PLoS ONE: Nanog1 i NTERA-2 og rekombinant NanogP8 fra somatiske Cancer Cells Vedtage Flere proteinkonformationer og migrere på flere MW Species

Abstrakt

Menneskelig Nanog1 er et 305-aminosyre (aa) homeodomæne-holdige transskription faktor kritisk for pluripotens af embryonale stamceller (ES) og embryonal carcinoma (EF) celler. Somatiske kræftceller overvejende udtrykker en retrogene homolog af Nanog1 kaldet NanogP8, som er -99% ligner Nanog på aa niveau. Selvom den forudsagte M.W af Nanog1 /NanogP8 er ~35 kD, er begge blevet rapporteret til at migrere, på vestlige blotting (WB), ved tilsyneladende molekylære masser af 29-80 kD. Hvorvidt alle disse rapporterede protein bands repræsenterer autentiske NANOG proteiner er uklar. Desuden har detaljerede biokemiske undersøgelser af Nanog1 /NanogpP8 manglet. Ved at kombinere WB hjælp 8 anti-Nanog1 antistoffer, immunopræcipitation, massespektrometri og undersøgelser med anvendelse af rekombinante proteiner, her vi leverer

direkte

beviser for, at Nanog1 protein i NTERA-2 EF celler eksisterer som flere MW arter fra -22 kD til 100 kD med en større 42 kD bånd påviselige på WB. Vi derefter vise, at rekombinant NanogP8 (rNanogP8) proteiner fremstillet i bakterier under anvendelse cDNA’er fra flere cancerceller også migrere, på denaturerende SDS-PAGE, ved -28 kD til 180 kD. Interessant forskellige anti-Nanog1 antistoffer udviser differentiel reaktivitet over rNanogP8 proteiner, som spontant kan danne højt M.W proteinarter. Endelig viser vi, at de fleste langsigtede dyrkede kræftceller synes at udtrykke meget lave niveauer af eller forskellige endogene NanogP8 protein, der ikke kan let påvises ved immunfældning. Alt i alt, den aktuelle undersøgelse afslører unikke biokemiske egenskaber af Nanog1 i EF-celler og NanogP8 i somatiske kræftceller

Henvisning:. Liu B, Badeaux MD, Choy G, Chandra D, Shen I, Jeter CR, et al. (2014) Nanog1 i NTERA-2 og rekombinant NanogP8 fra Somatisk Cancer Cells Vedtage Flere proteinkonformationer og migrere på Multiple M.W Arter. PLoS ONE 9 (3): e90615. doi: 10,1371 /journal.pone.0090615

Redaktør: Rajvir Dahiya, UCSF /VA Medical Center, USA

Modtaget: Januar 12, 2014 Accepteret: 29 Januar 2014; Udgivet: 5 mar 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, delvist af tilskud fra NIH (R01-CA155693), Department of Defense (W81XWH-13-1-0352), CPRIT (RP120380), den MDACC center for Cancer Epigenetik og RNA center-Laura John Arnold Foundation tilskud (D. G. Tang), og af to center Tilskud (CCSG-5 P30 CA166672 og ES007784). C. Jeter, M. Person, og C. Liu blev støttet, delvist af CPRIT RP120394, CPRIT RP110782, og DOD ph.d.-stipendium (PC121553), hhv. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Dhyan Chandra er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Nanog1 (almindeligvis kaldet Nanog) er kodet af

Nanog

gen ligger på Chr . 12p13.31 (fig. S1A). Genet har 4 exons og koder en homeodomæne transskription faktor, der er afgørende for selv-fornyelse af embryonale stamceller (ES) celler [1], [2]. Nanog1 overekspression i muse ES-celler (mESCs) overvinder kravet om leukæmi inhibitorisk faktor for at opretholde pluripotens [1], [3] henviser afbrydelse af

NANOG

resultater i Mesc differentiering til extraembryonic endoderm [4]. Nedregulering af Nanog1 i humane økonomiske og sociale råd (hESCs) fører også til tab af pluripotens og differentiering til extraembryonic cellelinier [5]. Endvidere i forbindelse med andre omprogrammering faktorer, Nanog1 overvinder omprogrammering barrierer og fremmer somatiske celler omprogrammering [6], [7]. , Nanog1 er således et centralt iboende element i den transkriptionelle netværk for at opretholde selv-fornyelse af økonomiske og sociale råd.

