PLoS ONE: Inddragelse af miR-518c-5 p til vækst og metastase i Oral Cancer

Abstrakt

Vi har tidligere vist, at en stromal celle-afledt faktor-1 (SDF-1, CXCL12) /CXCR4-systemet er involveret i etableringen af ​​metastaser i kræft i mundhulen. For nylig, små ikke kodende RNA’er, microRNA (miRNA) er blevet vist at være involveret i den metastatiske proces med flere typer af cancere. Men de miRNA, der bidrager til metastaser induceret af SDF-1 /CXCR4 system oral cancer er stort set ukendte. I denne undersøgelse har vi undersøgt de metastase-relaterede miRNA induceret af SDF-1 /CXCR4-system under anvendelse af B88-SDF-1 orale cancerceller, som udviser funktionelle CXCR4 og fjernt metastatisk potentiale

in vivo

. Gennem miRNA microarray analyse identificerede vi opregulering af MIR-518c-5p i B88-SDF-1-celler, og bekræftede induktion af real-time-PCR-analyse. Selv om en LNA-baserede miR-518c-5p-hæmmer ikke påvirkede cellevækst af B88-SDF-1 celler, gjorde det signifikant at hæmme migrationen af ​​cellerne. Dernæst transficerede vi en MIR-518c ekspressionsvektor i parentale B88-celler og CAL27 cancer oral celler og isolerede stabile transfektanter, B88-518c og CAL27-518c celler. Den forankringsafhængige og -uafhængig vækst af MIR-518c transfektanter blev signifikant forøget sammenlignet med væksten i mock celler. Desuden har vi opdaget forbedrede migration af disse celler. LNA-baserede miR-518c-5p hæmmer svækket betydeligt forbedrede cellevækst og migration af miR-518c transfektanter, hvilket indikerer, at disse fænomener var hovedsageligt afhængige af ekspressionen af ​​miR-518c-5p. Dernæst undersøgte vi funktionen af ​​miR-518c-5p

in vivo

. MIR-518c transfektanter eller modeller transfektanter blev podet i tyggemusklen eller blodkarrene i nøgne mus. Tumor volumen, lymfeknuder metastase, og lunge metastase blev øget væsentligt i de mus podet med miR-518c transfektanter. Disse resultater viste, at miR-518c-5p regulerer vækst og metastase af kræft i mundhulen som et nedstrøms mål af SDF-1 /CXCR4 systemet

Henvisning:. Kinouchi M, Uchida D, Kuribayashi N, Tamatani T, Nagai H, Miyamoto Y (2014) Inddragelse af miR-518c-5 p til vækst og metastase i Oral Cancer. PLoS ONE 9 (12): e115936. doi: 10,1371 /journal.pone.0115936

Redaktør: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: August 11, 2014 Accepteret: December 2, 2014; Udgivet: 23 December, 2014

Copyright: © 2014 Kinouchi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering: Dette arbejde blev støttet af en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning (B; 25.293.411 og C 26.463.046; http:. //Www. jsps.go.jp/english/e-grants/grants01.html). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Vi har tidligere vist, at B88-celler, som er orale cancerceller, der udtrykker kemokinreceptoren CXCR4, specifikt metastaserer til cervikale lymfeknuder via en stromal celleafledt faktor (SDF) -1 gradient produceret af lymfe stroma [ ,,,0],1] – [3]. Den tvungne ekspression af SDF-1 i B88-celler (opkaldt B88-SDF-1-celler) Tildelt forøget cellemotilitet og lunge metastase efter intravenøs inokulation [4]. For nylig har vi også vist, at CXCR4 ekspression bidrager til metastatiske potentiale spytkirtel cancere [5]. Endvidere har vi også vist, at blokering CXCR4 med 1,1 ‘- [1,4-phenylen (methylen)] bis-1,4,8,11-tetraazacyclotetradecan octahydrochloride (AMD3100), en CXCR4-antagonist, kan være en potent anti -metastatic terapi for CXCR4-relaterede hoved- og halscancer [5], [6].

