PLoS ONE: MicroRNA-545 Undertrykker Cell Proliferation ved Målretning cyclin D1 og CDK4 i Lung Cancer Cells

Abstrakt

Et stigende antal rapporter har vist, at forskellige microRNA’er er involveret i tumorigenese og tumor progression. Vi har udført denne undersøgelse for at identificere nye miRNA, der kan være involveret i lungekræft og undersøgelse af deres funktioner. Vi testede ekspressionen af ​​450 miRNA i lunge tumorvæv og tilstødende ikke-kræft væv. Vi fandt, at miRNA-545 var mindre rigelige i cancerøse lungevæv end i tilstødende ikke-kræft væv. Vore yderligere undersøgelser viste, at miR-545 undertrykte celledeling

in vitro

in vivo

. Vi fandt også, MIR-545 forårsagede cellecyklusstandsning ved G0 /G1-fasen og induceret celle apoptose i lungecancerceller ved at målrette cyclin D1 og CDK4 gener. Virkningerne af cyclin D1 og CDK4 nedreguleres af MIR-545 svarede til dem forårsaget af siRNA’er af cyclin D1 og CDK4, og overekspression af cyklin D1 og CDK4 kunne afskaffe MIR-545-induceret hæmning af celleproliferation. Afslutningsvis MIR-545 undertrykte celleproliferation ved at inhibere ekspressionen af ​​cyclin D1 og CDK4. Vores resultater giver ny viden om den rolle, miR-545 i udviklingen af ​​lungekræft og angive den potentielle anvendelse af miR-545 i cancerbehandling

Henvisning:. Du B, Wang Z, Zhang X, Feng S , Wang G, He J, et al. (2014) MicroRNA-545 Undertrykker Cell Proliferation ved Målretning cyclin D1 og CDK4 i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 9 (2): e88022. doi: 10,1371 /journal.pone.0088022

Redaktør: Liang-Hu Qu, Sun Yat-sen University, Kina

Modtaget: August 12, 2013; Accepteret: 2 januar 2014; Publiceret: 5 feb 2014

Copyright: © 2014 Du et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.870.535 og 90.913.017), kombinationen Projekt i Guangdong-provinsen og Undervisningsministeriet (nr 2009B090300080 og 2011B090400478), den indført Innovative R 0,05, fold forandring 0,5) i lungekræft væv sammenlignet med tilstødende ikke-kræft lungevæv (Fig . S1, tabel S1 og S2).

for at bekræfte ekspressionen af ​​miR-545, testede vi miR-545 udtryk i yderligere 10 patienter. Vi fandt, at miR-545 niveauer i lungekræft væv var mindre end 50% af dem i tilstødende ikke-kræft lungevæv i 14 af de 25 patienter, mens miR-545 niveauer i lungekræft væv var mere end dobbelt så høje som i tilstødende ikke- cancerøse lungevæv i 2 af de 25 patienter (fig. 1a). Analysen af ​​flere sæt af sammenlignelige cancerøse og tilstødende ikke-kræft lungevæv viste, at MIR-545 var mindre rigelige i lungekræft væv end i tilstødende ikke-cancervæv (fig. 1B). Dette antyder, at miR-545 blev underexpressed i lungetumorer og kan fungere som en tumor suppressor.

(a) Relativ miR-545-ekspression i 25 parrede lungekræft tumorvæv og tilstødende ikke-kræft væv. (B) Ekspression af MIR-545 i lungekræft væv sammenlignet med tilstødende ikke-kræft væv. 5S rRNA blev anvendt som en intern kontrol. Dataene blev analyseret under anvendelse af 2

-ΔΔCt metode. *, P. 0,05 (Wilcoxon test)

miR-545 Hæmmer Cell Proliferation in vitro og in vivo

At identificere miRNA, der kan være involveret i celledeling, vi brugte CCK-8 kit til at undersøge levedygtigheden af ​​A549-celler transficeret med hver af de 31 miRNA. Vi fandt, at A549-celler transficeret med MIR-545 havde den laveste cellelevedygtighed (fig. 2).

levedygtighed A549 celle blev målt ved CCK-8 ved 72 timer efter transfektion med hver miRNA. Dataene er præsenteret som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. NC, no-target kontrol; *, P 0,05; **, P. 0,01 (Students t-test)

For at bekræfte, at miR-545 kan undertrykke celleproliferation, vi udførte celleviabilitetstest med tre cellelinjer. A549 og H460-celler transficeret med MIR-545 efterligner udviste lavere cellelevedygtighed end dem transficeret med en no-target kontrol (figur 3A og 3B.); dog HFL1 lungefibroblaster transficeret med et MIR-545 inhibitor udviste en mere effektiv celleproliferation sammenlignet med dem transficeret med en kontrol-inhibitor (fig. 3C).

