PLoS ONE: Reduktion af Orc6 Expression sensibiliserer Humane Colon Cancer Cells til 5-fluoruracil og Cisplatin

Abstrakt

Tidligere undersøgelser fra vores gruppe har vist, at ekspressionsniveauerne af Orc6 var stærkt forhøjet i kolorektale kræft patientprøver og induktion af Orc6 var forbundet med 5-fluorouracil (5-FU) behandling. Målet med denne undersøgelse var at undersøge den molekylære og cellulære virkninger af Orc6 i tyktarmskræft. I denne undersøgelse, bruger vi HCT116 (wt-p53) og HCT116 (null-p53) tyktarmskræft cellelinjer som modelsystem til at undersøge virkningen af ​​Orc6 på celleproliferation, kemosensitivitet og involverede veje med Orc6. Vi viste, at nedreguleringen af ​​Orc6 sensibiliserer colon cancerceller for både 5-FU og cisplatin (cis-pt) behandling. Nedsat Orc6 ekspression i HCT-116 (wt-p53) celler ved RNA-interferens udløst cellecyklusstandsning ved G1-fasen. Langvarig inhibering af Orc6 ekspression resulterede i flerkernede celler i HCT-116 (wt-p53) cellelinie. Western immunoblot-analyse viste, at nedregulering af Orc6 induceret p21 ekspression i HCT-116 (wt-p53) celler. Induktionen af ​​p21 blev medieret af forøget niveau af phosphoryleret p53 ved Ser-15. Derimod er der ingen forhøjet ekspression af p21 i HCT-116 (null-p53) celler. Orc6 nedregulering også øget ekspression af DNA-ødelæggende reparation protein GADD45β og reduceret ekspressionsniveauet af JNK1. Orc6 kan være en potentiel roman mål for fremtidig anti cancer terapeutisk udvikling i tyktarmskræft

Henvisning:. Gavin EJ, Song B, Wang Y, Xi Y, Ju J (2008) Reduktion af Orc6 Expression sensibiliserer human tyktarmskræft celler til 5-fluoruracil og cisplatin. PLoS ONE 3 (12): E4054. doi: 10,1371 /journal.pone.0004054

Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: November 26, 2008; Accepteret: December 1, 2008; Udgivet: December 29, 2008

Copyright: © 2008 Gavin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Mitchell Cancer Institute kræft genomics laboratorium opstart fond til (J. Ju) og NIH CA114043 (J. Ju). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Orc6 er en af ​​de seks oprindelse anerkendelse kompleks protein i humane celler. Den fungerer som den første montering platform, som er nødvendig for DNA-replikation. Roller Orc6 i DNA-replikation er blevet undersøgt i udstrakt grad i både gær og Drosophila [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Men der er begrænsede oplysninger om human cancer [7], [8]. Det er blevet rapporteret, at ud over dens funktion som en DNA-replikation initiator protein, det også spiller en central rolle i transkriptionel gendæmpning og heterokromatin formation [8]. Det er dog ikke klart under indledningen kompleks samling, hvor trin at Orc6 deltager [9]. Det er blevet påvist elegant af Prasanth

et al.

Dynamikken i Orc6 lokalisering under hele cellecyklus, herunder DNA-replikation, kromosom regregation, og cytokinese. De foreslår også Orc6 kan fungere i signalering til kontrol cellecyklus [8]. Vores interesse i Orc6 stammede fra vores tidligere undersøgelser med et omfattende genomik analyse afslørede, at Orc6 er forbundet med 5-FU associeret resistens i humane coloncancer-cellelinjer [10]. Vores opfølgning forsøg med kolorektale patientprøver yderligere bekræftet, at ekspressionen af ​​Orc6 er stærkt forhøjet i humane kolorektale tumorvæv sammenlignet med parrede normale prøver [11]. Disse resultater bekræftede den kliniske relevans af Orc6 fører til vores hypotese, at Orc6 kan være en central aktør, der er involveret i kolorektal cancer. Dens forhøjet niveau kan også være en væsentlig bidragsyder til kemoresistens. p53 er en af ​​de hyppigst ændrede tumorsuppressorer i kolorektal cancer og på grund af sin kritiske funktion i cyklus kontrol [12], [13]. I denne undersøgelse, bruger vi et par tyktarmskræft cellelinjer med enten vildtype p53 eller null p53 som vores model system.