Menneskelig Nanog1 protein har 305 aminosyrer (aa) og 5 funktionelle underdomæner, dvs. N-terminale domæne (ND ), homeodomæne (HD), C1-terminale domæne (CD1), tryptophan-rige domæne (WR) og C2-terminale domæne (CD2) [8] – [11] (figur 1A).. ND er involveret i transkription interferens og C-terminale region indeholder transskriptionen aktivator. Den HD-domænet er påkrævet for Nanog kernelokalisering og transaktivering og WR region medierer dimerisering af Nanog protein, som er nødvendigt for pluripotens aktivitet [12], [13]. Af interesse, menneske

Nanog

har 11 pseudogener [14], blandt hvilke

NanogP8

, beliggende på Chr. 15q14, har en komplet åben læseramme [14], [15] (fig. S1B), der besidder en Alu element i 3′-UTR homolog med en i

Nanog1

gen, hvilket antyder, at

NanogP8

er en retrogene snarere end en pseudogen. NanogP8 har mindst 6 konserveret nukleotid (nt) forskelle til Nanog1, hvilket kan resultere i nogle aa ændringer [15].

(A) Skematisk af det humane Nanog protein og 8 anti-NANOG Ab’er anvendes i denne studere. Vist i parentes er epitoper af individuelle Abs. ND, N-terminus domæne; HD, homeodomæne; CD1 og CD2, C-terminus domæne 1 og 2; WR, tryptophanrigt domæne. Stjernen i ND angiver Leu61 rest anerkendt af eBioscience mAb (pil) kortlagt fra vores nuværende studier. (B-H) WB analyse i NTERA-2 NE (N, to forskellige batches) eller cytosol (C) under anvendelse 8 anti-NANOG Abs. Individuel Ab er angivet nederst og M.W til venstre. Sort pilespids, det forudsagte 35 kD Nanog protein; rød pilespids, den vigtigste 42 kD bånd; . Grønne pile, yderligere bånd (især efter længere eksponeringer)

Det er interessant, er blevet rapporteret mange somatiske kræftceller til at udtrykke Nanog mRNA og /eller protein [15] – [46]. Adskillige forbehold er forbundet med mange af disse undersøgelser.

First

, på mRNA-niveauet, grundige undersøgelser anvender differentiel RT-PCR kombineret med sekventering eller forskellig sensitivitet til restriktionsenzymet AlwN1 [15], [17], [31], [32], [34] , [46], har vist, at somatiske kræftceller fortrinsvis udtrykker afskrift af

NanogP8

gen (figur S1B;. se nedenfor) i stedet for

Nanog1

. Faktisk har vi observeret, at

nanog1

locus er bragt til tavshed i nogle somatiske cancerceller [15]. Vores sekventering analyser afslører, at embryonal carcinom (EF) NTERA-2 celler udtrykker

Nanog1

men ikke

NanogP8

mRNA mens alle somatiske kræftceller (6 forskellige typer, herunder primær prostata tumor-afledte celler) show 5 af de 6 nt forskelle specifikke for

NanogP8

[15]. Blandt de 5 bevarede nt ændringer i

NanogP8

, en (nt759) bør resultere i en en ændring (Q253H) selv om nogle kræftceller viser andre ikke-bevarede nt ændringer (dvs. polymorfismer), der kan også resultere i aa ændringer (f.eks L61P for HPCa6) [15]. Gøre sondringen mellem Nanog1 og NanogP8 er vigtigt, fordi de to udskrifter stammer fra separate genomisk loci og har forskelle på de nt sekvens niveauer.

