PLoS ONE: Den Redning af miR-148a Expression i kræft i bugspytkirtlen: en uhensigtsmæssig Terapeutisk Tool

Abstrakt

MikroRNA’er er små ikke-kodende RNA, der fysiologisk modulerer proteiner udtryk, og regulerer mange cellulære mekanismer. Ændring af microRNA ekspression er blevet beskrevet i cancer og er forbundet til tumor initiering og progression. Den microRNA 148a (miR-148a) er ofte nedreguleret i cancer. Vi har tidligere vist, at dets nedregulering ved DNA hypermethylering er en tidlig begivenhed i pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) carcinogenese, hvilket tyder på en tumor undertrykkende funktion. Her undersøger vi den potentielle rolle for miR-148a overekspression i PDAC som et terapeutisk værktøj. Vi først indberette konsekvenserne af miR-148a overekspression i PDAC cellelinjer. Vi viser, at miR-148a overekspression har nogen dramatisk effekt på celledeling og celle kemo-følsomhed i fire godt beskrevet PDAC cellelinjer. Vi undersøger også modulering af protein-ekspression af en global proteomisk tilgang (2D-DIGE). Vi viser, at på trods af sin massive overekspression, miR-148a svagt modulerer proteinekspression, hvilket forhindrer identifikation af protein mål i PDAC cellelinjer. Vigtigere,

in vivo Salg data viser, at modulering MIR-148a ekspression enten i de epitel tumorceller og /eller i tumormikromiljøet ikke hæmmer tumorvækst. Tilsammen viser vi her, at miR-148a ikke påvirker PDAC spredning både

in vitro

in vivo

dermed antyder en svag potentiale som et terapeutisk værktøj.

Henvisning : Delpu Y, Lulka H, ​​Sicard F, Saint-Laurent N, Lopez F, Hanoun N, et al. (2013) Den Redning af miR-148a Expression i kræft i bugspytkirtlen: En Upassende terapeutisk værktøj. PLoS ONE 8 (1): e55513. doi: 10,1371 /journal.pone.0055513

Redaktør: Guenter Schneider, Technische Universität München, Tyskland

Modtaget: Januar 6, 2012; Accepteret: 2 Jan 2013; Udgivet: 31 januar 2013

Copyright: © 2013 Delpu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Institut National de la Santee et de la Recherche Medicale (INSERM, www.inserm.fr) og foreningen pour la Recherche sur le Cancer (ARC, www.arc-cancer.net). Proteomics undersøgelser blev støttet af Toulouse Proteomics Infrastruktur med økonomisk støtte af “Association pour la Recherche sur le Cancer» (Arctic Areca Program). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er den fjerde hyppigste dødsårsag ved kræft i de vestlige lande, mens det kun udgør 3% af nye tilfælde hvert år [1]. PDAC prognose ofte forklares med mangel på tidlige specifikke diagnostiske markører og ved fravær af effektive behandlinger. Til dato, kirurgi er den eneste helbredende tilgang til PDAC forvaltning, men vedrører en lille delmængde af patienter på grund af PDAC aggressivitet og invasiv fænotype. For de resterende patienter diagnosticeret med lokalt fremskreden eller metastatisk PDAC, gemcitabin kemoterapi er standard palliativ behandling med beskeden effekt på overlevelse [2]. Derfor har bemærkelsesværdige undersøgelser blevet udført for at belyse de centrale begivenheder kørsel bugspytkirtlen carcinogenese, at identificere nye mål og udvikle tumor-målrettede behandlinger [3], [4]. Genetiske og epigenetiske ændringer er blevet beskrevet som et tidligt begivenhed i udviklingen af ​​PDAC [5]. I det sidste årti, betydelige værker fremhævede virkningen af ​​sådanne molekylære ændringer på microRNA ekspression i PDAC. MikroRNA’er er små ikke kodning RNA, der hæmmer oversættelsen af ​​deres mål mRNA. De spiller en vigtig rolle i udviklingen af ​​kræft, invasionsevne og modstandsdygtighed over for kemoterapi [6].

Vi har tidligere vist, at microRNA-148a udtryk (miR-148a) nedreguleres tidligt under PDAC udvikling ved hypermethylering sin genomisk DNA sekvens [7]. Andre undersøgelser rapporterede nedregulering af miR-148a udtryk i andre kræftformer (

dvs.