Transfektion med MIR-545 efterligner undertrykker levedygtighed (a ) A549-celler og (B) H460 celler. (C) transfektion med en miR-545-hæmmer øger levedygtighed HFL1 celler. (d) Tumor billeder fra den nøgne mus xenograft model. (e) Mængder og (f) vægte af tumorer i en nøgen mus xenograftmodel. Dataene er præsenteret som middelværdier ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P. 0,01 (Students t-test)

Vi næste brugt en tumor xenograft musemodel for at teste effekten af ​​miR-545 på tumor progression. A549-celler blev forbehandlet med MIR-545 efterligner eller en no-target kontrol og blev efterfølgende injiceret i athymiske nøgne mus. Tumorvolumenet i mus, der fik cellerne forbehandlet med MIR-545 efterligner var signifikant (P 0,05) mindre end hos mus, der modtog celler behandlet med en no-target kontrol. blev observeret Disse forskelle i volumen og vægt i tumorer høstet fra mus aflivet på dag 48 (fig. 3D, 3E, og 3F). Resultaterne viser, at MIR-545 signifikant kan inhibere lungekræft cellevækst i en nøgen mus xenograft model.

MIR-545 inducerer standsning af cellecyklus ved G0 /G1-fasen

An edu assay afslørede, at både A549 og H460-celler transficeret med mIR-545 efterligner indarbejdet mindre edu end dem transficeret med en no-target kontrol (fig. 4A-C). I modsætning hertil HFL1 celler transficeret med MIR-545 inhibitor inkorporeret mere edu end dem transficeret med kontrol inhibitor (fig. 4D). Disse resultater antyder, MIR-545 kan inhibere DNA-syntese. For yderligere at undersøge den reguleringsmekanisme (e) af miR-545, gennemførte vi en celle-cyklus assay. En højere andel af A549 og H460 transficeret med MIR-545 efterligner var i G0 /G1-fasen sammenlignet med dem transficeret med en no-target kontrol (fig. 4E og 4F). I modsætning hertil en mindre andel af HFL1 celler transficeret med en MIR-545-inhibitor var i G0 /G1-fasen sammenlignet med dem transficeret med en kontrol-anti-miRNA inhibitor (fig. 4G). Disse resultater viser, at MIR-545 anholdelser cellecyklussen i G0 /G1-fasen, således inhiberer DNA-syntese og celleproliferation. Desuden har vi fundet, at miR-545 induceret celle apoptose og død i A549 og H460 celler (Fig. 4H og 4I).

(a) Edu indbygning i A549 celler målt ved konfokal laser mikroskopi. Transfektion med MIR-545 inhiberer DNA-syntese i (b) A549-celler og (c) H460 celler. (D) Transfektion af HFL1 celler med MIR-545 inhibitor forøger DNA syntese. Transfektion med MIR-545 forøger procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen i (e) A549-celler og (f) H460 celler (g) Transfektion af HFL1 celler med MIR-545 reducerer procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen . MIR-545 inducerer apoptose i (H) A549 og (i) H460 celler. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. NC, no-target miRNA kontrol; *, P 0,05; **, P. 0,01 (Students t-test)