I denne undersøgelse giver vi eksperimentelle beviser for, at faldende Orc6 udtryk ved RNA-interferens kan bevidstgøre kolon cancercellelinier til to af de store kemoterapeutiske midler 5-FU og cisplatin behandling. Faldende Orc6 ekspression ved siRNA knock-down udløst cellecyklusstandsning og nedsat cellulær proliferation i HCT-116 (wt-p53) celler. Derimod blev denne effekt væsentligt forringet i HCT-116 (null-p53) celler. Ændring af cellecyklus kontrol ved nedsat Orc6 ekspression skyldtes induktionen af ​​p21, en større cellecykluskontrol gen. Induktionen af ​​p21 skyldtes den forøgede niveauet af phosphorylatd af p53 ved Ser-15 udløst af knock-down af Orc6 ekspression. Orc6 kan være en potentiel roman mål for nye anti tumor terapeutisk udvikling.

Resultater og Diskussion

Faldende Orc6 udtryk i HCT-116 (vægt-p53) celler hæmmer celledeling

de øgede niveauer af Orc6 i humane coloncancer prøver førte os til at undersøge roller Orc6 i cellecyklus kontrol og narkotika følsomhed. Ved hjælp af en siRNA knock-down tilgang, vi først bekræftet, at proteinet niveauer af Orc6 faldt anvendelse af Western immunoblotanalyse i både HCT (wt-p53) celler (figur 1A, bane 1, ikke-specifik kontrol siRNA, bane 2, siRNA mod Orc6) og HCT-116 (null-p53) celler (figur 1A, bane 3, ikke-specifik kontrol siRNA; bane 4, siRNA mod Orc6). Ekspressionen af ​​Orc6 protein blev reduceret med mere end 5 gange i HCT (wt-p53) celler og HCT-116 (null-p53) celler.

α-tubulin blev anvendt som kontrol (A). Øget multinukleation ved nedregulering af Orc6 i HCT-116 (wt-p53) celler ved siRNA. Venstre panel, lys billede; Højre panel, DAPI nuklear farvning (B).

Det er blevet påvist tidligere, at knock-down Orc6 i HeLa-celler induceret polypoidy [8]. Vores resultater bekræftede dette i colon cancerceller, efter gentagen transfektion hver 3 dage, blev HCT-116 (wt-p53) celler med reduceret Orc6 ekspression flerkernede (figur 1B). Denne population steg med tiden. Kromatin blev farvet med 4 ‘, 6’-diamidino-2-phenylindol (DAPI) for at vise flerkernede celler efter langvarig Orc6 knockdown af siRNA (venstre panel, lysspredning celle image; højre panel, DAPI kernefarvning billedet i figur 1 B). Celleproliferation blev reduceret med over 50% (åben søjle) med Orc6 knock-down (figur 2). Men reduktion af Orc6 ekspression i HCT-116 (null-p53) celler reduceret i celleproliferation med kun 23% (stiplet søjle). For at undersøge effekten af ​​nedsat Orc6 i cellecyklus kontrol blev HCT-116 (vægt-p53) og HCT-116 (null-p53) celler først transficeret med 100 nM Orc6 siRNA. Transficerede celler blev udsat for 10 uM 5-FU i 12 timer. Vi observerede, 12 timer senere, både kontrol HCT-116 (wt-p53) celler og celler med reducerede Orc6 udtrykkende celler var i stand til at forblive stort set i G1-fasen uden cellecyklus genindførsel (figur 3A). Derimod blev HCT-116 (null-p53) kontrol- celler og Orc6 reducerede celler re-trådte i S-fasen af ​​cellens cyklus trods DNA beskadigelse af 5-FU og Orc6 reduktion (figur 3B). Disse resultater tyder på, at cellecyklus kontrol efter DNA-skaden er afhængig af tilstedeværelsen af ​​vildtype p53.