:. Kolorektale, esophageal, gastriske kræft og kræft metastaser) [8], [9], [10], [11]. Adskillige miR-148a mRNA mål blev beskrevet i forskellige typer af kræft. Disse mål omgruppere cellecyklus, apoptose eller DNA methylering effektorer.

Tidligere undersøgelser fremkaldte en tumor undertrykkende effekt som følge af en overekspression af miR-148a i colorectal og gastrisk cancer-afledte cellelinjer [8], [10 ]. Derfor til denne undersøgelse sigter afgøre, om at genoprette miR-148a udtryk påvirkninger PDAC spredning både

in vitro

in vivo

og derfor kunne foreslås som et terapeutisk værktøj.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Humane PDAC Capan-2 og IMIM-PC2 cellelinier blev dyrket i RPMI-medium suppleret med 100 mL /L føtalt kalveserum, L-glutamin (2 mM ) (Life Technologies), antibiotika og antimykotika cocktail (Life Technologies) og Plasmocin® (5 ug /ml) (InvivoGen). MIA Paca-2 og PANC-1 PDAC celler og humane embryonale nyre HEK-293FT celler blev dyrket i DMEM indeholdende 4,5 g /l glucose (Life Technologies), 100 mL /L føtalt kalveserum, L-glutamin, antibiotika, Fungizone® og Plasmocin® (InvivoGen). Humane PDAC-afledte BxPC-3-celler blev dyrket i DMEM indeholdende 1 g /l glucose (Life Technologies), 100 mL /L føtalt kalveserum, L-glutamin, antibiotika og antimycotiske cocktails. Human pancreas nestin-positive epithelceller (HPNE) blev dyrket i 75% DMEM 4,5 g /l glucose (Life Technologies), 25% Medium M3 Base (Incell Corp.), føtalt bovint serum 5%, 10 ng /ml humant rekombinant EGF ( Sigma-Aldrich) og 750 ng /mL gentamycin (Life Technologies). Alle cellelinier blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) undtaget for Æske med HDPE-celler og HPNE celler, som er venlige gaver fra Dr. M.S. Tsao (University of Toronto, Canada) og Dr. M. Ouellette (University of Nebraska Medical Center, Omaha, USA), henholdsvis [12], [13]. IMIM-PC2 celler blev opnået fra Dr. FX Real (spansk National Cancer Research Centre, Madrid, Spanien).

Cell transfektion

Til alle

in vitro

eksperimenter, miR- 148a pre-miR ™ miRNA forstadier (Ambion) ved 25 nM og 50 nM blev transficeret under anvendelse siPORT ™ NeoFX ™ Transfektion Agent (Ambion) ifølge producentens instruktioner. Cy ™ 3 farvestof-mærkede Pre-miR blev anvendt som negativ kontrol og blev transficeret under anvendelse af de samme betingelser.

Cellecyklusanalyse ved flowcytometri

transficerede Capan-2-celler blev opsamlet, skyllet en gang i phosphatpufret saltvand (PBS) og fikseret i iskold 70% ethanol natten over ved 4 ° C. Cellerne blev opsamlet ved centrifugering ved 1.000 g og skyllet med PBS. Celler blev mærket med propidiumiodid (Life Technologies) efter producentens anbefalinger. Cellecyklusfordeling blev vurderet ved hjælp af BD FACS Calibur apparat (Beckton Dickinson) og Cell quest pro software (Beckton Dickinson) som beskrevet af Hanoun

et al.

[14].