Selv om SDF-1 /CXCR4 systemet primært fungerer som en kemotaktisk faktor i kræftceller til frø metastatiske steder, demonstrerede de seneste undersøgelser at dette system også regulerer tumorvækst cancercelle-tumormikromiljøet interaktion og angiogenese [7] – [10]. Faktisk at fastlægge metastaser, flere vigtige processer, såsom invasion, intravasation, ekstravasation og ektopisk vækstpotentiale, er uundværlige. Således er det kritisk at undersøge funktionen af ​​nedstrømsmål (er) er ansvarlig for processen med metastase i SDF-1 /CXCR4-system. microRNA (miRNA) er små regulatoriske ikke-kodende RNA’er, som binder til specifikke mål-mRNA’er, der fører til translationel undertrykkelse [11]. miRNA er involveret i reguleringen af ​​biologiske processer, herunder cellevækst, differentiering og apoptose, både i fysiologiske betingelser og under sygdomme, såsom cancer [11]. De seneste oplysninger har vist, at miRNA spiller afgørende roller i den metastatiske proces af flere typer af kræft [11]. Men de miRNA, der bidrager til metastaser induceret af SDF-1 /CXCR4 system oral cancer er stort set ukendte. Således i denne undersøgelse undersøgte vi target miRNA reguleret af SDF-1 /CXCR4-system i B88-SDF-1-celler under anvendelse af miRNA microarrays og undersøgt deres funktionelle rolle på metastase i oral cancer.

Materialer og metoder

Etik erklæring

musene blev håndteret i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Forskningsudvalget Animal, Tokushima Universitet (Permit Nummer: 11111). Kort beskrevet blev alle mus huset under patogenfrie tilstand, fået mad og vand ad libitum og holdt i en 12 timers lys /mørke-cyklus i et passende temperaturkontrolleret rum. Alle kirurgi og eutanasi blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse. B88 celler [1], blev [12] oprindeligt etableret fra en patient med tungen kræft i 1988. Den Etiske Komité for Tokushima Universitetshospital givet afkald på, at et samtykke om brugen af ​​denne cellelinje (Permit nummer: 453).

miRNA microarray analyse

Lille RNA for miRNA microarray analyse blev udvundet serum-sultede B88-mock celler og B88-SDF-1 celler. En miRNA microarray blev udført og analyseret i Toray (Tokyo, Japan) under anvendelse af et humant 3D-Gene Array (V16.1.0.0). De microarray rå data blev deponeret i Gene Expression Omnibus (GEO, http: //www.ncbi.nlm.nih.-gov/geo) i henhold til minimum oplysninger om microarray eksperiment (MIAME) retningslinjer. Tiltrædelsen nummer er GSE59323.

Celler og cellekultur

Mundtlige kræftceller blev anset fri for mycoplasma og bakterielle forureninger. CAL27 celler er orale cancerceller, der blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). B88-celler stærkt metastaserer til cervikale lymfeknuder, når cellerne inokuleres i tyggemusklen af ​​nøgne mus, men sjældent metastaserer til lungerne ved intravenøs inokulering [1], [4]. I modsætning hertil CAL27 celler sjældent metastaserer til cervikale lymfeknuder eller lunger, når cellerne podes i tyggemusklen eller halevenen på nøgne mus, henholdsvis (upubliceret observation). Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM, Sigma, St. Louis, MO) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), 100 ug /ml streptomycin og 100 U /ml penicillin i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO2 ved 37 ° C.

mus og

in vivo

undersøgelse

BALB /c nøgne mus blev købt fra CLEA Japan (Osaka, Japan). Musene blev holdt under patogenfrie betingelser. Forsøgene blev igangsat når musene var 8 uger gamle og blev udført som tidligere beskrevet [1], [4]. Kort fortalt blev cellerne orthotopisk inokuleret i tyggemusklen af ​​nøgne mus (2 × 10

6) eller inokuleres i blodkarrene i nøgne mus (1 x 10

6); de mus blev aflivet på dag 35. tumorvolumen blev estimeret ved at måle tumorens størrelse og ved anvendelse af følgende formel: tumorvolumen = 1/2 × L × W

2, hvor L og W repræsenterer den største diameter og den mindste diameter hhv. Tilstedeværelsen eller fraværet af lymfekirtel og fjerne metastaser blev bekræftet ved hematoxylin og eosin-farvning.

