, havde mindst én målbar læsion i henhold til RECIST 1.0 og havde aldrig blevet behandlet for metastatisk sygdom. Forrige adjuverende oxaliplatin var tilladt, hvis der var gået mere end 12 måneder mellem afslutningen af ​​adjuverende behandling og tilbagefald. Tilstrækkelig knoglemarv, lever og nyrefunktion var påkrævet. Alle involverede fag underskrev deres skriftligt informeret samtykke til at studere behandling og relaterede procedurer. Forsøget blev godkendt af den lokale etiske komité (Comitato Etico Sperimentazione Farmaco – Azienda Ospedaliero-Universitaria Pisana) og klinisk undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen

Undersøgelse behandling bestod af hver anden uge administrationer BV 5 mg /. kg ev på dag 1, efterfulgt af irinotecan 165 mg /kvadratmeter ev, infunderes samtidig med L-Leucovorin 200 mg /kvadratmeter ev, efterfulgt af 5-fluorouracil 400 mg /kvadratmeter ev og 5-fluoruracil 2400 mg /kvadratmeter som en 48-h kontinuerlig infusion start på dag 1. Irinotecan blev administreret i højst 12 cyklusser eller indtil progressiv sygdom, uacceptabel toksicitet eller patienternes afslag. 5-fluorouracil, L-Leucovorin og BV blev fortsat, indtil tegn på progressiv sygdom, uacceptabel toksicitet eller patienters afslag.

Svar blev vurderet ved hjælp af CT-scanning, blev der gentaget hver 8. uge. RECIST kriterier v1.0 blev anvendt.

Seks ml blodprøver blev opsamlet i EDTA-rør og opbevaret ved -20 ° C.

Statistisk Design

Baseret på vores tidligere retrospektive fund, vi designet et prospektivt fase II forsøg. Ifølge Schoenfeld design, for at påvise en negativ effekt af

VEGFA rs833061

T /T-variant i forhold til C- varianter svarende til en HR for PFS på 1,7, vedtage tosidet α = 0,05 og β = 0,20 henholdsvis og under antagelse af en prævalens på T /T variant af 25%, vi anslås at kræve 199 begivenheder.

foreningen af ​​polymorfier med PFS og OS blev analyseret under anvendelse Kaplan-Meier-kurver og log-rank test.

PFS blev defineret som tiden fra den første administration af forsøgsbehandlingen, indtil den første dokumentation af objektiv sygdomsprogression ifølge RECIST 1.0 eller død på grund af en hvilken som helst årsag, alt efter hvad der indtræffer først. Patienter i sekundær radikal resektion af metastatiske læsioner blev censureret på tidspunktet for operationen.

OS blev defineret som tiden fra den første administration af forsøgsbehandlingen frem til datoen for død på grund af enhver årsag.

de associationer mellem polymorfier og RR blev undersøgt ved hjælp kontingenstabeller og Cochran-Mantel-Haenszel test.

Siden 9 SNPs blev testet, blev Benjamini og Hochberg metode bruges til at styre den falske opdagelse sats (FDR) af multiple test hypotese. Polymorfier, der var signifikant forbundet med kliniske resultat med en FDR-justeret P værdi på 0,15 blev udvalgt til at indgå i multivariat model

I den multivariate Cox regressionsanalyse for PFS og OS, modeller blev justeret for mucinøs. histologi, ECOG PS, baseline LDH-niveau, antal metastatiske steder og primær tumor site. Vi brugte den trinvise Cox regressionsmodel til at vælge kovariater, der blev tegnede sig for i multivariate model. Kovariater, der forblev signifikant på et 0,1-niveau i den multivariate analyse blev bibeholdt.

Ved anvendelse korrektion flere test for antallet af analyserede SNP’er, sammenslutningen af ​​

VEGFR2

12.505.758 C /T varianter med klinisk resultatet var ikke signifikant (p = 0,14).

Alle analyser blev udført ved hjælp af SAS statistisk pakkeversion 9.2.

