PLoS ONE: TIMP-1 Fremmer Ophobning af cancer associeret fibroblaster og Kræft Progression

Abstrakt

Behandlingsmuligheder for sent tidspunkt prostatakræft og tyktarmskræft er begrænsede, og der er et presserende behov for at udvikle mere effektive og målrettede nye behandlingsformer , der starter med identifikation og validering af nye terapeutiske mål. Nylige kliniske undersøgelser har vist, at væv inhibitor matrixmetalloproteinase-1 (TIMP-1) niveauer er forhøjede i kræftpatient plasma og forhøjede TIMP-1 niveauer er forbundet med dårligere kliniske resultater. Det er imidlertid uvist, om TIMP-1 tjener blot som en biomarkør for cancer progression eller har en funktionel rolle i at fremme udviklingen af ​​kræft og kan tjene som en cancer terapeutisk mål, som er den vigtigste formål med denne undersøgelse. Her viser vi, at stroma af human prostata- og tyktarmskræft udtrykker højere niveauer af TIMP-1 i forhold til deres normale modparter og forøget ekspression af TIMP-1 fremmer

in vivo

vækst af begge typer cancer. Vi viser for første gang, at øget TIMP-1-ekspression stimulerer akkumulering af cancer associeret fibroblaster (CAFS) inden prostata og tyktarmskræft væv, og at TIMP-1 øger prostata CAF proliferation og migration

in vitro

og fremmer ERK1 /2 kinase aktivering i disse CAF celler. Vores resultater etablere de hidtil ukendte fremmende virkninger af TIMP-1 på cancer progression og om akkumulering af CAF, som igen giver en pro-tumormikromiljøet. Tilsammen udgør disse resultater etablere potentialet i TIMP-1 som en ny mål for kræftbehandling og mekanismen bag den pro-tumor aktivitet af TIMP-1

Henvisning:. Gong Y, Scott E, Lu R, Xu Y, Oh WK, Yu Q (2013) TIMP-1 Fremmer Ophobning af cancer associeret fibroblaster og Cancer Progression. PLoS ONE 8 (10): e77366. doi: 10,1371 /journal.pone.0077366

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: Marts 24, 2013; Accepteret: September 2, 2013; Udgivet: 15 oktober 2013

Copyright: © 2013 Gong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en USA Army Medical Research (Department of Defense) tilskud, W81XWH-10-1-0321. De finansieringskilder har ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prognose for metastatisk kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) forbliver fattige med en median overlevelse på mindre end 2 år. Behandlingsmuligheder for det sene stadie prostatakræft er begrænsede, og der er et presserende behov for at udvikle mere effektive og målrettede nye behandlingsformer [1-5]. Under cancer progression, er det vigtigt, at cancerceller korrekt interagere med og held ændre deres omgivende vært mikromiljø. Kræftceller interagerer med deres mikromiljø gennem celle-overflade adhæsionsreceptorer og receptorerne for den ekstracellulære matrix (ECM) og ændre deres omgivelser hovedsagelig gennem aktiviteter matrixmetalloproteinaser (MMP’er). MMP spiller nøgleroller i nedværdigende ECM og bioaktiviteter af MMP’er er reguleret af væv hæmmere af metalloproteinaser (TIMP’er) [6]. Der er fire medlemmer af TIMP familien, vævsinhibitor matrixmetalloproteinase-1 (TIMP-1), -2, -3 og -4. TIMP’er kan hæmme aktiviteterne i alle MMP’er men med varierende effektivitet mod forskellige MMP’er. MMP’er spiller vigtige roller i formidling tumor og progression og de er etableret terapeutiske mål for en række cancertyper [6-8]. Tidligere undersøgelser indikerede, at TIMP’er herunder TIMP-1 display anti-cancer aktiviteter [9-13]; Men de seneste undersøgelser har vist en paradoksal pro-tumor effekt af TIMP-1 [6,14-16]. TIMP’er kan påvirke kræft progression i en MMP-afhængig og MMP-uafhængig måde, selvom den underliggende mekanisme af sidstnævnte ikke er godt forstået [17,18].