Transfektion

Celler (5 x 10

5 celler /skål) blev podet i 100 mm kultur skåle (Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ) i DMEM suppleret med 10% FCS. Fireogtyve timer senere blev cellerne transficeret med 5 ug af HSA-MIR-518c ekspressionsvektor eller kontrolvektoren (ORIGENE, Rockville, MD) ved anvendelse af Lipofectamin LTX (Life Technologies, Carlsbad, CA) ved en slutkoncentration på 50 pM. Cellerne blev inkuberet i 24 timer i DMEM indeholdende 10% FCS (V /V) og blev efterfølgende trypsineret og podet (01:05 forhold) i 100 mm dyrkningsskåle i DMEM-medium indeholdende 10% FCS (V /V). Otteogfyrre timer senere blev cellerne anbragt i et selektivt medium indeholdende Geneticin (700 ug /ml G418, Life Technologies). Efter selektion med G418 i 2 uger, blev alle kolonierne blev indsamlet og følgende stabile transfektanter isoleret: B88-518c, B88-mock2, CAL27-518c, og CAL27-mock celler

Kvantitativ RT-PCR.

Efter 24 timer, RNA blev isoleret fra logaritmisk voksende celler med TRlzol-reagens (Life Technologies) ifølge producentens instruktioner. Revers transkription blev udført ved anvendelse af TaqMan MicroRNA RT Kit (Life Technologies) eller miScript II RT Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). I kvantitativ PCR blev miR-518c-5p og RNU6B miRNA opdages ved hjælp af TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies) eller miScript Primer Assay (Qiagen). Genspecifikke produkter blev målt kontinuerligt ved en ABI StepOnePlus Real-Time PCR systemet i løbet af 40 cyklusser af PCR. I nogle eksperimenter blev celler transficeret med eller uden 50 nM miRCURY LNA microRNA inhibitor (Exiqon, Vedbæk, Danmark) under anvendelse af Lipofectamine RNAiMax (Life Technologies).

MTT assay

Celler blev podet på en 96-brønds plade (Falcon, Becton Dickinson Labware) ved 5 × 10

3 celler per brønd i DMEM indeholdende 10% FCS. Fireogtyve timer senere blev cellerne transficeret med eller uden 50 nM miRCURY LNA microRNA inhibitor under anvendelse af lipofectamin RNAiMax. Efter 24 eller 48 timer blev antallet af celler kvantificeret ved et assay ved anvendelse MTT [3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid; Sigma].

In vitro

cellemigrationsassay

in vitro

migrering af cellerne blev evalueret ved hjælp transbrøndene (Corning Corning, NY) som tidligere beskrevet [1]. Cellerne sluttet pore eller cellerne fæstnet til den nedre overflade af membranen blev talt i 10 felter ved høj effekt visning (x 400) af en tredje person blindet for behandlingsbetingelser. I nogle forsøg blev 50 nM miRCURY LNA microRNA inhibitor transficeret før cellerne blev podet på det øvre kammer.

Wound assay

Ved 24 timer efter podning af cellerne blev en lineær sår frembringes på de konfluente monolag ved skrabning med en pipettespids. Fastgjorte celler blev vasket af med omrøring. Celler blev fotograferet ved det samme punkt på et gitter 48 timer senere. Hver cellelinje blev belagt og såret i tre eksemplarer

Sfæroide dannelse assay

Celler blev podet på en 96-brønds plade (NanoCulture plade; SCIVAX Life Sciences, Woburn, MA). Ved 1 × 10

3 celler per brønd i DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret FCS. Fireogtyve timer senere blev fænotype af cellerne observeret af fasekontrastmikroskop (× 300).

