PLoS ONE: Oxidativ stress inducerer Nuclear-til-Cytosol Shift af hMSH3, en potentiel mekanisme for EMAST i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Baggrund

Forhøjede mikrosatellitmarkørerne ændringer på udvalgte tetranukleotid gentagelser (EMAST ) er en genetisk signatur observeret hos 60% af sporadiske colorektale cancere (CRCs). I modsætning til mikrosatellit ustabil CRC’er hvor hypermethylering af DNA mismatch repair (MMR) gen

hMLH1 s

promotor er kausal, den præcise årsag til EMAST er ikke klart defineret, men peger

hMSH3

mangel.

Sigt

for at undersøge, om

hMSH3

mangel forårsager EMAST, og til at undersøge mekanismerne for sin mangel.

Metoder

Vi målte -4 bp framshifts på

D8S321

D20S82

loci inden EGFP-holdige konstruktioner til at bestemme EMAST dannelse i MMR-dygtige,

hMLH1

– /-

,

hMSH6

– /-

, og

hMSH3

– /- iBooked.dk CRC celler. Vi observerede den subcellulære placering af hMSH3 med oxidativ stress.

Resultater

D8S321

mutationer forekom 31-og 40 gange højere og

D20S82

mutationer forekom 82-og 49 gange højere i

hMLH1

– /-

hMSH3

– /-

celler, end hos

hMSH6

– /-

eller MFR-dygtige celler.

hMSH3

knockdown i MMR-dygtige celler forårsaget højere

D8S321

mutationsrater (18,14 og 11,14 × 10

-4 mutationer /celle /generation i to uafhængige kloner) end scrambled kontroller (0 og 0,26 × 10

-4 mutationer /celle /generation;

s

0,01). DNA-sekventering bekræftede de forventede læserammeforskydningsmutationer med beviser for løbende mutationer af de konstruktioner. Fordi EMAST-positive tumorer er forbundet med inflammation, vi udsat MMR-dygtige celler til oxidativt stress via H

2O

2 for at undersøge dens virkning på

hMSH3

. En reversibel nuklear-til-cytosolen skift i hMSH3 blev observeret ved H

2O

2 behandling.

Konklusion

EMAST er afhængig af MFR baggrund, med

hMSH3

– /-

mere tilbøjelige til at læserammeforskydningsmutationer end

hMSH6

– /-

, modsat læserammeforskydningsmutationer observeret for mononukleotid gentagelser.

hMSH3

– /- iBooked.dk efterligner komplet MMR fiasko (

hMLH1

– /-

) inducere EMAST. I betragtning af den observerede heterogene udtryk for hMSH3 i CRC’er med EMAST,

hMSH3

-deficiency synes at være den begivenhed, der begynder EMAST. Oxidativ stress, der forårsager et skift i hMSH3 s subcellulær placering, kan bidrage til en hMSH3 tab af funktion fænotype ved sekvestrering den til cytosolen

Henvisning:. Tseng-Rogenski SS, Chung H, Wilk MB, Zhang S, Iwaizumi M, Carethers JM (2012) Oxidative Stress inducerer Nuclear-til-Cytosol Shift af hMSH3, en potentiel mekanisme for EMAST i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 7 (11): e50616. doi: 10,1371 /journal.pone.0050616

Redaktør: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Republikken Korea

Modtaget: August 12, 2012; Accepteret: 25 Oktober 2012; Udgivet: November 30, 2012 |

Copyright: © 2012 Tseng-Rogenski et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af USA Public Health service (DK067287 og CA162147) og Comprehensive Cancer center Partnerskab SDSU /UCSD (CA132379 og CA132384). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA mismatch repair (MMR) dysfunktion driver processen med mikrosatellit instabilitet (MSI), observeret i næsten alle Lynch syndrom tarmkræft (CRC’er) og i 15-20% af sporadiske CRC’er [1]. MSI observeres når begge alleler af en større DNA MMR-gen er inaktiveret ved mutation i Lynch tumorer eller ved hypermethylering i sporadiske tumorer, der forårsager MMR proteinproduktion eller funktion at svigte, og tillade rammeskift at forekomme ved DNA-mikrosatellit-sekvenser ud over genomet [1] – [3]. Classic MSI bestemmes ved forekomsten af ​​rammeskift i mono /dinukleotid markører, og har en defineret panel til at sammenligne undersøgelser [4]. Dette panel, eller variationer af disse mono /dinukleotid markører, let registrerer