2D-DIGE elektroforese

Cell lysis blev udført i Urea 8M, Thiourinstof 2M, CHAPS 4%, pH 8,5. Efter oprydning nedbør (2D Clean Up kit, GE Healthcare) blev proteiner resuspenderet i 2D-DIGE prøve buffer (Urea 8M, Thiourinstof 2M, CHAPS 4%, pH 8,5). Proteinkoncentrationen blev bestemt med 2D Quant kit (GE-Healthcare). Halvtreds mikrogram proteiner blev mærket med 400 pmol CyDye DIGE Fluor Minimal Farvestoffer (GE Healthcare) og inkuberet på is i mørke i 30 minutter i overensstemmelse med producentens anvisninger. Reaktionen blev standset ved tilsætning af 1 pi af 10 mM lysin og inkuberet på is i 10 min. Det differentielt Cy-3 og Cy-5 mærkede prøver blev blandet med Cy-2 mærkede interne standard (prøve består af lige alikvoter af hver prøve af forsøget) og isoelektrisk fokusering (IEF) re-Hydratation puffer (Urea 8M, Thiourinstof 2M , CHAPS 2%, 10 mM DTT, 1,2% IPG (Immobiliseret pH-gradient), pH 4-7, GE Healthcare) tilsat op til 350 uL. På 2D-DIGE analyse blev IEF udført under anvendelse af en IPGPhor 2 apparat (GE Healthcare) ifølge producentens anbefalinger med immobiliseret pH-gradient (IPG) pH 4-7, 18 cm. Strimler blev først inkuberet i ækvilibreringsbuffer (Urea 6 M, SDS 2%, Tris-HCI 50 mM pH 8,6, glycerol 30%, bromphenolblåt spor) indeholdende 1% DTT i 15 minutter og derefter i den samme puffer med 4,5% iodacetamid, i 15 minutter i mørke. Strimlerne blev fyldt på toppen af ​​12,5% acrylamidgeler og kørte ved 1 W /h i 1,5 timer og ved 15 W /h, indtil bromphenolblåt når bunden-enden af ​​gelen. De geler blev scannet ved hjælp af en Typhoon trio Imager (GE Healthcare) ved 100 um opløsning med X ex /em af 488/520, 532/580 og 633/670 nm for Cy-2, Cy-3 og Cy-5, hhv. Billede analyse blev udført ved hjælp DeCyder 6.5 software (GE Healthcare).

plasmider

pLVMND-SLuc plasmid koder for udskilte Gaussia Luciferase (Gluc) er venligst leveret af Cayla-InVivoGen (Toulouse, Frankrig ). Lentiviral ekspressionsvektor, der koder miR-148a og copGFP (pMIRNA1-miR148a) eller copGFP alene (pMIRNA1-GFP) blev opnået fra Biovalley (Marne-la-Vallée, Frankrig). PLenti6-TR, der koder for TET repressoren, blev opnået fra Life Technologies. For den inducerbare ekspression af MIR-148, til to delvist komplementære oligonucleotider svarende modne MIR-148a eller en kontrol krypteret miR (MIR-CT) blev hybridiseret og klonet ind i pcDNA6.2-GW /emGFP-miR vektor (Life Technologies) før rekombination ind pLenti4 /TO /V5 DEST vektor (Life Technologies) ved hjælp Gateway® strategi. For lentivectors produktion blev emballage plasmider pHCMV-G, kodning for VSV-G-protein, og pCMVΔ8.91, kodning for HIV-1 accessoriske proteiner, venligst doneret af Dr. A. Dubart-Kupperschmitt (Paris, Frankrig).

Lentiviral vektor produktion

Alle replikationsdefekte, selvstændige inaktivere lentivirusvektorer blev genereret i en BSL-3 anlæg (Vectorology platform, INSERM U1037 Cancer Research center i Toulouse, Toulouse, Frankrig) som tidligere beskrevet af Torrisani

et al.

[15]. Kort fortalt blev transient transfektion af HEK-293FT celler med emballage og lentivirale vektor plasmider udføres ved anvendelse af calciumphosphat-udfældning. pLenti4 /TO /GFP-miR-148a, pLenti4 /TO /GFP miR-CT blev brugt til at opnå lentivirale partikler koder inducerbare miR-148a eller miR-CT (nemlig, LV-TO-miR-148a eller LV-TO-miR- CT henholdsvis). På den anden side, blev pMIRNA1-miR148a og pMIRNA1-GFP anvendes til opnåelse af lentivirale partikler konstitutivt koder MIR-148a eller MIR-CT (LV-MIR-148a eller LV-GFP, henholdsvis). PLenti6-TR og pLVMND-SLuc plasmider blev anvendt til at opnå lentivirale partikler koder Tet-repressoren eller den secernerede luciferase (LV-TR eller LV-Gluc, henholdsvis). Alle partier blev verificeret replikativ virus-fri. De virale titere blev bestemt på HT-1080-celler og udtrykt i transduktion unit /ml (TU /ml) som beskrevet andetsteds. Desuden blev vektor koncentrationer kvantificeret ved p24-ELISA (Innotest, Ingen, Paris).