Anden

, mange tidligere undersøgelser har været blot korrelative uden sondering den funktionelle betydning NanogP8 ekspression i cancerceller. Brug human prostatacancer (PSA) som model, har vi vist [15], at: 1) NanogP8 protein udtrykkes som en gradient i PCA celler med let påviselig nukleare NanogP8 i kun en lille brøkdel af PCA celler; 2) NanogP8 protein-udtrykkende celler øges i primær PCa i forhold til at matche godartede væv; 3)

NanogP8

mRNA og NanogP8 protein beriget med CD44

+ og CD44

+ CD133

+ primære PCA celler; 4) shRNA-medieret knockdown af

NanogP8

hæmmer tumor regenerering af prostata, bryst, og tyktarmskræft celler; og 5) De tumor-inhiberende virkninger af

NanogP8

knockdown er forbundet med inhibering af celleproliferation og klonal ekspansion af tumorceller og afbrydelse af differentiering. Vores seneste undersøgelser viser, at inducerbar NanogP8 udtryk i løs PCA celler er tilstrækkelig til at give kræft stamceller (CSC) egenskaber og fremme androgen-uafhængig PCa vækst [34], og at NanogP8 er beriget i udifferentierede (PSA

– /lo) PCa celler og dens knockdown forsinker udvækst af kastrationsresistent PCa [41]. Vores undersøgelser [15], [34], [41] peger på potentielle pro-onkogene funktioner NanogP8.

Tredje

, de forudsagte Nanog1 og NanogP8 proteiner er -99% identiske [15 ]. Derfor er udtrykket »Nanog” ofte bruges til generisk henvise til enten protein (der er også tilfældet i dette papir). Ikke desto mindre er specificiteten af ​​de fleste kommercielt tilgængelige anti-NANOG antistoffer (som alle blev rejst mod Nanog1, tabel 1) for Nanog1 og især til NanogP8 stadig karakteriseret. Det er derfor uklart, om de formodede NANOG proteinbånd vist på Western blotting (WB), hvori ofte kun en beskåret strimmel er vist, eller den Nanog proteinfarvning vist i immunhistokemi (IHC) virkelig repræsenterer Nanog proteinet.

Endelig

, intriguingly, selvom bygger molekylmasse på Nanog protein (for både Nanog1 og NanogP8) er ~35 kD, talrige undersøgelser har rapporteret formodede NANOG proteiner migrerer på SDS-PAGE, ved tilsyneladende molekylvægt på 29 til 80 kD i ES, EF, og somatiske cancerceller (tabel 1) [2], [5], [17], [24] – [26], [46] – [59]. Endnu mere puzzlingly, det samme antistof synes ofte at detektere forskellige “NANOG ‘proteinbånd (tabel 1). Hvorvidt alle disse rapporterede formodede NANOG protein arter er sande NANOG proteiner er endnu ikke

direkte

bestemmes.

Den foreliggende undersøgelse blev foretaget for at løse de to sidste spørgsmål. Vi først giver direkte bevis for, at Nanog1 protein i NTERA-2 EF celler migrerer på 30 til ~ 100 kD. Vi viser da, at rekombinante NanogP8 proteiner også kan migrere ved -28 kD til ~180 kD. Disse resultater tyder på, at Nanog1 /NanogP8 proteiner sandsynligvis vedtage flere konformationer. Vi endelig vise, at de fleste langsigtede dyrkede somatiske kræftceller synes at udtrykke meget lave niveauer af eller biokemisk divergerende endogene NanogP8 sådan, at det ikke umiddelbart kan immunoprecipiteret ned af de 8 kommercielle anti-NanogP8 antistoffer.