Denne undersøgelse er afsluttet, og er registreret i ClinicalTrials.gov, med nummer NCT01363739. Undersøgelse behandling ikke er blevet udstedt med henblik på denne retssag; patienter ville have fået den samme regime uafhængigt af deres tilmelding.

Genotypning

Genomisk DNA blev ekstraheret fra perifert blod ved hjælp af QIAamp Kit (Qiagen).

VEGFA

rs833061 C /T, rs699946 A /G og rs699947 A /C,

VEGFR1

rs9582036 A /C og rs7993418 A /G,

VEGFR2

rs11133360 C /T , rs12505758 C /T og rs2305948 C /T og

EPAS1

rs4145836 A /G SNP’er blev gentyped ved hjælp af PCR og sekventering. Efterforskere udfører genetiske analyser blev blindet for patienternes karakteristika og klinisk resultat.

Resultater

Fra april 2006 til maj 2011, har 424 FRK patienter været indskrevet i 35 italienske Oncology Units. Vigtigste patienters karakteristika og korrelationer med kliniske resultater er sammenfattet i tabel 2 og 3.

På en median opfølgning på 24 måneder blev 292 patienter skred frem, og 164 døde. I den samlede befolkning median PFS og OS var 10,5 og 29,9 måneder. To-100-19 (53%) og 25 (6%) ud af 417 evaluerede patienter viste delvis eller konkurrere respons. One-100-31 (31%) patienter viste stabilisering af sygdommen, mens 42 (10%) patienter skred frem. Den objektive responsrate var 59%, og sygdomskontrolrate var 90%. Fyrre-seks (11%) patienter gennemgik sekundær R0 resektion af metastatiske læsioner.

Primær Endpoint

VEGFA

rs833061 C /T SNP lykkedes genotype i 423 tilfælde. Ingen sammenslutning af

VEGFA

rs833061 C /T varianter med kliniske resultat blev observeret (tabel 4 og 5). Patienter er homozygote for T /T (N = 147) viste en median PFS på 10,2 måneder vs 10,0 måneder for patienter, der bærer mindst en C- allel (N = 276) (HR: 1,17 [95% CI: 0,91-1,50], p = 0,218) (figur 1). Også med hensyn til OS, patienter homozygote for T /T viste en median OS på 32,1 måneder vs 29,9 måneder for patienter med mindst én C- allel (HR: 0,96 [95% CI: 0,70-1,33], p = 0,733) ( figur 2). Vejviser

sekundære endpoints

Som rapporteret i tabel 6 og 7, ikke signifikant sammenhæng af

VEGFA

rs699946 A /G og rs699947 A /C,

VEGFR1

rs9582036 A /C og rs7993418 A /G,

VEGFR2

rs11133360 C /T og rs2305948 C /T og

EPAS1

rs4145836 A /G allelvarianter med kliniske resultat blev observeret.

En væsentlig sammenslutning af

VEGFR2

12.505.758 C /T varianter med kliniske resultat blev fundet i form af PFS ( p = 0,045), men ikke RR (p = 0,50) eller OS (p = 0,12) ved anvendelse af co-dominant genetisk model.

Patienter med mindst en C- allel (N = 118) viste en median PFS af 9,5 måneder sammenlignet med 10,9 måneder hos patienter homozygote for T /T (N = 306) (HR: 1,36 [95% CI: 1,06-1,75], p = 0,015, dominant genetisk model) (figur 3). Patienter med mindst en C- allel viste en median OS 23,5 måneder sammenlignet med 32,1 måneder hos patienter homozygote for T /T (N = 306) (HR: 1,34 [95% CI: 0,95-1,88], p = 0,088) ( Figur 4). I den flerdimensionale model, herunder mucinous histologi, ECOG PS, baseline LDH niveauer, antal metastatiske steder, og primær tumor websted som kovariater,

VEGFR2

12505758 C- varianter blev stadig forbundet til kortere PFS sammenlignet med T /T variant (HR: 1,405 [1,082-1,825], p = 0,012). (Tabel S1).