Frembringelse af MIA PaCa-2 stabil cellelinie over-udtrykkende MIR-148a Salg

MIA PaCa-2-celler blev inkuberet med LV-TR lentivirale partikler (infektionsmultiplicitet = 5) i 24 timer og efterfølgende udvalgt med blasticidin (Invivogen, Toulouse, Frankrig) ved 100 ug /ml i 2 uger og klonet ved seriel fortynding til opnåelse MIA PaCa-2 TR-celler. MIA PaCa-2 TR-celler blev yderligere transduceret af LV-Gluc (infektionsmultiplicitet = 5) og klonet ved seriel fortynding til opnåelse MIA Pac-2 TR-gluc-celler. De sidstnævnte celler blev inkuberet med LV-TO-MIR-148a eller LV-TO-MIR-CT (infektionsmultiplicitet = 5) i 24 timer og selekteret med zeocin (Invivogen) ved 100 ug /ml i 3 uger og klonet ved seriel fortynding for at generere MIA PaCa-2 TR-gluc miR-148a og MIA PaCa-2 TR-gluc miR-CT-cellelinjer, hhv. En optimal doxycyclin koncentration på 1 ug /ml blev bestemt til at inducere en maksimal ekspression af MIR-148a. De forskellige stabile cellelinier blev derefter konstant udvikling i nærvær eller fravær af doxycyclin.

Måling af miR-148a udtryk ved QRT-PCR

Celler blev først kortvarigt transficeret eller stabilt transduceret som beskrevet over. Totalt RNA blev isoleret fra cellelinier med TRlzol-reagens (Life Technologies) ifølge leverandørens anvisninger. RNA-koncentrationen blev målt med en NanoDrop ND-1000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Den miScript PCR systemet (Qiagen) blev anvendt ifølge producentens instruktioner til at kvantificere modne microRNA fra 1 ug totalt RNA. U6 og 5S RNA blev brugt som interne kontroller. cDNA prøver blev fortyndet 1 i 100 for microRNA afsløring eller U6 og 1 i 10.000 for 5S RNA detektion. Duplicate QRT-PCR-assays blev udført i en StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) med SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Relative mængder af miRNA blev beregnet ved den sammenlignende tærskel cyklus (CT) metode som 2-ACt, hvor ACt = CTmiRNA -. CT geometriske gennemsnit af U6 og 5S

spredning assay

MIR-148a prækursor eller Cy ™ 3 farvestofmærkede negativ kontrol precursor transficerede celler blev podet ved 6 × 10

3 celler pr brønd af en 96 brønd skål og dyrket i komplet medium. Antallet af levedygtige celler blev bestemt ved kolorimetrisk metode under anvendelse af CellTiter 96® Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) ifølge producentens instruktioner på dag 4. for proliferation måling blev celler podet ved 5 x 10

4 celler pr brønd af en 35 mm skåle. Celler blev dyrket i komplet medium suppleret med 1 ug /ml doxycyclin. Fem hundrede nanogram af doxycyclin blev tilsat ved 48 timer for at forhindre dets henfald i dyrkningsmedium. Celler blev talt med en Coulter tæller model ZM (Beckman Coulter) efter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 h kultur.

Gemcitabin følsomhed assay

Tyve fem tusind eksponentielt voksende MIA PaCa -2 celler stabilt udtrykker mIR-148a eller kontrol microRNA dyrket med eller uden doxycyclin blev udpladet i 35 mm skåle. Fireogtyve timer senere blev cellerne behandlet med gemcitabin (Eli Lilly) i forskellige doser i området fra 1 x 10

-9 M til 1 x 10

-4 M. Efter 72 timers behandling, blev cellerne talt under anvendelse Coulter tæller model ZM (Beckman Coulter). Gemcitabin “Lethal Concentration 50” (LC

50) er koncentrationen af ​​gemcitabin, for hvilken 50% af de behandlede celler døde forholdsvis til ubehandlede celler på 96 timer. Til måling af gemcitabin følsomhed i celle transient overudtrykkende MIR-148a, 1000 af eksponentielt voksende PDAC celler transient overudtrykkende MIR-148a eller en kontrol microRNA (MIR-CT) blev udpladet i 96-brønds plade. Celler blev behandlet med forskellige doser af gemcitabin i området fra 1 x 10

-9 M til 1 x 10

-4 M i 72 timer. For hver cellelinie blev cellelevedygtighed vurderet ved kolorimetrisk metode, sammenlignet med levedygtigheden målt i 1 × 10

-9 M behandlede brønde og er repræsenteret som en procentdel af overlevende celler.