Statistisk analyse

Væsentlige forskelle mellem midlerne til de forskellige grupper blev vurderet med StatView 4.5 (Abacus Concepts, Berkeley, CA) ved hjælp af en-vejs ANOVA med signifikans sat til p. 0,05

Resultater

Isolering af miR-518c-5p, som er foranlediget af SDF- 1 /CXCR4 systemet

Vi undersøgte miRNA nedstrøms for SDF-1 /CXCR4 systemet ved hjælp af oral cancer cellelinie, B88-SDF-1, som har en autokrin SDF-1 /CXCR4-system og udviser fjernt metastatisk potentiale

in vivo

[4]. Microarray analyse afslørede, at adskillige miRNA blev opreguleret eller nedreguleret i B88-SDF-1-celler sammenlignet med mock-celler (data ikke vist). For at bekræfte specificiteten af ​​microarray analyse blev miRNA udtryk bekræftet ved kvantitativ RT-PCR. Svarende til microarray resultater blev MIR-518c-5p (tidligere benævnt MIR-518c *) ekspression opreguleret i B88-SDF-1-celler sammenlignet med mock-celler (Fig. 1A). Endvidere var dette opregulering fuldstændigt ophævet ved transfektion af en MIR-518c-5p LNA inhibitor (fig. 1A). Vi opnåede også lignende resultater i forældrenes B88 celler stimuleret med SDF-1 (fig. 1B).

(A) Udtrykket af miR-518c-5p blev bekræftet i B88-mock og B88-SDF-1 celler ved real-time PCR. Nedreguleringen af ​​MIR-518c-5p i B88-SDF-1-celler efter behandling med en MIR-518c-5p LNA inhibitor blev også bekræftet. N.d .: ikke påvises. (B) Udtrykket af miR-518c-5p blev bekræftet i forældrenes B88 celler efter behandling med eller uden SDF-1 ved real-time PCR.

Effekt af miR-518c-5p hæmning på celle vækst og SDF-1 /CXCR4-afhængig cellevandring

Tidligere fandt vi, at hverken parakrin eller autokrin SDF-1 /CXCR4 systemet påvirket forankringsafhængige vækst af B88-celler [1], [4] . Vi undersøgte effekten af ​​miR-518c-5p på cellevækst ved hjælp af en specifik miR-518c-5p LNA-hæmmer. Inhibitoren påvirkede ikke væksten af ​​enten B88-mock eller B88-SDF-1-celler (fig. 2A). Derefter undersøgte vi virkningen af ​​MIR-518c-5p på SDF-1 /CXCR4-afhængige migrering af cellerne. Migration kammer analyser viste, at den forbedrede motilitet af B88-SDF-1 celler blev væsentligt forringet efter behandling med en miR-518c-5p LNA-hæmmer (Fig. 2B).

(A) Væksten af ​​B88-mock celler (venstre side) og B88-SDF-1-celler (højre side) i nærværelse af enten en kontrol LNA inhibitor eller et mIR-518c-5p LNA inhibitor blev undersøgt under anvendelse af et MTT-assay. Der var ingen signifikante forskelle mellem de tre grupper ved envejs ANOVA. (B) motilitet B88-SDF-1-celler i nærvær af enten en kontrol LNA inhibitor eller et MIR-518c-5p LNA inhibitor blev undersøgt ved anvendelse af et Transwell migration assay. I alt 2 × 10

4-celler blev transficeret inden de blev podet i kammeret. **;

s

. 0,01 sammenlignet med ubehandlede kontrol eller kontrol LNA inhibitor-behandlede celler ved envejs ANOVA