Diskussion

I de senere år har søgningen efter biomarkører i stand til at forudsige gavn af BV været en af ​​de mest konkurrencedygtige translationelle forskningsområder. Trods mange bestræbelser og nogle lovende kandidater, har ingen markører leveres pålidelige og reproducerbare resultater, hvilket gør dette uløste udfordring ekstremt spændende. Spørgsmålet er, hvorfor har det været så svært at identificere kliniske relevante prædiktive markører for BV.

En af de mest tvingende grunde er den biologiske kompleksitet tumorangiogenese der er anerkendt som et af kendetegnene for kræft. I de senere år data tyder rollen af ​​flere veje i væksten af ​​nye tumorkar, hvilket fører til at undersøge den samtidige inhibering af multiple angiogene mål som en potentielt effektiv strategi [16]. Den rolle, som flere celletyper i udviklingen af ​​en sådan et indviklet netværk af signaler har også dukket op, og bidraget fra både stromale celler og knoglemarv afledte vaskulære stamceller rekrutteret og stimuleret af hypoxiske betingelser, er blevet dokumenteret [17]. Relevansen af ​​tumor mikromiljø som et afgørende aktør i nye skibe vækst og stabilisering og den kritiske konsekvenser af den ekstracellulære matrix i støtte neoangiogenese nu veletableret, hvilket bekræfter bidrag både vært og tumor-relaterede faktorer til den såkaldte “angiogen balance”.

Alle virkningsmekanismer af anti-VEGFA terapi er fortsat uklare, da blokade af cirkulerende VEGFA kan påvirke ikke kun tumorer, men også stroma og proliferation og modning endotelceller ‘. Mens BV antiangiogeniske egenskaber blev først tilskrevet hæmning af endotelceller ‘spredning, er i dag flere forskellige biologiske virkninger anerkendt, såsom hæmning af knoglemarv-afledte stamceller normalisering af fartøjer’ struktur, det vaskulære “konstriktion”, og den afbrydelse af cancer stamceller ‘niche, den direkte effekt på tumorceller og samspillet med værtens immunsystem. Som en konsekvens af disse mange virkningsmekanismer, oversættelse af

in vitro

in vivo

resultaterne i den menneskelige model er ikke umiddelbar og adskillige vanskeligheder gøre udviklingen af ​​effektive prækliniske modeller ekstremt kompliceret .

en anden komplicerende faktor i identifikationen af ​​biomarkører for BV er, at som et enkelt middel har meget begrænset antitumor effekt, således at den confounding effekt af kemo-backbone overskygger BV effekt. Desuden ikke responderende patienter i henhold til RECIST også opnå fordele i form af forlænget tid til tumorprogression [18].

På trods af disse udfordringer, nogle potentielle kandidater er opstået fra forskellige retrospektive kliniske forsøg. Selv om disse markører ofte blev anset værdig til yderligere undersøgelse blev ingen af ​​dem valideret og trådte klinisk praksis.

Vores gruppe for nylig viste lovende sammenslutning af

VEGFA

rs833061C /T allelvarianter med kliniske resultater . vores biomarkør blev imidlertid identificeret retrospektivt i en klinisk kohorte, som ikke blev randomiseret, og er påvirket af tilgangen multiple-test [10].

Denne kliniske forsøg repræsenterer vores forsøg på at tage den udfordring validering op, hævdede af statistikere og metodologi eksperter siden indførelsen af ​​målrettede lægemidler til klinisk praksis [19]. Behovet for at validere retrospektive resultater, ved at udføre prospektive forsøg er i dag en kendsgerning. Selvom randomiserede studier med et interaktionsdesign eller en såkaldt “markør-baseret strategi” ville give den højeste grad af beviser, ville de også kræve ekstremt store antal hændelser [20]. En mere pragmatisk, men metodisk korrekt forslag er “retrospektiv-prospektive” tilgang, hvor hypotesen genereret af den retrospektive erfaring fremadrettet udfordret på en ny kohorte [21]. Op i dag, på trods af det store antal potentielt interessante markører på vej ud retrospektiv serie, prospektive forsøg med en formel statistisk hypotese er aldrig blevet gennemført. Så vidt vi ved, vores arbejde repræsenterer den første proof of concept opretholde denne tilgang inden for kolorektal onkologi.