Migration og invasion assays

Et hundrede tusinde eksponentielt voksende celler overudtrykker miR-148a eller GFP reporter protein blev serum-udsultet i 24 timer og podet i 24 godt plade mellemstore indsatser (8 um porøse 24 brønds format indsætter for migration assays og Biocat Matrigel invasion kamre til invasion assays, BD Falcon) i henhold til producentens anvisninger. Efter 15 timer blev migrerede celler farvet med en 1% krystalviolet i 20% methanol-opløsning, lyseret og cellulær densitet blev bestemt ved optisk tæthed måling af cellelysater ved 560 nm. Resultaterne er udtrykt som en procentdel af migrere eller invadere miR-148a over-udtrykkende celler sammenlignet med GFP-udtrykkende celler.

ortotopisk celle graft

Otte uger gamle SCID /beige CB 17 utæt mus ( TAKONIC) blev anvendt til celle graft eksperimenter. Hver mus modtog 12 × 10

6 af eksponentielt voksende MIA PaCa-2-celler stabilt overudtrykker MIR-148a i 100 pi PBS injiceret i halen af ​​bugspytkirtlen. Injektioner blev udført med en 29 gauge lymfografi katetersystem med en 29 gauge insulin nål. Mus podet med MIR-148a udtrykkende celler modtog vand

ad libitum

suppleret med sucrose (25 g /liter) og doxycyclin (2 g /l). Kontrolmus modtog vand

ad libitum

suppleret med saccharose alene (25 g /l). Tredive dage efter xenograft blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet, vejet og målt. Tumorvolumen blev bestemt ved formlen ((Tumor længde) × (tumor Bredde

2)) /2. Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i diagrammet for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr i INSERM. Alle operation blev udført under isofluran anæstesi, og blev gjort alt for at minimere lidelse. Alle protokoller herunder dyr blev godkendt af ANEXPLO etik udvalg. Makroskopisk observation af tumorer blev udført af en dygtig patolog.

In vivo

tumor transduktion af MIA PaCa-2 tumorer

ortotopisk tumorer blev etableret i SCID CB17 mus pancreas ved injektion af 12 × 10

6 af eksponentielt voksende MIA PaCa-2-Gluc (som beskrevet ovenfor). Tumorer blev dyrket i 15 dage inden injektion af 250 ng p24 af LV-miR148a lentivector under anvendelse af en 29 gauge lymfografi katetersystem med en 29 gauge insulin nål. LV-GFP blev injiceret i kontrolmus. Tumorprogression før og efter transduktion blev overvåget ved measurment af Gluc hos mus serum (som beskrevet nedenfor) og ved abdominal palpering.

Luciferaseaktivitet i mus serum

Luciferaseaktivitet blev målt fra mus serum . Blod blev opsamlet fra retro-orbital sampling hjælp Pasteur kapillarpipetter (VWR) forfyldt med 10 pi af en 20% EDTA-opløsning. Blodprøver blev holdt på is indtil centrifugering. Prøver blev centrifugeret 3.000 g i 15 minutter ved 4 ° C og serum blev opsamlet og opbevaret -20 ° C indtil anvendelse. Luciferaseaktivitet blev bestemt ud fra 5 pi serum og 45 pi af en 50 pM coelenterazin opløsning (Fluka analytisk) på en Luminoskan ascent indretning (Thermo Scientific).

Statistisk analyse

Resultater udtrykkes som middelværdien ± standardfejl. Den statistiske signifikans af forskelle blev målt med Mann-Whitney non-parametriske test med en

s Drømmeholdet værdi 0,05 betragtet som statistisk signifikant. Symbolet * angiver en