Effekt af miR-518c-5p overekspression på cellevækst

Næste udførte vi en gevinst på funktion assay overudtrykker mIR-518c-5p i parentale B88-celler og også i parentale CAL27 celler, hvori ekspressionen af ​​CXCR4 og mIR-518c-5p var ikke detekterbar. Efter transfektion af den tomme vektor eller miR-518c ekspressionsvektor, vi samlet alle de G418-resistente kloner for at undgå klonal heterogenitet af cellerne og etableret følgende transfektanter, B88-mock2, B88-518c, CAL27-mock og CAL27-518c. Vi kunne detektere opregulering af MIR-518c-5p i MIR-518c transfektanter sammenlignet med mock-celler, som blev fuldstændig inhiberet ved behandling med MIR-518c-5p LNA inhibitor (fig. 3A, B). Den forankringsafhængige vækstpotentiale både B88-518c og CAL27-518c celler blev signifikant forøget sammenlignet med mock celler (fig. 3C, D), som blev inhiberet signifikant ved behandling med MIR-518c-5p LNA inhibitor (fig. 3E, F). Dernæst undersøgte vi effekten af ​​MIR-518c overekspression på forankringsuafhængig vækst af cellerne. B88-mock2 celler dannede runde og stramme celle-celle adhæsion sfæroider (fig. 3G), hvorimod B88-518c celler dannede Grapevine-lignende sfæroider (fig. 3H). I modsætning hertil begge CAL27 transfektanter dannede runde sfæroider (fig. 3i, J), men større spheroids blev observeret i CAL27-518c celler (Fig. 3J).

B88 celler og CAL27 celler blev stabilt transficeret med en kontrol vektor eller en miR-518c udtryk vektor, og B88-mock2 eller B88-518c celler og CAL27-mock eller CAL27-518c celler blev isoleret, hhv. (A, B) Udtrykket af miR-518c-5p i B88-transfektanterne (A) og CAL27-transfektanter (B) blev vurderet ved real-time PCR. Den nedregulering af miR-518c-5p i B88-518c celler eller CAL27-518c celler efter behandling med en miR-518c-5p LNA-inhibitor blev også bekræftet. (C, D) Anchorage-afhængig vækst af B88-transfektanter (C) og CAL27-transfektanter (D) blev evalueret under anvendelse af et MTT-assay. *;

s

0,05, **;

s

0,01 sammenlignet med mock celler ved envejs ANOVA. (E, F) Væksten af ​​B88-transfektanterne (E) og CAL27-transfektanter (F) i tilstedeværelse af enten en kontrolgruppe LNA-hæmmer eller en miR-518c-5p LNA-inhibitor blev undersøgt ved hjælp af en MTT-analysen. *;

s

0,05, **;

s

0,01 sammenlignet med ubehandlede kontrol eller kontrol LNA inhibitor-behandlede celler ved envejs ANOVA. (GJ) Anchorage-uafhængig vækst af B88-mock2 (G), B88-518c (H), CAL27-mock (I) eller CAL27-518c (J) blev evalueret ved hjælp af en nano-kultur plade.

Effekt af miR-518c-5p overekspression på cellemigration

B88-518c celler erhvervet en betydelig kemokinetisk respons (fig. 4A) og forbedret celle motilitet (fig. 4B). Vi har detekteret også en forbedret migration i CAL27-518c celler (Fig. 4C). Den forøgede cellemotilitet af de B88-518c celler blev væsentligt forringet efter behandling med MIR-518c-5p LNA inhibitor (fig. 4D).