Effekt af Orc6 på kemosensitivitet til 5-FU og cis-pt

for at undersøge de potentielle konsekvenser af Orc6 på kemosensitivitet til nogle af de første linje kemoterapeutiske forbindelser såsom 5-FU og cis-pt i kolorektal cancer, blev HCT-116 (vægt-p53) celler som vores model system ved hjælp af celler transficeret med oligofectamine alene, ikke-specifik siRNA, og Orc6 specifik siRNA. Celler behandles derefter med 5-FU eller cisplatin med seriefortynding. Efter 72 timer blev celleproliferationen kvantificeret ved WST-1 assay. Figur 4A viste, at HCT-116 (wt-p53) celler med reduceret Orc6 ekspression var 5 gange mere følsom over for 5-FU behandling sammenlignet med kontrolceller baseret på IC

50 værdi. HCT-116 (wt-p53) celler med reduceret Orc6 ekspression var også mere følsomme over for cisplatin behandling sammenlignet med kontrolceller (figur 4B). Denne effekt blev stort set mangler fra HCT116 (null-p53) celler (data ikke vist).

Down stream signalveje, som foretages af Orc6

For at begynde at forstå nedstrøms signalveje potentielt involverede Orc6 blev et high throughput genekspression analyse anvendes til at kvantificere genekspression ændringer mellem HCT-116 (wt-p53) celler transficeret med Orc6 specifik siRNA og ikke-specifik siRNA kontrol. Ekspression og GeneOntology analyse viste, at et antal gener var påvirket af Orc6 inhibering (data, S1). Baseret på vores resultater, blev en række velkendte cellecyklus kontrol gener bekræftet ved hjælp af Western immunoblotanalyse. Vores resultater viste, at ekspression af p21 blev signifikant induceret i HCT-116 (wt-p53) celler efter Orc6 knock-down (figur 5, bane 1, ikke-specifik oligo kontrol, bane 2, siRNA of Orc6). Vi bekræftede yderligere, at ekspressionen af ​​DNA-beskadigelse reparation protein Gadd45β også blev induceret ved faldende Orc6 ekspression i HCT-116 (wt-p53) celler (figur 5, bane 1, uspecifik siRNA kontrol, bane 2, Orc6 specifik siRNA). Det er veldokumenteret, at Gadd45β spiller en vigtig rolle i cellecyklusstop, DNA-reparation, medfødte immunitet, vedligeholdelse af genom stabilitet og apoptose [7], [14], [15], [16]. Funktionen af ​​Gadd45β medieres gennem interaktion med andre proteiner, såsom cdc2 ved at forstyrre vekselvirkningen mellem ccd2 og cyclin B1 i udløsning G2 /M cellecyklusstop under genotoksisk stress [17], [18]. Vores resultater viste, at Gadd45β er mindst delvist ansvarlig for DNA-replikation defekt udløst af reduceret Orc6 ekspression i colon cancerceller. Udtrykket af JNK1 niveau blev reduceret med reduceret Orc6 udtryk (figur 5). Det har vist sig, at de roller JNK1 var ganske kompleks på grund af sin grund rolle i både apoptotiske og overlevelse signalveje [19], [20]. Fibroblaster med JNK-knockouts er mere følsomme over for TNF-induceret apoptose [21]. Mus embryo fibroblaster der mangler MKK7 (opstrøms aktivator af JNK) undergår cellulære aldring og G2 /M vækst anholdelse, yderligere støtte vores fund, at reduceret ekspression af JNK1 kan være en af ​​de medvirkende faktorer til G2 /M anholdelse forårsaget af knock-down af Orc6 udtryk [22]. Disse ændringer var stort set fraværende fra HCT-116 (null-p53) celler (data ikke vist). Dette er i overensstemmelse med tidligere rapporterede studier at p53 spiller central rolle i cellecykluskontrol som respons på DNA beskadigelse. Med induktion af p21-ekspression, forventer vi, at den efterfølgende udtryk for p53 kan øges, fordi p21 er en kendt cellecyklus check point kontrol gen medieret af p53. Imidlertid blev det totale cellulære niveau af p53-protein ikke ændret med knock-down af p53-ekspression (figur 6A, bane 1 og 2). Induktionen af ​​p21 var til stede i HCT-116 (null-p53) celler med Orc6 knock-down (figur 6A, bane 3, kontrol; bane 4, siRNA of Orc6). Dette indikerer, at induktionen af ​​p21-ekspression skal være p53 afhængige trods manglende i p53-ekspression niveau. Selv om den samlede p53 niveauet ikke steg i HCT-116 (wt-p53) celler, vi spekulere, at niveauet af p53 i den nukleare fraktion kan forøges på grund af kendte p53 translokation begivenhed. Ved at adskille kerner og cytoplasma, vi demonstreret, at niveauet af totale p53-protein i kerner ikke var forhøjet i HCT-116 (wt-p53) celler med reduceret Orc6 ekspression behandlet ved Orc6 specifik siRNA (figur 6A). I stedet blev niveauet af phosphoryleret p53 ved Ser-15 i den nukleare del af HCT-116 (wt-p53) celler med reduceret Orc6 ekspression (figur 6B). Dette er yderst konsistent med en veldokumenteret mekanisme af p53 som respons på DNA-skade (14). Phosphoryleret p53 ved ser-15 rest kan formindske dens samspil med den negative regulator, onkoproteinet MDM2.