Mange bredspektrede MMP inhibitorer (MMPIs) udviklet af farmaceutiske virksomheder blev testet i prospektive kliniske forsøg, og resultaterne har været jævnt skuffende. Ingen endelig mekanistisk forståelse for en sådan fejl er blevet etableret. Det er imidlertid sandsynligt skyldtes en manglende forståelse af de forskellige bioaktiviteter og funktioner i forskellige MMP’er, som siden er blevet værdsat bedre for deres pro- og /eller anti-tumor aktiviteter [6,19-22]. Disse skuffende resultater understreger også vigtigheden af ​​en bedre forståelse af biologi kræft terapeutiske mål forud for udførelsen af ​​kliniske forsøg. For nylig har en række kliniske studier vist, at TIMP-1-niveauer i kræft patient plasma og kræft væv er meget forhøjet, og de forhøjede TIMP-1-niveauer er forbundet med dårligere kliniske resultater i mange cancertyper, herunder prostata og tyktarmskræft [23-34]. Det er dog uklart, om TIMP-1 tjener blot som en biomarkør for cancer progression eller funktioner til at fremme udviklingen af ​​kræft samt; og dermed kunne tjene som en vigtig kræft terapeutisk target. Dette spørgsmål er behandlet af denne undersøgelse.

Her viser vi, at stroma af menneskelig prostata- og tyktarmskræft udtrykker højere niveauer af TIMP-1 i forhold til deres normale modparter, og at øget ekspression af TIMP-1 fremmer

in vivo

væksten af ​​både kræft typer. Desuden viser vi, at TIMP-1 øger prostata CAF proliferation og migration

in vitro

mens knockdown af TIMP-1 hæmmer prostata CAF proliferation og migration. Desuden TIMP-1 fremmer aktiveringen af ​​ERK1 /2-kinase i disse CAF. Vi viser også, at øget ekspression af TIMP-1 stimulerer akkumulering af cancer associeret fibroblaster (CAF) i prostata /coloncancer væv. Sammen vores resultater etablere de hidtil ukendte fremmende virkninger af TIMP-1 på cancer progression og CAF akkumulering, potentiale TIMP-1 som en ny cancer terapeutisk mål, og den mekanisme, der ligger virkningerne TIMP-1.

Materialer og metoder

Patient Cancer Prøver, Celler, og reagenser

Humane prostata og tyktarmskræft prøver blev opnået fra Cooperative humant væv Network (CHTN) ved University of Pennsylvania og Ohio State University. Primær prostatacancer associerede fibroblaster (PCAFs) blev opnået fra Asterand USA (Detroit) og dyrket i henhold til producentens anvisninger. Humane prostata fibroblaster var fra ScienCell (HPRF, Carlsbad) og dyrket i fibroblast Medium (FM, ScienCell). PC3, PC3 /M, DU145, 22RV1, LNCaP, VCap, RWPE-1 og WPE1-NB26-65 humane prostatacancerceller og HCT116 og humane HT-29 coloncancer-celler var fra NCI (DTP, DCTD Tumor Repository) og ATCC (Manassas) og opretholdt efter udbydernes anbefalinger. Human prostatacancer LAPC-4-celler blev opnået fra ATCC Patent Depository.

Anti-v5 epitop (Invitrogen), -TIMP-1, -Alpha glatmuskelactin (R 0,05

Resultater

Serum TIMP-1-niveauer er forhøjede i prostata cancer patienter sammenlignet med mænd uden kræft

Serum TIMP-1 er blevet rapporteret at være forhøjede i bryst-, mave-, coloncancer og flere andre kræftformer. I denne undersøgelse sammenlignede vi serum TIMP-1-niveauer i 140 patienter med prostatacancer i forskellige sygdomstilstande stadier og 16 hanner uden kendt tegn på prostatacancer inklusive patienter med benign prostatahyperplasi ved sandwich-ELISA. Vores resultater viste, at prostatakræft patienter havde en gennemsnitlig serum TIMP-1 koncentration på 351,4 ng /ml, hvilket er betydeligt højere end den gennemsnitlige koncentration af 211,0 ng /ml ses hos mænd uden prostatacancer rekrutteret fra en urologi klinik (

p

0,001) (figur 1A).