s

værdi 0,05, ** angiver en

s

værdi 0,01 og *** indikerer en

s Drømmeholdet værdi. 0,005

Resultater

Effekt af forbigående miR-148a overekspression på PDAC cellelinje vækst

tidligere rapporteret Vi, at miR-148a udtryk er undertrykt ved DNA hypermethylering sin genomiske sekvens i PDAC celle linjer og tumorer [7]. Man kunne spekulere, at tabet af MIR-148a-ekspression er afgørende for PDAC udvikling. For at vurdere tumor undertrykkende virkninger af MIR-148a i PDAC, Capan-2, PANC-1, blev MIA PaCa-2 og BxPC-3 PDAC cellelinier transficeret ved en MIR-148a oligonukleotid-precursor (MIR-148a) eller en kontrol precursor ( mIR-CT). HPNE celler, som er humane pankreatiske celler, som viser en normal fænotype blev anvendt som “ikke-kræft” kontrolceller. Celleproliferation blev målt ved kolorimetrisk metode 4 dage efter transfektion. MIR-CT transficerede celler blev anvendt som intern reference for hver cellelinje (figur 1A). Transfektionseffektiviteten blev bedømt for hver cellelinje ved Cy3 fluorescensmåling og nåede 90-100% (data ikke vist). Resulterende MIR-148a-ekspression blev målt ved QRT-PCR (figur S1A). MIR-148a overekspression i HPNE pancreas normale celler inducerede ikke væsentlige ændringer i celleproliferation. Tilsvarende blev ingen signifikant ændring i celleproliferation blev observeret i de fire PDAC cellelinjer sammenlignet med Cy3 kontrol transficerede celler. Parallelt blev cellecyklusfordeling i Capan-2-celler bestemt ved FACS-analyse (figur 1B). Ifølge de manglende virkninger vedrørende cellulær proliferation, blev ingen ændring i cellecyklusfordeling observeret i MIR-148a transficerede celler sammenlignet med MIR-CT-celler. Disse resultater indikerer, at transient MIR-148a overekspression har ingen særlig indvirkning på celleproliferation af fire PDAC cellelinier.

(A) Capan-2, PANC-1, MIA PaCa-2 og BxPC-3 PDAC -afledte cellelinjer og ikke-kræft HPNE cellelinie blev transient transficeret med mIR-CT eller mIR-148a forstadier. Fire dage efter transfektion blev cellelevedygtighed bedømt ved kolorimetriske metoder. For hver cellelinie blev MIR-148a-cellelevedygtighed den sammenlignet med MIR-CT cellelevedygtighed (100%). Resultaterne er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg (± SEM) og er udtrykt som procent af cellelevedygtighed af kontrolceller. (B), blev cellecyklusfordeling målt ved propidiumiodidfarvning efterfulgt af FACS-analyse 72 timer efter transfektion af Capan-2-celler med MIR-CT eller MIR-148a forstadier.

Virkning af stabile miR- 148a overekspression på PDAC cellelinje adfærd

Ud over forbigående transfektionsforsøg, genereret vi Tet-ON-baserede lentivirale partikler til stabil ekspression af miR-148a for at forhindre hurtig oligonukleotid forfald og at tillade en langsigtet opfølgning -up af cellulære begivenheder i PDAC cellelinier. Vi transduceret MIA PaCa-2-celler på grund af deres lave ekspressionsniveau af endogen MIR-148a [7]. I disse celler doxycyclinbehandling fører til en femdobbelt stigning i MIR-148a ekspression, sammenlignet med MIR-CT over-udtrykkende celler (figur S1B). Imidlertid stabil ekspression af MIR-148a ikke føre til væsentlige ændringer i cellulær proliferation i disse celler, i sammenligning med kontrolceller (figur 2). Derudover, migration og invasion potentiale af celler over-udtrykkende MIR-148a blev målt og sammenlignet med kontrolceller (fig S2). Her observerede vi, at miR-148a har overekspression ikke ændre disse to cellulære funktioner i vores MIA Paca-2-cellelinje model. Tilsammen viser vi, at på samme måde som forbigående overekspression, langvarig udtryk for miR-148a er ineffektiv for hæmning af PDAC celledeling og ikke påvirker celle adfærd

in vitro

.

MIA PaCa-2-celler blev inkuberet med inducerbar lentivirusvektorer koder for scramble microRNA (mIR-CT) eller mIR-148a (mIR-148a). MIA PaCa-2 miR-CT eller miR-148a spredning sats blev vurderet i nærvær eller fravær af doxycyclin i dyrkningsmedium. For hver betingelse blev celletælling udført hver 24. time og sammenlignes med antallet af adhærente celler på dag 1. Resultaterne er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg (± SEM).