Materialer og metoder

Celler og reagenser

Forskellige humane cancercellelinier, herunder prostatacancer (PC3, DU145, LNCaP), brystcancer (MCF-7), colon carcinoma (Colo320), og melanom (WM -562) -celler blev opnået fra ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA) og dyrket i de anbefalede medier indeholdende 10% varme-inaktiveret FBS (føtalt bovint serum). Teratocarcinomaceller celler (NTERA-2, klon D; CRL-1973) blev købt fra ATCC og dyrket i mTeSR ™ 1 medium (StemCell Technologies, Vancouver, Canada). Nuklear ekstraktionskit var fra Thermo Scientific (Rockford, IL). Otte anti-NANOG primære antistoffer (ABS) blev opnået fra kommercielle virksomheder (tabel 1, fig. Figur 1A). Sekundær og kontrol Abs blev købt fra Santa Cruz Biotechnology. ECL reagenser blev købt fra PerkinElmer, Inc (MA, USA). Den nuværende forskning ikke indebærer dyreforsøg eller mennesker (dvs. levende individer eller identificerbar private oplysninger). Alle andre undersøgelser præsenteret heri var den investigator-initieret og ikke kræver godkendelse fra andre tilsynsmyndigheder.

siRNA- og shRNA-medieret NANOG Knockdown eksperimenter

For siRNA knockdown eksperimenter (fig. 2 ), vi brugte siGENOME SMARTpool siRNA mod humant Nanog1 og siCONTROL ikke-targeting siRNAs opnået fra Dharmacon (Lafayette, CO). Celler udpladet 24 timer tidligere 6-brønds skåle blev transficeret med siRNA’er anvendelse af Lipofectamine 2000. 48 timer senere blev celler høstet til WB eksperimenter.

(A) Nanog siRNA eksperimenter i NTERA-2-celler. NTERA-2-celler blev transficeret med en pulje af Nanog-specifikke siRNA’er i 48 timer, høstet og anvendt til at isolere NE for WB med Kamiya Ab. De venstre og højre paneler repræsenterer på kort og lang eksponering (SE og LE henholdsvis) film (bemærk, at venstre nederste panel er den korteste eksponerede film til at illustrere den betydelige knockdown af 42 kD bånd). Lamin A /C var lastning kontrol. UT, utransficerede; NC siRNA, negativ kontrol (siCONTROL ikke-targeting) siRNAs; Nanog siRNA, SMARTpool siRNA mod Nanog. Rød, sort og blå pilespidser angiver de store 42 kD, mindre 35 kD og 48 kD-protein bands, henholdsvis som blev reduceret på Nanog knockdown. De grønne pile refererer til yderligere bånd, der også viste reduktion. (B) Den WB blev udført med CS anti-Nanog kanin pAb.

For shRNA NANOG Knockdown eksperimenter, lentivira herunder pLL3.7, Nanog-shRNA og TRC-shRNA blev produceret i 293FT emballage celler (Ciontech Laboratories, Mountain View, CA) ved hjælp af modificerede protokoller tidligere beskrevne [15], [60]. I korte, Geneticin-valgt, tidlig-passage 293FT celler (6 x 10

6/15 cm skål) blev transficeret med RRE (6 ug), REV (4 ug) og VSVg (4 ug) emballering plasmider, sammen med en lentiviral vektor (6 ug) ved anvendelse af lipofectamin 2000 til at udføre transfektionen. Ved 36-48 timer blev virusholdige medier indsamlet og frisk medium tilsættes. Efter yderligere 12-24 timer af kultur blev virale supernatanter igen opsamlet, samlet og ultracentrifugeret at producere koncentrerede virale lagre. Individuelle titere blev bestemt for GFP-mærkede virus ved hjælp HT1080 celler. Den ikke-GFP mærkede TRC-shRNA virus blev udarbejdet parallelt og tildelt kontrol (pLL3.7) titer. Målceller blev udpladet 24 timer tidligere og inficeret ved ca. 50% celletæthed og høstes til

in vitro

eller

in vivo

eksperimenter 48-72 timer efter infektion.