miR-545 Direkte Mål cyclin D1 og CDK4

Vi brugte Targetscan software til at forudsige de mulige mål for miR-545 . Blandt hundredvis af forudsagte mål, valgte vi CASP8AP2, DDX58, cyklin D1, MAF, CDK4 og PRKCE som de formodede mål, fordi de kan være involveret i cellecyklus eller apoptose. Vi klonede de 3’UTRs af disse gener i pmirGlo plasmidet og undersøgt, om MIR-545 kan undertrykke ekspressionen af ​​disse gener ved luciferase assay. Luciferase assay viste, at MIR-545 efterligner inhiberede aktiviteten af ​​to reporterkonstruktioner der indeholdt 3’UTR af enten cyclin D1 eller CDK4 (fig. 5A). Endvidere at teste, om cyclin D1 og CDK4 er direkte mål for MIR-545, muterede vi den forudsagte bindingssted af MIR-545 i 3’UTRs af begge gener. Vi fandt, at MIR-545 ikke inhibere aktiviteten af ​​reporterkonstruktioner der indeholdt de mutante 3’UTRs (fig. 5B).

(a) MIR-545 inhiberede aktiviteten af ​​luciferase indeholdende 3’UTR af cyclin D1 eller CDK4 genet. pmirGlo plasmider indeholdende vildtype (WT) 3’UTRs af CASP8AP2, DDX58, cyclin D1, MAF, CDK4, eller PRKCE genet blev co-transficeret ind i A549-celler med kontrol- miRNA eller MIR-545. Luciferaseaktivitet blev målt 48 timer efter transfektion. Den normaliserede forhold af luciferaseaktivitet blev beregnet som (Rluc

miR-545 /Luc

miR-545) /(Rluc

NC /Luc

NC). (B) MIR-545 inhiberede ikke aktiviteten af ​​luciferase konstruktioner indeholdende det muterede (Mut) 3’UTR af cyclin D1 eller CDK4 genet. (C) Den overflod af cyclin D1 og CDK4 proteiner blev analyseret i A549, H460, og HFL1 celler ved western blotting efter transfektion behandlinger. (D) Niveauer af cyclin D1 og CDK4 proteiner blev kvantificeret ved anvendelse ImageJ software. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Dataene er præsenteret som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 (Students t-test)

Vi undersøgte også udtryk for den endogene cyclin D1 og CDK4 gener på både mRNA og protein niveauer.. Vi fandt, at miR-545 reducerede niveauet af CDK4 mRNA i A549 celler, men ikke påvirke niveauet for cyklin D1 mRNA (fig. S2). observerede imidlertid, at A549 og H460-celler transficeret med MIR-545 havde lavere niveauer af både cyclin D1 og CDK4 proteiner end dem transficeret med en no-target kontrol (fig. 5C og 5D). Desuden HFL1 celler transficeret med miR-545 inhibitor havde højere niveauer af både cyclin D1 og CDK4 proteiner end dem transficeret med NC-hæmmere (fig. 5C og 5D).

miR-545 Undertrykker Tumor Proliferation ved Målretning cyclin D1 og CDK4

for at undersøge om miR-545 hæmmer cellernes levedygtighed ved at målrette cyklin D1 og CDK4, vi brugte siRNAs til at hæmme ekspression af cyclin D1 og CDK4 gener; resultaterne var de samme som beskrevet ovenfor for MIR-545. For eksempel kan anvendelsen af ​​siRNA’er stilhed enten cyclin D1 eller CDK4 reducerede levedygtigheden af ​​A549-celler (fig. 6A). SiRNA-medieret suppression af cyclin D1 og CDK4 gener forårsaget cellecyklusstandsning ved G0 /G1-fasen (fig. 6B), inhiberede edu inkorporering (fig. 6C og 6D) og induceret apoptose i A549-celler (fig. 6E). Endvidere kunne overekspression af cyclin D1 og /eller CDK4 gener væsentligt ophæve MIR-545-induceret hæmning af A549 cellevækst (fig. 6F). Tilsammen disse resultater viser, at cyclin D1 og CDK4 gener er direkte mål for miR-545.

(a) miR-545 efterligner og siRNA’erne hæmmede A549 cellelevedygtighed på 72 timer efter transfektion. (B) celle-cyklus standset ved G0 /G1-fasen efter transfektion af A549-celler med MIR-545 og siRNA’er målretning cyclin D1 og CDK4. MIR-545 og siRNA induceret hæmning af DNA-syntese som bestemt ved edu inkorporering assay under anvendelse af (c) konfokal laser mikroskopi og (d) flowcytometri. (E) underekspression af cyclin D1 og CDK4 inducerer celle apoptose i A549-celler. (F) Overekspression af cyklin D1 og CDK4 ophæver inhiberingen forårsaget af MIR-545. Dataene er præsenteret som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001. Students t-test blev anvendt til (a) – (e); envejs ANOVA blev anvendt til (f).