hMLH1

– og

hMSH2

-deficiency (som dysfunktion af disse to proteiner helt inaktiverer DNA MMR), og lejlighedsvis

hMSH6

-deficiency [1], [4]. MSI panel er ikke så specifik til påvisning

hMSH3

-deficiency på grund af karakteren af ​​reparationen at dette protein bidrager til MMR, baseret på gær undersøgelser [5], [6]. DNA MMR er et enzym system, hvis primære cellulære funktion er at reparere nukleotid mispairs og indsættelse /sletning sløjfer (IDLs) under DNA-replikation. Specificiteten af ​​mismatch anerkendelse er instrueret af hMutSα og hMutSβ; hMutSα (hMSH2-hMSH6 heterodimer) binder til enkelte mispairs og små IDLs (≤2 nukleotider), mens hMutSβ (hMSH2-hMSH3 heterodimer) binder større IDLs [1], [5] – [7]. Vi og andre har observeret DNA læsion bindingsspecificiteter med renset hMutSα og hMutSβ samt lavet specifikke bemærkninger om binding ved hjælp af humane CRC celler af forskellige DNA MMR-mangelfulde baggrunde huser konstruktioner, der indeholder specificeret længde IDLs eller nukleotid mispairs [8] – [12] .

for nylig er en ny form for MSI blevet beskrevet hos op til 60% af sporadiske kolon [13] – [15] og over 30% af rektale cancere [16]. I modsætning klassiske MSI, er forhøjede mikrosatellitændringer på udvalgte tetranukleotid gentagelser (EMAST) bestemt ved et panel af tetranuleotide markører [13] – [17]. EMAST synes at være mere udbredt end klassiske MSI og synes at være en erhvervet træk forbundet med betændelse i CRC’er [14], [16]. CRC patienter EMAST-positive tumorer har en dårligere prognose end dem med ikke-EMAST eller MSI tumorer [16], [18]. EMAST er blevet observeret i forskellige tumorer, herunder ikke-småcellet [17], blære [19], ovarie- [20], prostata [21], hud [22], og kolorektal [13] – [16], men disse undersøgelser giver ikke fuld beviser for årsagen til EMAST. I de første rapporter af EMAST i tarmkræft, forfatterne observerede nukleare heterogenitet hMSH3 inden EMAST-positive tumorer [13], [14]. Vore data, kombineret med gær [5], [6], og andre menneskelige undersøgelser [13] – [16], tyder på, at

hMSH3

-deficiency kunne være føreren af ​​EMAST i CRC’er

for at teste om

hMSH3

-deficiency er en af ​​hovedårsagerne til EMAST, genereret vi tetranukleotid gentage-holdige konstruktioner, der blev smeltet ud-af-ramme med EGFP, således at når frameshifted ved -4 bp ( dvs. sletning af én tetranukleotid enhed), EGFP ville blive udtrykt. Dette tillod observation af genereringen af ​​EMAST i realtid, og gav os mulighed for at beregne mutationsfrekvenser og mutationsrater i multiple MMR-defekte baggrunde. I denne rapport, vores data viser klart, at

hMSH3

-deficiency er en årsag til EMAST i humane CRC celler og vi yderligere give en mulig mekanisme, der kan bidrage til den erhvervede

hMSH3

-deficiency i menneskelige CRC’er.