Bakteriel ekspression og oprensning af rekombinante NANOG (rNanog) proteiner

NanogP8

eller

Nanog1

cDNA i dyrkede NTERA-2, MCF-7, og LNCaP celler eller i primære humane PCa prøver (HPCa1, HPCa5, og HPCa6) blev amplificeret ved RT-PCR under anvendelse LDF1 /LDR1 primere (LDF1 5′-TCTTCCTCTATACTAACATGAGT-3 ‘; LDR1 5′-AGGATTCAGCCAGTGTCCA-3’) og klonet i pCR2.1 [15]. EcoRI /NotI eller BamHI /Sall fragmenter indeholdende Nanog kodende sekvens blev derefter subklonet ind i de samme sites i enten pET-28a (+) eller pET-28b (+) bakterielle ekspressionsvektor til frembringelse His-mærket fusionsproteiner. Efter insert verifikation ved restriktionsenzymfordøjelse og DNA-sekventering, blev plasmiderne anvendt til at transformere BL21 (DE)

3 kompetente bakterier at udtrykke fusionsproteinerne. Nanog protein blev induceret med 0,5 mM IPTG i 3-6 timer ved 37 ° C og bakteriel pellet blev holdt ved -80 ° C. Til oprensning blev bakterielle pellets indeholdende His-mærket Nanog protein lyseret i lysisbuffer (50 mM NaH

2P0

4, pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, proteaseinhibitorcocktail, og 1 mg /ml lysozym ), sonikeret i 10 sek (en puls). His-mærket Nanog i supernatanten blev oprenset ved nikkel perler pr producentens instruktioner (Qiagen).

WB under anvendelse af rekombinante proteiner (rNanog), helcellelysat (WCL), eller kerneekstrakt (NE)

rNanog proteiner blev opnået og oprenset som beskrevet ovenfor. WCL og NE (fra dyrkede celler) blev fremstillet som tidligere beskrevet [15]. 50-80 ug proteiner (rNanog og NTERA-2 NE) blev analyseret ved 12,5% SDS-PAGE og gelerne blev overført til en Immobilon-P overførselsmembran (Millipore, Bedford, MA). Membranen blev blokeret med 5% fedtfri tørmælk i TBST (10 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI og 0,1% Tween-20) i 1 time ved stuetemperatur og inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistof. Membraner blev vasket tre gange med TBST-buffer, derefter inkuberet i 1 time med 1:2000 sekundært antistof og fremkaldt med ECL Plus WB påvisningsreagens (PerkinElmer).

Immunopræcipitation (IP)

Recombinant proteiner (500 ug) eller NE (800 ug eller afhængigt af eksperimentelle formål) blev inkuberet med de angivne anti-NANOG antistoffer natten over ved 4 ° C. opløsningen blev derefter inkuberet med protein A /G-agarose (Sigma, MO, USA) i yderligere 1 time ved 4 ° C. Efter inkubering blev perlerne vasket tre gange med RIPA-buffer. Proteiner bundet til protein A-agarose blev elueret med SDS-PAGE loading buffer og kogt i 8 min og udsat for SDS-PAGE.

Dialyse genfoldning eksperimenter

For at isolere og oprense en stor mængde rNanog, bakterielle pellets blev sonikeret 6 gange med 10 sekunder pulser. Sonication opløsning blev centrifugeret ved 10.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Pelleterne blev vasket med koldt PBS i tre gange. Det udfældede materiale var inklusionslegeme af rNanog protein. At opløse inklusionslegemet, blev en buffer indeholdende 7 M urinstof anvendes, og opløsningen blev derefter udsat for dialyse mod buffere med 1,5 M, 0,6 M, 0,3 M og 0,1 M urinstof (i 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 7,0). Dialyseopløsningen blev udsat for SDS-PAGE at fastslå eksistensen af ​​opløseligt Nanog protein.