Diskussion

Vores undersøgelse viser, at MIR-545 underexpressed i lunge cancertumorer, og MIR-545 er blevet rapporteret at være underexpressed i gastrisk karcinom [23]. Desuden miR-545 hæmmer spredning af lunge kræftceller både

in vitro

in vivo

. Disse resultater indikerer miR-545 kan fungere som en tumor suppressor i lungekræft.

Yderligere undersøgelse afslører, at cyclin D1 og CDK4 gener er direkte mål for miR-545. miR-545 hæmmer cyclin D1 og CDK4 genekspression ved at anerkende sekvenser i deres 3’UTRs. Endvidere kan overekspression af cyklin D1 og CDK4 afskaffe inhibering af proliferation forårsaget af MIR-545 efterligner. Disse data antyder, at MIR-545 inhiberer celleproliferation ved direkte målretning cyclin D1 og CDK4. Tidligere undersøgelser rapporterer, at ekspressionen af ​​cyclin D1 og CDK4 i humane lungecancer væv er væsentligt højere end i normale lungevæv [7], [8]. Vores resultater viser, at overekspression af cyklin D1 og CDK4 i lungekræft væv delvis kan skyldes den underekspression af MIR-545.

konkluderes, at de miRNA resultater viser, at MIR-545 er mindre rigelige i human lungecancer væv end i tilstødende ikke-kræft lungevæv. MIR-545 inhiberer proliferationen af ​​lungecancerceller ved at undertrykke ekspressionen af ​​cyclin D1 og CDK4 gener. En forbedret forståelse af miR-545 dysregulering i lunge kræftceller bidrager til vores forståelse af de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for lungekræft. Desuden kan miR-545 være et potentielt mål for lungekræft terapeutisk behandling.

Materialer og metoder

Etik Statement

Vi opnåede skriftligt informeret samtykke fra alle patienter, og alle protokoller blev godkendt af Institutional Review Board af First Affiliated Hospital i Guangzhou Medical College. Alle menneskelige materialer blev anvendt i overensstemmelse med den politik, Institutional Review Board. Forslaget Dyret Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Guangzhou Institutes of biomedicin og sundhed (IACUC 2.012.010). Alle eksperimentelle procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med den vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev udført i overensstemmelse med de institutionelle etiske retningslinjer for dyreforsøg.

cellelinier

Den menneskelige lunge cancer cellelinjer A549 (ATCC) og NCI-H460 (H460, ATCC) blev opnået fra Dr. Duanqing Pei Lab på Guangzhou Institutes of biomedicin og sundhed og blev dyrket i RPMI-1640-medium (1640, GIBCO, NY, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Hyclone, UT, USA). Den normale lunge fibroblast cellelinje HFL1 blev købt fra det kinesiske videnskabsakademi Cell Bank of Type Culture Collection (CBTCCCAS, Shanghai, Kina) og blev dyrket i F-12K medium (Jinuo, Hangzhou, Kina) suppleret med 10% FBS. Alle celler blev dyrket i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C.

væv prøver fra lungekræftpatienter

Både kræft og tilstødende ikke-kræft lunge vævsprøver blev opnået fra Guangzhou Institute of Respiratory Disease, der er forbundet med First Affiliated Hospital i Guangzhou Medical University (Guangzhou, Kina). Kirurgisk fjernet prøver blev opbevaret i flydende nitrogen indtil anvendelse. De relevante karakteristika for de undersøgte emner er vist i tabel S3.

transfektion

Alle siRNA’erne, miRNA efterligner og miRNA-hæmmere blev købt fra Guangzhou RiboBio (RiboBio, Guangzhou, Kina) og transficeret ind celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) som anbefalet af producenten. Celler blev transficeret med miRNA efterligner og inhibitorer i en koncentration på 50 nM. Sekvenserne af siRNA’er er som følger: si-cyclin D1 sense, 5′-UGG AAU AGC UUC UGG AAU UdTdT-3 ‘, antisense, 3′-dTdAA CCU UAU CGA AGA CCU UAA-5′; si-CDK4 forstand, 5’-CAG CCG AAA CGA UCA AGG AdTdT-3 ‘, antisense, 3′-dTdTG UCG GCU UUG CUA GUU CCU-5’.