A. Serum TIMP-1 var signifikant forhøjet hos patienter med prostatacancer (

s

0,001) som målt ved sandwich-ELISA (R PSA på 5,6). 1070717A: prostataadenocarcinom væv fra en 53 år gammel WM (Gleason score på 4 + 3 = 7; PSA af 8,03). Bar, 100 pm. C-D. TIMP-1-ekspression blev forhøjet i mere aggressive prostata cancer cellelinjer. TIMP-1-mRNA (C) og protein (D) ekspression i forskellige prostatacancercellelinjer blev målt ved real-time qPCR (C) og sandwich-ELISA (D), henholdsvis. TIMP-1 mRNA blev normaliseret til beta-actin i en duplex qPCR. TIMP-1-protein i konditionerede medier fra de angivne cellelinjer blev målt ved TIMP-1 ELISA DuoSet (R 0,05. C-E. Vækstrater for de subkutane prostata tumorer afledt af PC3 (C), 22RV1 (D), og LAPC-4 (E) celler, der udtrykker TIMP-1V5 eller transduceret med den tomme ekspressionsvektor (kontrol) som angivet i panelerne. Vækstraterne er udtrykt som middelværdien af ​​tumor volumen (mm

3) +/- SD. Seks mus blev anvendt for hver type af transducerede prostataceller.

*

s

0,05.

TIMP-1 fremmer ophobning af kræft-associerede fibroblaster (CAF) in vivo

For at få indsigt i potentiel mekanisme ligger til grund for pro-vækst effekt af TIMP-1 i prostatakræft udførte vi immunhistokemi (IHC) analyser af tumorsektioner fremstillet af disse

in vivo Salg eksperimenter og observerede, at tumorsnit afledt af prostatacancerceller med forøget ekspression af TIMP-1 display forøget mængde af CAF (figur 3-top og midterste paneler). CAFS blev påvist ved anvendelse af anti-a-glatmuskelactin (SMA) antistof, som anvendes rutinemæssigt til at fremhæve CAF [40-42]. Det er blevet veletableret, at CAF spiller en vigtig rolle i at fremme udviklingen af ​​kræft og mediere terapeutisk modstand [43,44], og at CAF er forbundet med øget risiko for tumor invasion og metastase [45-47].

Tumoren snit blev afledt af PC3 /22RV1-kontrolceller og PC3 /22RV1-TIMP-1-celler. Snittene blev farvet med H 0,05

For at bekræfte effekten af ​​TIMP-1 på CAF, vi udførte lignende IHC analyser på tumor sektioner afledt af

in vivo

undersøgelser af HCT116 tyktarmskræft med eller uden forøget ekspression af TIMP-1. Vi fandt, at sammenligne til tumorer afledt fra HCT116-kontrolceller (Figur S2A-C), forøget ekspression af TIMP-1 (HCT116-TIMP-1) fremmer akkumulering af kolon CAF inden for tumorer (Figur S2D-F). Samlet set viser disse resultater giver første understøtning for en hidtil ukendt rolle af TIMP-1 i reguleringen af ​​CAF infiltration og /eller ekspansion.

TIMP-1 fremmer prostata CAF celleproliferation og migration og aktiverer Erk1 /2 kinaser

For at afsløre den cellulære mekanisme, hvormed TIMP-1 fremmer CAF ophobning og kræft progression

in vivo

, vi først vurderet virkningerne af de konditionerede medier (CM) afledt af 22RV1-kontrol og 22RV1-TIMP-1 celler på prostata CAF proliferation og migration. Vi fandt, at CM afledt fra 22RV1-TIMP-1-celler mere effektivt fremmes prostatacancer proliferation og transwell migration i forhold til CM afledt fra 22RV1-kontrolceller (Figur S3). For yderligere at bestemme, om renset TIMP-1 kan udøve lignende virkninger på prostata CAF, vi udførte yderligere eksperimenter med oprenset humant TIMP-1. Vi fandt, at TIMP-1 fremmes signifikant proliferation af prostata CAF med undtagelse af den prostatacancerceller (figur 6 AC), og at TIMP-1 signifikant forøget motilitet af disse CAF (figur 6D), hvilket antyder, at TIMP-1-medieret akkumulering af prostata CAF er sandsynligvis et resultat af både forbedret infiltration og udvidelse af prostata CAF inden for tumorer.

A-C. Prostata CAF eller prostatacancerceller blev podet ved 2 x 10

3 celler /brønd i 96-brønds plader i tre eksemplarer. Prostatacancercelle og prostata CAF proliferationsassays udførtes hver dag under anvendelse af et sæt af plader med 96 brønde under anvendelse af Premix WST1 kit (Takara) ved at følge fabrikantens instruktion.