(A) B88-mock2 eller B88-518c celler blev dyrket til konfluens. En sårheling blev udført. *;

s

0,05 sammenlignet med mock celler ved envejs ANOVA. (B, C) Den motilitet B88-518c celler (B) eller CAL27-518c celler (C) blev vurderet ved anvendelse af et Transwell migration assay. Hver transfektant blev podet ved en densitet på 1 x 10

4. **;

s

0,01 sammenlignet med mock celler ved envejs ANOVA. (D) motilitet B88-transfektanter i nærværelse af enten en kontrol LNA inhibitor eller et MIR-518c-5p LNA inhibitor blev også undersøgt under anvendelse af et Transwell migration assay. **;

s

0,01 sammenlignet med ubehandlede kontrol eller kontrol LNA inhibitor-behandlede celler ved envejs ANOVA

rolle miR-518c-5p på væksten og metastaser.

in vivo

Vi næste evaluerede effekten af ​​miR-518c-5 p på vækst og metastase in vivo. B88 og CAL27 transfektanter blev orthotopisk inokuleret i tyggemusklen af ​​nøgne mus [1]. Størrelsen af ​​den primære tumor fra B88-518c celler (fig. 5A) og CAL27-518c celler (Fig. 5B) var signifikant forøget sammenlignet med tumorer fra mock celler. Selv om begge mock og MIR-518c transfektanter histopatologisk metastaseret til de cervikale lymfeknuder, vægten af ​​lymfeknuder indeholdende MIR-518c transfektanter var signifikant tungere end lymfeknuder indeholdende mock celler (fig. 5C-E). Dernæst udføres intravenøs inokulering under anvendelse af disse transfektanter. Talrige og store metastatiske knuder blev detekteret i lungerne i alle musene inokuleret med B88-518c celler (fig. 6A). Antallet af knuder fra mus podet med B88-518c celler var signifikant øget i forhold til antallet af mock celler (Fig. 6B).

(A, B) B88-transfektanter (A) og CAL27-transfektanter ( B) blev orthotopisk inokuleret i tyggemusklen af ​​nøgne mus, der blev aflivet på dag 35. størrelsen af ​​primære tumorer blev målt en gang om ugen. Resultaterne præsenteret er de middelværdier ± SD. *; p 0,05 sammenlignet med mock celler ved envejs ANOVA. (C) Repræsentant H p 0,05 sammenlignet med mock celler ved envejs ANOVA

Celler blev podet i blodkarrene i nøgne mus, som blev aflivet på dag 35. (A) repræsentant H 0,01 sammenlignet med mock celler ved envejs ANOVA

Diskussion

miRNA er små, endogene, evolutionært bevarede ikke-kodning RNA, der regulerer ca. 60% af mammale gener ved at modulere deres transkriptniveauer. miRNA er involveret i mange molekylære veje og i centrale biologiske processer, herunder cellevækst, udvikling, differentiering, proliferation og celledød [11]. De seneste undersøgelser viser rolle miRNA i modulering den metastatiske proces i forbindelse med faste tumorer, og disse miRNA er blevet benævnt metastamir [13]. Talrige metastamirs er blevet identificeret og har pro- og anti-metastatiske virkninger [11]. er imidlertid sandsynligt, at der er mange miRNA, der er metastamir med ukendte funktioner, fordi 3% af det humane genom estimeres at kode for miRNA sekvenser [14]. I den foreliggende undersøgelse påviste vi, at MIR-518c-5p kan være en hidtil ukendt metastase-fremmende metastamir. MIR-518c-5p blev oprindeligt identificeret i de 250 små RNA-biblioteker fra 26 forskellige organsystemer og celletyper af menneskelig og gnavere, beriget i neuronal såvel som normale og maligne hæmatopoietiske celler og væv [15]. Selvom funktionen af ​​miR-518c-5p ikke er klart defineret i kræft, Dyrskjøt og kolleger viste, at miR-518c-5p var signifikant associeret med sygdomsprogression, når der korrigeres for sygdom scenen og kvalitet ved hjælp af en multivariat Cox regressionsanalyse [16]. Desuden viste de seneste undersøgelser, at miR-518c-5 p udviste et signifikant opregulering i retinoblastoma i en miRNA microarray analyse [17]. Taget sammen med vores nuværende resultater, kan MIR-518c-5p fungere som en oncomiR i tumorceller.