Nanog protein identifikation (ID) ved massespektrometri (MS) analyser

Tre sæt MS-baserede protein ID eksperimenter blev udført på enten rNanog proteiner eller NE fremstillet ud fra NTERA-2-celler. I

første

ID eksperiment, vi immunopræcipiterede en stor mængde NTERA-2 celle NE (ca. 2 mg i alt) med R nye mål) med mobile faser af A (0,1% myresyre i vand) og B (0,1% myresyre i methanol) blev anvendt, med en gradient af 5-95% af fase B i løbet af 45 minutter efterfulgt af 95% af fase B i 5 minutter ved 200 nl /min. Peptider blev direkte electrosprayed ind i (LTQ Oorbitrap Velos (Thermo Scientific) ved hjælp af en nanospray kilde. Den LTQ blev drevet i data-afhængige tilstand for at erhverve fragmentering spektre af de 20 stærkeste ioner under direkte kontrol Xcalibur software (Thermo Scientific). Opnået MS /MS-spektre blev søgt mod target-lokkedue Menneskelig refseq database i Proteome Discoverer 1.2 interface (Thermo Fisher) med Mascot algoritme (Mascot 2.1, Matrix Science). Variabel ændring af Acetylering (lysin), di-Glycin (lysin), Phosphorylering ( serin og threonin) og Oxidation (methionin) blev tilladt. også statisk ændring af DeStreak (cystein) var tilladt. forløberen masse tolerance var begrænset inden for 10 ppm med fragment masse tolerance på 0,5 dalton og højst to ubesvarede skel tilladt. Tildelt peptider blev filtreret med 5% falsk opdage sats og med forbehold af manuelle kontroller.

i

tredje

ID eksperiment, rNanog1 /rNanogP8 proteiner renset og gel skiver indeholder forskellige proteinbånd blev brugt i MALDI -TOF /TOF identifikation som beskrevet tidligere [62]. Tryptiske fordøjelser blev analyseret ved anvendelse af en 4700 Proteomics Analyzer MALDI-TOF /TOF (AB Sciex, Foster City, CA). Prøver blev afsaltet med μC18 ZipTips (Millipore, Billerica, MA) ved eluering direkte på MALDI target hjælp matricen α-cyano-4-hydroxykanelsyre ved 5 mg /ml i 67% acetonitril /0,1% trifluoreddikesyre. MS og MS /MS-spektre blev erhvervet automatisk ved hjælp af 4000-serien Explorer V 3.0 RC1. Op til 20 toppe med S /N 20 blev udvalgt til MS /MS fragmentering, eksklusive matrix, trypsin, og keratin toppe. Yderligere peak behandling og database søgning blev udført ved hjælp af GPS Explorer v3.5. MASCOT V2.0 eller V2.2. Spectra blev søgt mod Swiss-Prot database, herunder Humane sekvenser (september 1, 2009, 20495 poster). Søgeparametrene valgt var spaltning med trypsin /P med op til 2 ubesvarede spaltninger, faste modifikation af carbamidomethylation af cystein og variable modifikationer af protein N-terminal acetylering, methionin oxidation og pyroglutaminsyre modifikation af peptid N-terminale glutaminrester. Databasesøgningen anvendes 50 ppm mass tolerance for monoisotopiske MS masserne og 0,2 Da for MS /MS, op til 100 toppe med minimal S /N 15 blev selekteret for MS, og op til 65 fragmentioner med minimal S /N 3. Søgningen output kombinerer scoringer fra MS søgning og MS /MS søgning ved hjælp af en probabilistisk MOWSE algoritme. Den MASCOT score er defineret som -10 * log P, hvor P er sandsynligheden for, at den observerede kampen er en tilfældig begivenhed. Den MASCOT score 56, som svarer til p. 0,05 er valgt som cutoff for en betydelig hit, og de proteiner, der overstiger cutoff værdi rapporteres

Resultater

Syv af de otte anti-Nanog antistoffer opdage, om WB, den store 42 kD og mindre 35 kD bånd i NTERA-2 NE