Cell Proliferation Assay

celleproliferation blev målt ved anvendelse celle Counting Kit 8 reagens (CCK-8, DOJINDO, Kyushu, Japan) eller CellTiter-Glo (Promega, WI, USA) ifølge producentens anvisninger.

edu celleproliferationsassay

Inkorporering af thymidinanalogen 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (edu) i DNA under DNA-replikation, kan anvendes til at måle celler undergår DNA-replikation. Procentdelen af ​​celler, der inkorporerer Edu blev evalueret ved brug af Cell-Light Edu imaging afsløre kit efter producentens anvisninger (RiboBio, Guangzhou, Kina).

Cell Cycle Assay

Celler blev høstet 72 timer efter transfektion og fast natten over i 70% iskold ethanol. Efter fiksering blev cellerne behandlet med 500 ng /pl RNase A i 30 minutter og efterfølgende farvet med 50 ng /pl af propidiumiodid (PI) i 20 min. Cellerne blev kvantificeret ved hjælp af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS, BD, NJ, USA), og dataene blev analyseret ved FlowJo software (Tree stjerne, OR, USA).

Cell Apoptose Assay

Cell apoptose analyse blev udført med PE Annexin V apoptose Detektion Kit i (BD, NJ, USA) ifølge producentens protokol, og cellerne blev analyseret ved anvendelse af FACS (BD, NJ, USA).

RNA ekstraktion og QRT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra cellelinjer og vævsprøver ved hjælp af Trizol-reagens (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Syntese af cDNA ved hjælp af M-MLV revers transkriptase (Promega, WI, USA) blev udført som foreslået af producenten, og vilkårlige primere (Takara, Shiga, Japan) blev anvendt til mRNA. De QRT-PCR assays blev udført ved anvendelse af SYBR Green RealMasterMix kit (Tiangen, Beijing, Kina) ifølge producentens instruktioner. Reverse Transcription og QRT-PCR for miRNA blev udført ved hjælp af Bulge-Loop miRNA QRT-PCR Primer Set (RiboBio, Guangzhou, Kina). Dataanalyse blev udført ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode [24]. De følgende primere blev anvendt til analysen: cyclin D1 fremadrettet primer, 5′-CAA ATG GAG CTG CTC CTG GTG-3 ‘, revers primer, 5′-CTT CGA TCT GCT CCT GGC AGG-3′; CDK4 fremadrettet primer, 5’-TGC CAA TTG CAT CGT TCA CCG AG-3 ‘, revers primer, 5′-TGC CCA ACT GGT CGG CTT CA-3′; actin fremadrettet primer, 5’-CTC CAT CCT GGC CTC GCT GT-3 ‘, revers primer, 5′-GCT GTC ACC TTC ACC GTT CC-3′; og 5S rRNA fremadrettet primer, 5’-ACG GCC ATA CCA CCC TGA AC-3 ‘, revers primer, 5′-GGC GGT CTC CCA TCC AAG TA-3’.

Plasmidkonstruktion

de 3’UTRs af cyclin D1 og CDK4 gener blev klonet i pmirGlo plasmidet (Promega, WI, USA) mellem

Xho

i og

Xba

i websteder ved hjælp af følgende primere: cyclin D1 vildtype 3’UTR fremadrettet primer, 5′-ATA TCT CGA GCA GGT GCT CCC CTG ACA GTC CCT-3 ‘, revers primer, 5′-TAA TCT AGA TGG AAA CAT GCC GGT TAC ATG TTG GT-3′; CDK4 vildtype 3’UTR fremadrettet primer, 5’-ATA TCT CGA GGC AAT GGA GTG GCT GCC ATG GAA-3 ‘, revers primer, 5′-TAA TCT AGA TTG ACA CAG AGT CTT GCT CTG TTG CCC A-3’ .

pmirGlo plasmider indeholdende muterede cyklin D1 eller CDK4 3’UTR blev konstrueret ved hjælp af KOD-plus mutagenese kit (Toyobo, Osaka, Japan) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

den åbne læsning ramme ekspressionsvektorer pReceiver_M02_cyclin D1, pReceiver_M02_CDK4, og kontrol- vektor pReceiver_M02 blev købt fra FulenGen Corporation (GeneCopoeia, MD, USA). Alle indsatte eller muterede sekvenser blev bekræftet ved sekventering.