(A) Western immunoblotanalyse af p53 og p21-ekspression efter Orc6 knockdown af siRNA i både HCT-116 (wt-p53) celler (bane 1, ikke-specifik kontrol, bane 2, specifikt siRNA for Orc6) og HCT-116 (null-p53) celler (bane 3, ikke-specifik kontrol, bane 4, specifikt siRNA for Orc6) . (B) Western immunoblotanalyse af phosphoryleret p53-ekspression ved Ser-15 i både cytoplasmiske og nukleare fraktion i kontrol HCT-116 (wt-p53) celler (bane 1, cytoplasmatisk; bane 2, nuklear) og HCT-116 (wt-p53 ) celler behandlet med siRNA mod Orc6 (bane 3, cytoplasmatisk, bane 4, nuklear). Total p53 protein ekspressionsniveauer blev anvendt som kontrol-protein i nukleare fraktioner og α-tubulin blev anvendt som kontrol for cytoplasmatiske fraktioner.

Det forekommer, at DNA beskadigelse respons forårsaget af en nedsat Orc6 niveau medieres gennem p53 afhængig cellecykluskontrol pathway. Vi spekulere, at højt niveau af Orc6 i kolorektal cancer kan bidrage til genome ustabilitet og måske ved akkumulerede miss-affyring af DNA-replikation med p53 sletninger /mutationer i over 50% af kolorektale tumorer. Tab af p53 i kolorektale tumorer bidrager yderligere til genome ustabilitet og akkumulerede mutationer. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at fuldt ud at forstå den molekylære og cellulære mekanisme af Orc6 i kolorektal cancer. Trods sin vigtige rolle i den indledende samleplatformen kræves til DNA-replikation, kan Orc6 have et potentiale som et hidtil ukendt mål for anticancer terapeutisk udvikling. Situationen måske ligner 26S proteasom som et mål for antistoffet stof bortezomib. Oprindeligt mente man, at målrette 26S proteasomet er ikke en god strategi på grund af sin allestedsnærværende rolle i proteinnedbrydning [23]. Den seneste rapport fra Chen

et al.

Antyder, at Orc6 kan undværes i DNA bindende aktivitet af orker i gær. Dette understøtter yderligere vores opfattelse, at målrette Orc6 i kolorektal cancer er en realistisk strategi for fremtidig terapeutisk udvikling [24].