Retssagen, der er designet på baggrund af vores retrospektive fund, attesterer den fejlslagne

VEGFA

rs833061C /T SNP som en potentiel indikator for gavn af BV og bekræfter ikke tidligere resultater om andre kandidatlande SNPs.

med hensyn til

VEGFR2

12.505.758 C /T SNP, hvis prognostisk snarere end prædiktiv effekt er tidligere blevet foreslået [16], bør vi erkende, at betydningen af ​​sammenhængen med PFS blev tabt ved anvendelsen korrektionen multiple test. Men da VEGFR2 erhverver voksende relevans som følge af bekræftelse af andre målrettede agenter forstyrrer dens funktion, ligesom aflibercept og regorafenib kan disse resultater fortjener yderligere undersøgelser.

Den opmuntrende resultat rapporteres i form af OS ( median OS: 29,9 måneder) formentlig afspejler tilgængeligheden af ​​disse patienter, indskrevet i perioden fra april 2006 og maj 2011, til alle cytotoksiske og målrettede midler indiceret til behandling af mCRC samt forbedring af locoregional teknikker og den stigende ekspertise engagerede kirurger.

som konklusion, selvom anerkende relevansen af ​​foreløbige retrospektive oplevelser som vigtige udgangspunkter til at generere nye arbejds-hypoteser, den foreliggende undersøgelse bekræfter den absolutte betydning af de fremadrettede validering som et væsentligt skridt på biomarkører ‘vej mod klinisk anvendelse .

Desuden er baseret på kompleksiteten af ​​tumor angiogenese biologi og inddragelse af flere aktører i denne proces, det synes snarere ulig en enkelt kim-line SNP kunne redegøre for effekten af ​​BV af sig selv. Sammenbruddet i “kandidat SNP strategi” baner vejen for nye spørgsmål om muligheden for at rent faktisk udnytte farmakogenetiske tilgang til at identificere prædiktorer for gavn af BV. Vi mener, at fremtidige retninger i dette forskningsfelt nødvendigvis bør omfatte mere omfattende metoder, for at give et samlet overblik over hele genomet. En genom bred forening (GWAS) undersøgelse er i gang, for at vurdere sammenhængen af ​​genetiske profiler med kliniske resultater i en bred population af FRK patienter, der modtager upfront kemoterapi plus BV. Et bredt biostatistiske program er også planlagt for at gennemføre fortolkningen af ​​data, der kommer fra det store antal af undersøgte SNP’er i denne sonderende GWAS analyse. Især vil egnede statistiske værktøjer, såsom multifactor dimensionalitet reduktion (MDR) og klassificeringen og regression træ (CRT) analyser anvendes til præcist estimere og identificere gen-gen interaktioner som beskrevet tidligere [22] – [23]. To uafhængige kohorter af patienter randomiseret til at modtage eller ej antiangiogeniske vil tjene som validering sæt til at kontrollere den prædiktive effekt af identificerede profiler.

På trods af skuffende resultater rapporteret i dette område, er udfordringen at identificere prædiktorer for gavn af antiangiogene lægemidler udgør stadig et varmt emne, med stigende konsekvenser for klinisk praksis. Faktisk to fase III randomiserede forsøg, ML18147 [24] og BEBYP [25], har for nylig vist, at effekten af ​​at retsforfølge BV ud over sygdommens progression i FRK patienter, hvilket gør dette område endnu mere kompliceret. Disse resultater åbner vejen for nye spørgsmål om betydningen af ​​traditionel klinisk progression og dets biologiske mekanismer understreger samtidig behovet for biomarkører for erhvervet resistens til BV.

Støtte oplysninger

tabel S1.

Multivariable Cox regressionsmodeller for PFS og OS

doi:. 10,1371 /journal.pone.0066774.s001

(DOCX)