I den foreliggende undersøgelse viste vi, at MIR-518c-5p opreguleres af SDF-1 /CXCR4-system i en parakrin eller autocine måde. Rhodes og kolleger undersøgte miRNA ekspression induceret af SDF-1 /CXCR4-system i østrogen receptor-a-positiv brystcancer-celler [18]. Men hverken miR-518c-5p eller anden miRNA påvist i vores miRNA-analyse var til stede i deres resultater. Selv vi også analyseret miRNA microarray analyse i CXCR4-positive spytkirtel cancerceller, ACC-M [19], efter stimulering med SDF-1, der ikke var nogen fælles miRNA mellem de tre miRNA microarray analyser trods af anvendelsen af SDF-1 /CXCR4-system i disse cancerceller (data ikke vist). Dette resultat kan skyldes de forskellige forsøgsbetingelser af cellerne; dog kan det skyldes de forskellige stedspecifik metastatisk mønster i disse cancerceller. For eksempel brystkræft favoriserer metastaserende til knoglen, spytkirtel kræft til lungerne og cancer oral til lymfeknuderne. Således kan miRNA som er nødvendige for homing til den specifikke målorgan aktiveres af CXCR4 på binding af dens ligand, SDF-1 i disse cancerceller.

Mekanismen for MIR-518c-5p opregulering af SDF -1 /CXCR4-system i orale kræftceller blev ikke afklaret i nærværende undersøgelse. MIR-518c-5p tilhører MIR-515 familie i et kromosom 19 miRNA klynge, såkaldt C19MC [20]. C19MC er den største klynge, konserveret kun hos primater, der koder 59 modne miRNA og vise en meget lav ekspression i de fleste humane væv på grund af epigenetisk kontrol [20]. Fordi SDF-1 /CXCR4 systemet kan opregulere DNMT1 /DNMT3ß ekspression [21] eller ANP32A /lanp, en komponent af inhibitoren af ​​histon acetyl transferase [22], kan MIR-518c-5p opregulering være afhængig af resultatet af demethylering af C19MC. Alternativt viste de seneste undersøgelser, at nogle af miRNA medlemmer i C19MC blev opreguleret i hepatocellulært carcinom karakteriseret ved afvigende IGF, phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) -Akt-mTOR eller p53-aktivering [23], [24]. Den SDF-1 /CXCR4 system kan også aktivere PI3K-Akt veje i B88 celler [1], og disse veje kan være involveret i opregulering af miR-518c-5p. Vi undersøgte yderligere MIR-518c-5p-ekspression under anvendelse af en oral cancercellelinie, HNT, hvori ekspressionen af ​​CXCR4 var 7,5 gange lavere end den, B88-celler [1], [3]. HNT-SDF-1-celler gjorde udviser svag, men ikke signifikant, fænotypiske ændringer

in vitro

in vivo

, hvori aktiveringen af ​​PI3K-Akt af SDF-1 ikke var detekterbar [ ,,,0],4]. Endvidere MIR-518c-5p induktion i hNT-SDF-1-celler var påviselig kun på en marginal niveau, sandsynligvis på grund af den reducerede ekspression af CXCR4, sammenlignet med den af ​​B88-celler (data ikke vist). Således CXCR4 ekspressionsniveauet og stærk nedstrøms signalering, såsom PI3K-Akt, kan også være afgørende for aktiveringen af ​​miR-518c-5p udtryk derfor yderligere undersøgelser ville være nødvendige for at afklare denne mekanisme.