Gemcitabin følsomhed PDAC cellelinjer over-udtrykkende mIR-148a

Det er tidligere blevet foreslået, at microRNA kan påvirke kemosensitivitet ved at målrette lægemiddeltransportere eller forringe cellulær pathway afgørende for metabolisme lægemiddel eller celleoverlevelse [16]. Som beskrevet ovenfor, gemcitabin er referencen kemoterapi for PDAC. Vi vurderede, om miR-148a deltager til PDAC celler følsomhed mod dette stof. Vi først bemærket nogen signifikant korrelation mellem MIR-148a endogene niveau (figur 3A) og gemcitabin følsomhed i flere PDAC cellelinier (figur 3B). Sideløbende evaluerede vi gemcitabin følsomhed i MIA PaCa-2-celler stabilt overudtrykker MIR-148a eller en MIR-CT (figur 3C). Resultater opnået fra tre uafhængige assays indikerer en ikke-signifikant fald i dødelig koncentration 50 værdi (LC50) i gemcitabin i nærvær af MIR-148a i sammenligning med kontrolceller. Lignende resultater blev opnået efter transient transfektion af MIR-148a i flere PDAC cellelinjer (Fig S3). Tilsammen indikerer disse resultater, at MIR-148a ikke dramatisk indflydelse PDAC cellelinier følsomhed mod gemcitabin.

(A) MIR-148a endogen ekspression blev målt ved QRT-PCR i flere PDAC cellelinier og i HDPE og hPNE normale pancreas cellelinier. (B) Cell følsomhed over for gemcitabin blev målt efter en 72 h-behandling i flere PDAC cellelinier og i normale hPNE pancreasceller. Overlevende cellefraktion repræsenterer antallet af behandlede celler i 72 timer i forhold til antallet af ubehandlede celler (repræsenteret som 100%). Den dødelig koncentration 50 (LC50) repræsenterer dosis af gemcitabin er tilstrækkelig til at opnå 50% af overlevende celler sammenlignet med ubehandlede celler. Resultaterne er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg (± SEM). (C) Cell følsomhed over for gemcitabin blev målt i MIA PaCa-2-celler stabilt overudtrykker MIR-148a (LV-TO-MIR-148a) eller en kontrol miR (LV-TO-MIR-CT) til gemcitabin i nærvær af doxycyklin efter en 72 h-behandling. Overlevende cellefraktion repræsenterer antallet af behandlede celler i 72 timer i forhold til antallet af ubehandlede celler (repræsenteret som 100%). Resultaterne er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg (± SEM).

Proteinekspression profil analyse efter forbigående miR-148a overekspression

Hver microRNA kan potentielt påvirke oversættelsen af ​​snesevis af mRNA-mål i henhold til bevarelsen af ​​sit mål sekvens [6]. Fraværet af cellulære virkninger efter MIR-148a overekspression kunne forklares både ved et svagt ændring i proteinekspression profil, utilstrækkelig til at frembringe en cellulær virkning, eller ved opregulering af en redning molekylær pathway, som følge til MIR-148a mål henfald. Derfor udførte vi en storstilet analyse af protein udtryk profiler af 2D-DIGE efter transient MIR-148a over-ekspression i Capan-2-celler. Capan-2-celler transficeret med MIR-CT blev anvendt som kontrol. Fluorescens-analyse af 2D-geler afslørede, at MIR-148a overekspression resulterer kun i en svag modulation af ca. 2200 proteinekspression sammenlignet med kontrolceller (fig S4). Ingen af ​​disse variationer nåede cut-off værdi (1,5 gange ændring sammenlignet med kontrol transfekterede celler) på trods af en massiv overekspression af miR-148a (figur S1A). Følgelig blev der ikke proteinarter identificeret ved massespektrometri.

Disse resultater indikerer, at MIR-148a ikke dramatisk påvirke protein udtryk profiler i Capan-2-celler, der kan forklare fraværet af biologiske virkninger som følge til dens over -expression.

In vivo

effekter af miR-148a overekspression

for at bestemme om miR-148a kan påvirke tumorvækst

in vivo

, vi genereret ortotopisk PDAC tumorer i SCID CB17 mus under anvendelse MIA PaCa-2-celler stabilt overudtrykker mIR-148a med 5 gange (figur S1B). Disse celler konstitutivt udtrykker Gaussia luciferase (Gluc) til ikke-invasiv sporing af tumorvækst. Som beskrevet af Chung et al, Gluc kvantificering i serum nøjagtigt afspejler mængden af ​​levedygtige cancerceller i xenotransplantattumorer [17]. For

in vivo

undersøgelser blev Gluc stikprøven hver 5 dage og mus blev aflivet efter 33 dage, efter tumorstørrelse anslået af abdominal palpering. Sammenhængen mellem tumor vægt og Gluc signal (R

2 = 0,79) blev bekræftet efter tumor resektion og sammenligning til Gluc dosering i serum udtaget operationsdagen (figur S5).