Menneskelig

Nanog1

gen (gi 13.376.297), lokaliseret på Chr. 12p13.31 og primært udtrykkes i ES og EC-celler, har en 915-bp åben læseramme (fig. S1A). Det koder for et 305-aa protein, der almindeligvis omtales som Nanog (fig. 1A). Humant Nanog1 protein forudsiges at have en molekylmasse på ~35 kD. Interessant nok har formodede NANOG proteiner migrerer ved tilsyneladende molekylmasser på 29 til 80 kD på WB blevet rapporteret i ES, EF, og somatiske cancerceller (tabel 1). Det er imidlertid uklart, om disse rapporterede NANOG proteinarter virkelig repræsenterer NANOG proteiner. For at løse dette problem, og til direkte at bestemme den molekylære masse (r) på endogene Nanog protein, vi uropført omfattende WB analyser i EF NTERA-2-celler ved hjælp af 8 kommercielle anti-Nanog (dvs. anti-Nanog1) antistoffer (Abs) rettet mod forskellige regioner af det humane Nanog proteinet (figur 1A;. tabel 1, de første 8 Abs). Blandt de 8 anti-NANOG Abs, er fire [Kamiya Rb pAb, SC (Santa Cruz) ged pAb N17, Cell Signaling (CS) Rb pAb og Rb mAb] rettet til ND, to (SC Rb pAb H-155 og R D ged pAb) til C-terminalen, og en (BioLegend Rb pAb) til HD (homeodomænet) mens en anden (eBioscience mAb) er dannet mod fuld længde human Nanog1 protein (figur 1A)

WB resultaterne viste, at forskellige antistoffer viste tydelig reaktivitet og hvert antistof registreres flere bands i NTERA-2 NE (vi fokuseret på det nukleare udtryk som Nanog er en nuklear transskription faktor) med MW spænder fra -28 kD til -100 kD (fig . 1B-H). Konkret resultaterne viste, at:. 1) den eBioscience mAb viste

reneste

og de fleste

specifik

reaktivitet, afsløre kun en stærk bånd på ~42 kD (Fig 1B, rød pilespids) og en svag bånd af ~35 kD (fig. 1B, sort pilespids) i NE uden immunreaktive bånd i cytosolen med 3 min eksponering af filmen (fig. 1B). På den anden side eBioscience mAb udviste den laveste følsomhed blandt de 8-antistoffer. Den 35 kD-båndet og en anden -65 kD bånd i NE stod klart efter længere eksponeringstid (15 min;. Figur 1B). 2) Kamiya pAb viste

den anden reneste

reaktivitet (Fig. 1C). Efter kort eksponering (10 sek), det opdaget en stærk bånd på 42 kD med en meget svagt bånd på 35 kD i NE (figur 1C,. Røde og sorte pilespidser, henholdsvis). I cytosolen, detekteres det 42 kD-båndet og flere andre bånd (fig. 1C). Ved længere eksponering (2 min), den Kamiya pAb opdaget også tre øverste bånd på ~48 kD, -65 kD og -90 kD i både NE og cytosol (Fig. 1C, grønne pile i højre panel). 3) Både CS Rb pAb og mAb var

de mest følsomme

antistoffer, således at de opdaget de fremtrædende 42 kD og 35 kD bånd med kun 1-5 sek eksponering (fig. 1D). Begge antistoffer detekterede også flere yderligere bånd (fig. 1D, grønne pile). 4) SC ged pAb (N17) opdaget en indlysende 42 kD bånd og et svagt 35 kD bånd, sammen med to øvre bånd af ~55 kD og ~58 kD (fig. 1E). 5) Biolegend Rb pAb var den “mest beskidte” Ab og fundet en række stærke bands i cytosolen og kun svagt 42 kD bånd i NE (fig. 1 F, rød pil). 6) SC Rb pAb (H-155) detekteres den indlysende 42 kD-båndet og den svagere 35 kD bånd (fig. 1G, røde og sorte pilespidser henholdsvis), sammen med flere andre bånd ved 100 kD, 70 kD, 58 kD og -28 kD (fig. 1G, grønne pile). 7) Endelig R .. D ged pAb opdaget en tilsyneladende bånd på 42 kD og et mindre bånd på 35 kD (fig 1H, røde og sorte pilespidser, henholdsvis), sammen med flere andre bands (Fig 1H, grønne pilespidser) .