Afslutningsvis vi demonstreret, i denne undersøgelse, at nedregulering af Orc6 i kolon kræftceller sensibilisere celler til 5-FU og cisplatin-behandling. Sammen med vores tidligere undersøgelser, der Orc6 var stærkt overudtrykt i kolorektal kræftpatienter, mener vi, at Orc6 kan have potentiale som en ny anticancer mål for fremtidig anti-tumor terapeutisk udvikling.

Materialer og metoder

celledyrkning

De humane coloncancer-cellelinjer, HCT-116 (wt-p53) og HCT-116 (null-p53) celler blev en gave fra professor Bert Vogelstein (The Johns Hopkins University, Baltimore, MD) og blev opretholdt i McCoys 5A-medium (Gibco Laboratories). 5-FU og cisplatin blev indkøbt fra Sigma.

siRNA Transfektion

HCT-116 (wt-p53) og HCT-116 (null-p53) blev udpladet i 6 brønd plader ved 1 × 10

5cells /brønd og transficeres med oligofectamine, ikke-specifik kontrol siRNA eller siRNA mod Orc6 ved 100 nM koncentration baseret på fabrikantens protokol (Invitrogen Inc.)

RNA Isolation

totalt RNA blev isoleret fra cellelinier ved anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, San Diego, CA) ifølge producentens instruktioner 24 timer efter transfektion med siRNA.

Western immunoblotanalyse

Celler blev skrabet og lyseret i RIPA-buffer (Sigma). Lige mængder af protein prøver (50 ug) blev opløst ved SDS-PAGE på 12% geler ved metoden ifølge Laemmli, og overført til polyvinylidenfluorid membraner (PVDF) (Bio-Rad Laboratories). Membranerne blev derefter blokeret med 5% fedtfri mælk i TBS-T (Tris-pufret saltvand og 0,5% Tween-20) ved stuetemperatur i 1 time. Proteiner blev probet med rotte-anti-orc6 monoklonalt antistof (1:1000 fortynding Upstate Technology), muse-anti-α-tubulin (1:1000 fortynding; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), mus-anti-p53 (1:1000 , Santa Cruz) efterfulgt af inkubation med et peberrodperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:1,000 fortynding, Bio-Rad, Hercules, CA). Proteiner blev visualiseret med et kemiluminescensdetektion systemet ved hjælp af Super Signal substrat (Pierce, Rockford, IL)

Fast tid QRT-PCR-analyse

cDNA syntese blev udført med High Capacity cDNA syntese kit (Applied Biosystems) under anvendelse af 1 ug af total RNA som template. PCR Master-blanding indeholdende TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix (nr AmpErase UNG), 10 × TaqMan assay og RT produkter i 25 pi volumen blev forarbejdet som følger: 95 ° C i 3 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 35 sek (n = 3). Signal blev indsamlet i endepunktet af hver cyklus. De genekspression værdier Orc6 fra hver prøve blev beregnet ved at normalisere med intern kontrol GAPDH og relative kvantificering værdier blev plottet.

Cell cyklus analyse ved flowcytometri

HCT-116 (vægt-p53) og HCT-116 (null-p53) blev udpladet i 6 brønd plader ved 1 x 10

5cells /brønd og transficeret med oligofectamine, ikke-specifik kontrol siRNA eller Orc6 genspecifik siRNA ved 100 nM koncentration. Celler blev behandlet med 5-FU (10 uM) 12 timer og celler blev høstet ved trypsin, vasket og mærket med propidiumiodid, vasket og resuspenderet i Krisham modificerede puffer og filtreret for flowcytometrianalyse (BD FACS kaliber).

Støtte Information

data S1.

GeneOntology. Gene Expression og GeneOntology analyse af differentielt udtrykte gener i kontrol og Orc6 knock-down HCT116 (vægt-p53) celler

doi:. 10,1371 /journal.pone.0004054.s001

(2,77 MB TIF)