I løbet af denne eksperiment, fandt vi, at gluc niveauer ikke blev ændret af mIR-148a-ekspression indikerer, at mIR-148a ikke inhiberer PDAC tumorudvikling

in vivo

(figur 4A). I overensstemmelse med disse resultater, analysen af ​​tumorer efter operationen mislykkedes at afsløre miR-148a hæmmende effekt på tumor vægt (Dox: 0,368 g ± 0,16 g

vs

Ubehandlet: 0,348 g ± 0,22 g) (figur 4B). Endvidere histologisk undersøgelse af tumorerne indikerer ingen forskel i væv organisation mellem de forskellige grupper (fig S6). Disse observationer viser ingen dramatisk effekt af miR-148a udtryk på tumorvækst eller tumorvæv udvikling

in vivo

(A)

In vivo

overvågning af xenograft tumor progression.: MIA PaCa-2-celler udtrykker mIR-148a og udskilt Gaussia luciferase (Gluc) injiceret i pancreas fra SCID-mus. Mus modtog normal vand (ubehandlet, n = 10) eller vand suppleret med doxycyclin (doxycyclin, n = 12) for MIR-148a ekspression induktion indtil aflivning. Gluc niveauer blev målt i mus serum. Resultaterne er gennemsnittet af gluc aktiviteter (± SEM) og udtrykkes som Vilkårlig Light Unit (A.L.U.). (B) Tumorer blev fjernet og vejet dagen for operationen. Resultater er middeltal (± SEM) af tumor vægt i den ubehandlede gruppe (n = 10) og doxycyclin-behandlede gruppe (n = 12) (C)

In vivo

overvågning af xenograft tumorudvikling: MIA PaCa-2 celler, der udtrykker secerneret Gaussia luciferase blev injiceret i pancreas fra SCID-mus (n = 10). Femten dage senere, lentivirale vektorer, der koder MIR-148a (MIR-148a, n = 7) eller kun GFP (GFP, n = 3) blev injiceret i tumorerne (pilen angiver den lentivirale partikler injektion). Mængden af ​​Gluc blev målt i mus serum og sammenlignet med Gluc beløb målt dagen for lentivector injektion (dag 0). Resultaterne er gennemsnittet af Gluc niveau forholdet i hver gruppe (± SEM) og er udtrykt som arbitrære lysenhed ratio. (D) tumorer modtager MIR-148 (MIR-148a, n = 7) eller GFP (GFP, n = 3) blev fjernet 10 dage efter lentiviral injektion og blev vejet. Grafen repræsenterer sammenligning af tumorvægt udtrykkende MIR-148a (n = 7) eller GFP (n = 3). Resultaterne er gennemsnittet af tumor vægt i hver gruppe (± SEM).

In vivo

måling af miR-148a terapeutisk potentiale

For at vurdere en anti -tumor potentiale af en akut miR-148a overekspression i både tumorceller og mikromiljø, vi injicerede lentivirale partikler koder miR-148a (LV-miR-148a) i på forhånd fastlagte MIA Paca-2-gluc tumorer transplanteret i bugspytkirtlen af SCID CB17 mus. Lentivirale partikler koder GFP reporter protein (LV-GFP) blev anvendt som kontrol. MIR-148a overekspression i LV-miR-148a-injicerede tumorer blev bekræftet ved QRT-PCR (figur S7). Tumorprogression blev overvåget ved Gluc stikprøver i mus serum. Et fald i Gluc signal blev observeret inden for 5 dage efter tumor transduktion for begge partikler (figur 4C). Fra dag 5 til dag 10, gluc niveauer var strengt ens i MIR-148a og kontrol-transduceret tumorer, som viser ingen forskel i tumorlevedygtighed efter lentiviral vektorer injektion. I overensstemmelse med Gluc dosering, resektion tumor vægte på dag 10 er ens i LV-miR-148a og LV-GFP-transduceret grupper (LV-miR-148a: 1,77 g ± 0,30 g

vs

LV-GFP: 1,97 g ± 0,63 g) (figur 4D). Disse resultater indikerer, at MIR-148a genoverførsel i både tumorvæv og mikromiljø ikke påvirker tumorlevedygtighed og afslører ingen særlig terapeutisk potentiale.

Discussion

MIR-148a ekspression ændres i flere typer af kræft og nedregulering er godt beskrevet i forskellige faste tumorer, såsom colorektal, ovarie-, prostata- og gastriske cancere [8], [11], [18], [19].