*

s

0,05. D. Prostata CAF blev vurderet for deres motilitet tværs transwell barriere i løbet af 30 timer i nærvær eller fravær af 250 ng /ml TIMP-1. 0,5 x 10

6 celler /ml prostata CAF blev placeret i de øverste kamre i Transwell indstik (Costar) i tre eksemplarer. Repræsentative billeder af prostata CAF celler migreret gennem transwell inserts er vist. Prostata CAF migreret gennem transwell indsætter i 20 tilfældigt udvalgte 200 x mikroskopiske felter blev talt.

*

s

0,05. A-D, viser resultaterne repræsentative gennemsnitlig +/- SD’er af triplikater for en af ​​to uafhængige forsøg.

For yderligere at bekræfte effekterne TIMP-1 på prostata CAF, vi bankede ned TIMP-1-ekspression i prostata CAF (figur 7A) ved hjælp af to forskellige shRNAs (Open Biosystems). Vi fandt, at TIMP-1 knockdown inhiberer prostata CAF proliferation og migration signifikant (figur 7B-C), hvilket antyder, at TIMP-1 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​CAF adfærd, hvilket igen modulerende cancer progression. Dette blev yderligere understøttet af vores fund, at prostata CAF men ikke prostatacancerceller udtrykker et højere niveau af TIMP-1-receptoren, tetraspanin CD63. CD63 er et glycosyleret membranprotein udviser heterogen molekylvægt (figur 8A). TIMP-1 viste sig at aktivere pro-overlevelse signalering ved binding til CD63 /integrin beta1 kompleks i bryst epiteliale celler [49,50]. Vi fandt, at TIMP-1 øger ERK1 /2-aktivitet af serum sultet prostata CAF men ikke prostatacancerceller (figur 8B-C), hvilket antyder, at

in vivo Salg virkninger af TIMP-1 på prostatacancerceller kan være udøves gennem påvirker prostata CAF indirekte (figur 9).

A. Relative niveauer af TIMP-1 i prostata CAF inficeret med ikke-målretning shRNAs eller shRNAs mod TIMP-1 blev vurderet ved ELISA, og resultaterne viste, at to TIMP-1 shRNAs slået ned TIMP-1-ekspression med ~ 70% og ~ 50%, henholdsvis. B. Prostata CAF blev podet med 4 x 10

3 celler /brønd i 96-brønds plader in triplo og prostata CAF proliferationsassays udførtes hver dag under anvendelse af et sæt af plader med 96 brønde under anvendelse af Premix WST1 kit (Takara).

*

s

0,05. C. Prostata CAF blev vurderet for deres motilitet tværs transwell barriere i løbet af 30 timer i nærvær eller fravær af 250 ng /ml TIMP-1. 1 x 10

6 celler /ml prostata CAF blev placeret i de øverste kamre i Transwell indstik (Costar) i tre eksemplarer. Prostata CAF migreret gennem Transwell i 20 tilfældigt udvalgte 200 x mikroskopiske felter blev talt.

*

s

0,05.

A. Ekspression af CD63-protein i forskellige humane prostatakræft-cellelinier, humane prostata fibroblaster (HPRF) og human prostata CAF (PCAFs) blev bestemt ved western blotting under anvendelse af anti-CD63-antistof, som genkender heterogen glycosyleret CD63 protein. Actin blev anvendt som en kontrol for protein loading (nederste panel). B-C. Serum-udsultede prostata CAF-celler (B) og 22RV1 prostatacancerceller (C) blev leveret med serumfrit medium (SFM) eller SFM indeholdende 250 ng /ml TIMP-1 i 3 og 12 timer. Cellerne blev lyseret, og proteiner blev analyseret ved Western blotting ved anvendelse af anti-phospho-ERK1 /2 eller anti-phospho-AKT antistoffer (øvre paneler) eller anti-ERK1 /2 eller anti-AKT antistoffer (nederste paneler).

: Forøget ekspression af TIMP-1 af tumorceller og CAF fører til forøget CAF proliferation og migrering gennem binding af TIMP-1 til TIMP-1-receptoren, CD63 udtrykt på CAF, hvilket fører til akkumulering af CAF inden kræft væv.