Dual-luciferase assay

Celler blev podet i 96-brønds plader 1 dag før transfektion. MiRNA efterligner (50 nm), og plasmid (5 ng /pl) blev co-transficeret ind A549-celler. Ved 48 timer efter transfektion, blev luciferaseaktivitet målt ved anvendelse af Dual-Glo luciferase (Promega, WI, USA) ifølge producentens anvisninger.

Western Blotting

Celler blev høstet og resuspenderet i SDS puffer (Beyotime, Shanghai, Kina) til fremstilling af de samlede proteinekstrakter. Kort beskrevet blev totalt proteinekstrakt adskilt af 12% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese og overført til en Immobilon-P transfer polyvinylidenfluoridmembran (Millipore, MA, USA). Membranen blev inkuberet ved stuetemperatur i 5% bovint serumalbumin (BSA) fremstillet med TBS-T puffer i 2 timer. Membranen blev inkuberet med primært antistof fortyndet 1:1,000 med 1% BSA ved 4 ° C natten over. Den følgende dag blev membranen inkuberet med sekundært peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret antistof fortyndet 1:5,000 med 1% BSA ved 4 ° C i 6 timer. Membranen blev visualiseret efter inkubation i HRP substrat (BeyoECL plus A /B, Beyotime, Shanghai, Kina). Antistofferne anvendt i denne undersøgelse var anti-cyclin D1 (sc-8396, Santa Cruz, CA, USA), anti-CDK4 (sc-260, Santa Cruz, CA, USA), anti-β-actin (A2066, Sigma, MO, USA), HRP-konjugeret anti-muse-IgG (sc-2005 Santa Cruz, CA, USA), og HRP-konjugeret anti-kanin IgG (sc-2004 Santa Cruz, CA, USA).

tumorxenografter

6 timer efter transfektion af mIR-545 efterligner eller kontrollere miRNA blev A549-celler høstet og suspenderet i phosphatbufret saltvand ved en koncentration på 1 x 10

6 celler /ml og injiceret i hver side af den bageste flanke af samme BALB /c athymiske nøgne mus (5-6 uger gamle) med 100 pi cellesuspension. Tumorvækst blev målt hver 4. dag. Tumorvolumen (V) blev overvåget ved måling af længden (L) og bredde (W) af tumoren med passere og blev beregnet ved anvendelse af formlen V = (L × B

2) /2 [25].

Statistisk Analyse

data præsenteres som gennemsnit ± standardafvigelse (SD). P 0,05 blev betragtet som signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af SPSS 16.0 software (Chicago, IL). Students t-test blev anvendt til at analysere signifikans mellem to grupper. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at teste betydningen blandt mere end to grupper. Analysen af ​​miRNA udtryk i klinisk prøve blev udført ved hjælp af Wilcoxon-testen.

Støtte Information

Figur S1.

Mirna udtryk i lungekræft væv og tilstødende ikke-kræft væv. Udtrykkene af miRNA måles med QRT-PCR. 5S rRNA blev anvendt som en intern kontrol. Den Heatmap repræsenterer overekspression (rød) og underekspression (grøn) af miRNA. Manglende data er repræsenteret med grå farve

doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s001

(TIF)

Figur S2.

Cyclin D1 og CDK4 mRNA’er blev målt ved QRT-PCR. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001 (Students t-test)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s002

(TIF)

tabel S1. .

Udtryk for miRNA i lungekræft væv og ikke-kræft lungevæv

doi: 10,1371 /journal.pone.0088022.s003

(DOC)

tabel S2.

Relativ udtryk for 450 miRNA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s004

(XLS)

tabel S3.

karakteristika patienter kliniske lungecancer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0088022.s005

(DOC)

Tak

Vi er taknemmelige for Dr. Pei Duaquing for gaven af ​​A549 og H460 cellelinjer.