i den foreliggende undersøgelse havde mIR-518c-5p induceret af SDF-1 /CXCR4 systemet ikke stimulere cellevækst men forbedre cellemigrering ved anvendelse af et LNA-inhibitor. I modsætning hertil kunne vi registrerer både vækst stimulering og øget udvandring efter transfektion af en miR-518c ekspressionsvektor,

in vitro

in vivo

. Selvom årsagen er uklar, kan konstateringen skyldes virkningen af ​​MIR-518c-3p produceret af MIR-518c ekspressionsvektor. Men vi kunne ikke finde tidligere rapporter om miR-518c-3p i cancerceller og cellevækst, og en LNA-inhibitor mod miR-518c-5p kunne undertrykke forøget vækst både i B88-518c og CAL27-518c celler (Fig. 3E , F). vi mener således, at virkningen af ​​MIR-518c-3p på væksten af ​​de celler kunne delvist forsømt. Den anden mulighed kan skyldes nedreguleringen af ​​de ikke-fysiologiske eller falsk mål-mRNA’er, der deler en lignende frø sekvens ved overekspression af MIR-518c-5p. Imidlertid overekspression af MIR-518c-5p af oligonukleotidet Modsat hæmmede væksten og migration af B88-celler og CAL27 celler, mest sandsynligt på grund af nedregulering af falsk mål-mRNA (data ikke vist). Dette resultat indikerer, at ekspression af MIR-518c ved hjælp af vektoren metode inducerede en fysiologisk og ikke-toksisk tilstand i disse orale cancerceller. Mener således vi, at den moderate induktion af MIR-518c-5p kan være tilstrækkeligt til cellemigrering, men kan være nødvendig stærk induktion af MIR-518c-5p til induktion af cellevækst. Fordi den

i silico

mRNA mål for miR-518c-5p omfatte flere typer af gener, der regulerer vækst og metastase (S1 Table), afhandlinger målgener kan styre forskellige effekt af miR-518c-5p.

C19MC, herunder miR-518c-5p, kort til kromosomal band 19q13.4 [20]. Kasamatsu og kolleger viste, at 19q13.4 locus forstærkes i spytkirtlen adenoide cystisk carcinom, en højt metastatisk type hoved og halscancer [25]. Desuden er forstærkningen af ​​dette locus hyppigt påvist i ependymoblastoma og embryonale tumorer med rigelige neuropil og sande rosetter, meget aggressive embryonale neoplasmer, med en sats på 93% [26]. SDF-1 /CXCR4 systemet spiller vigtige roller i at bevare arkitekturen i nicher for hæmatopoietisk og andre væv stamceller såsom kimceller og follikulært, intestinal og neurale stamceller [27], [28]. Især fleste cancer stamceller (CSCS) udtrykke CXCR4 og svare en kemotaktisk gradient af SDF-1, hvilket antyder, at CSCS udgør sandsynligvis en subpopulation stand til at initiere metastase [29]. Desuden har adskillige grupper nylig knyttet udtryk for medlemmer af C19MC med miRNA signatur karakteristisk for humane embryonale stamceller [20]. Tilsammen C19MC, herunder miR-518c-5p, kan udtrykkes i CSCS der er involveret i vækst og metastase.

Konklusioner og anbefalinger

Disse resultater viste, at miR-518c-5P regulerer vækst og metastase af oral cancer som en nedstrøms mål af SDF-1 /CXCR4-system. I fremtiden vil det være afgørende at undersøge sammenhængen mellem CXCR4 og miR-518c-5p udtryk i klinisk materiale. Hvis den molekylære mekanisme miR-518c-5p mod kræft metastase kunne præciseres yderligere, kan undertrykkelse af cellevækst og migration ved en miR-518c-5p hæmmer tjene som grundlag for udviklingen af ​​behandlinger mod metastaser.

Støtte Information

S1 Table.

miRNA målrettet af MIR-518c-5p analyseres ved anvendelse af microRNA.org programmet (https://www.microrna.org/microrna/getMirnaForm.do), og afskæringsværdien er indrettet mindre end -1.5 af miRSVR score

doi:. 10,1371 /journal.pone.0115936.s001

(DOC)

tak

Vi takker Dr. Koh-ichi Nakashiro (afdeling for Oral og Kæbekirurgi, Ehime University Graduate School of Medicine) yde teknisk bistand.