sammenfattende denne omfattende WB analyse ved hjælp 8 anti-NANOG Abs og NTERA-2 NE har afsløret, at: 1) bortset fra BioLegend Ab, de andre 7 anti-NANOG Abs alle

almindeligt

genkende en stor 42 kD og et mindre 35 kD protein band; 2) Tre antistoffer rejst mod den N-terminale ende, dvs. Kamiya Rb pAb, CS pAb og CS-mAb, giver ren WB resultater på kort eksponering af film; 3) med længere eksponering, alle antistoffer opdage yderligere protein bands spænder fra -28 kD til 100 kD. Men forskellige Ab’er afsløre forskellige mønstre af reaktive proteinbånd; 4) Med hensyn til følsomhed, CS mAb og CS pAb er de mest følsomme efterfulgt af Kamiya Ab mens eBioscience mAb er den mindst følsomme; 5) BioLegend anti-Nanog Ab registrerer ikke de 42 kD som det store protein band i NTERA-2 NE; og 6) Forskellige antistoffer kan fortrinsvis genkende forskellige protein bands. For eksempel Kamiya pAb, men ikke CS pAb eller mAb reagerede med 48 kD-båndet.

siRNA-medieret knock-down afslører 42-kD proteinbånd som den dominerende Nanog protein isoform i NTERA-2 celler

Da det forudsagte Nanog protein er ~35 kD, kan vi udlede, at den mindreårige 35 kD protein band almindeligt fundet på WB sandsynligvis er Nanog protein. For at bekræfte denne slutning og afgøre, om den fremherskende 42 kD og enhver af de yderligere bånd også er NANOG proteiner, udførte vi siRNA knock-down eksperimenter i NTERA-2-celler. Som vist i fig. 2A Kamiya Rb pAb konsekvent detekteret den stærke 42 kD proteinbånd, der faldt som reaktion på Nanog siRNA. Desuden minor 35 kD-båndet og flere andre svagere bånd migrerede ved 48 kD, 65 kD, 75 kD og 90 kD alle faldt i Nanog siRNA-behandlede celler (fig. 2A). Da vi udførte WB ved hjælp af CS Rb pAb, den Nanog siRNAs også slået ned 42 kD og 35 kD bånd (fig. 2B). Desuden blev en øvre 65 kD bånd reduceres også (fig. 2B). Bemærk, at CS pAb ikke registrerede 48 kD eller andre øvre bånd undtagen 65 kD bånd (fig. 2B), i overensstemmelse med de tidligere WB resultater med CS pAb og mAb (fig. 1D). Kollektivt, siRNA knock-down eksperimenter antyder, at

den Nanog protein i NTERA-2-celler synes at migrere på denaturerende SDS-PAGE, på flere molekylære masser heraf ca.

35

42

,

48

,

65

,

75

, og

90

kD med 42-kD bånd er det dominerende “isoform”

.

Karakterisering af NANOG protein arter i NTERA-2 celler ved immunopræcipitation (IP) efterfulgt af massespektrometri (MS) identifikation (ID)

for at underbygge siRNA knockdown resultater, vi udførte to sæt MS-baserede protein ID eksperimenter.

I første

, vi udførte IP forsøg med 500 ug NE fra NTERA-2 og somatiske kræftceller og med 5 anti-NANOG Abs, dvs. eBioscience mAb, Kamiya pAb, CS Rb mAb, SC pAb H155 , og R .. figur S2A-B; data ikke vist). Alle 5 antistoffer immunopræcipiterede 42 kD Nanog band i NTERA-2 NE. For eksempel, når IP blev gjort med Kamiya pAb efterfulgt af WB hjælp af enten eBioscience mAb (figur 3A, bane 9.) Eller R . Figur 3B, bane 9). Når IP blev gjort med SC pAb H-155, rettet mod den C-terminale ende af Nanog, efterfulgt af WB hjælp af enten eBioscience mAb (fig 3C, bane 8). Eller R & D ged pAb (. Fig S2B), de 42 kD protein blev immunpræcipiteret i NTERA-2 NE. Som vist i fig.