Resultater

Etablering af et målesystem for EMAST tetranukleotid rammeskift

Fordi nogle undersøgelser har vist, at EMAST er associeret med heterogen udtryk for hMSH3 i kolorektale tumorer [13 ] – [16], vores tilgang var at generere en system til at måle EMAST i en kvantitativ måde som et middel til direkte at undersøge, om

hMSH3

-deficiency er årsagen til EMAST. Menneskelig tetranukleotid

D8S321

D20S82

loci sekvenser (indeholdende 12 og /eller 16 gentagelser af AAAG henholdsvis) har vist den højeste frekvens for en -4 bp læserammeforskydning i kolorektale tumorer [14], [16]. Disse to loci blev derfor udvalgt til undersøgelse med CRC celler med forskellige MMR genetiske baggrunde for at fastslå efterfølgende mutation. Vi har tidligere etableret en tilsvarende eksperimentel system, hvor deletion af 1 bp af (A)

n ville føre til ekspression af reportergenet EGFP når et konstrukt blev placeret +1 bp out-of-frame [10] – [12 ].

for at generere de eksperimentelle konstruktioner, vi indsat

D8S321

(D8) og

D20S82

(D20) loci som 60-merer indeholdende tetranukleotid gentagelser og omkringliggende nukleotider umiddelbart efter EGFP startcodon [Table S1]. Eksperimentelle konstruktioner [D8-AF (D8-ud-af-ramme) og D20-OF] blev fremstillet +1 bp out-of-frame, således at deletion af én AAAG gentagelse vil flytte EGFP læseramme (+1 bp til -3 bp) i den korrekte ramme for at forårsage EGFP ekspression. Mutation resistente (MR) plasmider (MR-D8 og MR-D20), der tjener som negative kontroller, blev konstrueret ved at erstatte de midterste AA nukleotider i AAAG gentager med C /G nukleotider i hver tredje AAAG, afbryde række tetranukleotid gentager at forhindre læserammeforskydningsmutationer. MR-D8 og MR-D20 plasmider blev anbragt uden for rammen (AF, D8 /D20-MR-AF) og /eller i ramme (IF; D8 /D20-MR-IF), der skal anvendes som negative og positive styringer til EGFP ekspression (også se Materialer og fremgangsmåder). Disse konstruktioner blev transficeret i humane CRC cellelinjer med forskellige MMR genetiske baggrunde og stabile cellelinier blev etableret via hygromycin B markering. Single cellekloner blev derefter nedsat. DNA-sekventering blev anvendt til at bekræfte de transfekterede EMAST konstruktioner (Tabel S1) korrekt. Som forventet, celler, der bærer MR-IF (positiv kontrol) var EGFP positive, mens celler, der indeholder MR-AF (negativ kontrol) var EGFP negative.

For at teste, om

hMSH3

-deficiency kan forårsage EMAST, ikke-fluorescerende celler, der bærer de forskellige stabilt transficerede EMAST konstruktioner blev sorteret ved flowcytometri og eksponentielt dyrket i fire til seks uger. Hver uge blev cellerne analyseret dobbelt ved flowcytometri for EGFP udtryk, formentlig som følge af sletning af en AAAG gentagelse fra den transficerede

D8S321

og /eller

D20S82

loci. EGFP positive celler begyndte at opstå, så snart en uge efter EGFP negative celler blev sorteret og udpladet (data ikke vist). For at sikre, at vores eksperimentelle system tillod os at vurdere forekomsten af ​​EMAST korrekt, EGFP negative og positive celler fra

hMLH1

– /-

og /eller

hMSH3

– /- celler, der huser de eksperimentelle konstruktioner (D8-aF og D20-aF) blev sorteret til isolering af genomisk DNA til sekventering. Som forventet, hovedsagelig alle kloner (større end 96%) fra EGFP negative celler bevaret vildtype (WT) sekvenser for hver af

D8S321

D20S82

loci i både

hMLH1

– /-

hMSH3

– /-

cellelinjer, mens kloner fra EGFP positive celler erhvervede sletning af en AAAG gentagelse (figur 1A og figur S1A og S1B). Vi observerede også ekspansion læserammeforskydningsmutationer ved hvert locus ved DNA-sekventering (inkluderet i “andre” i figur 1A). Den hyppigste ene (fra 12,5% til så højt som 30% af de samlede EGFP-positive celler) var indsættelse af to AAAG gentager [(AAAG)

12 til (AAAG)

14] i

D8S321 Hoteller, som ændrede læserammen fra en bp til 9 bp (opført som “andre” i figur 1A og figur S1A). Desuden blev mere end én AAAG gentagelse sletning (fx 4 eller 10 AAAG gentag udgår) sjældent observeret ( 8% af den samlede, opført i “andre” i figur 1A). Vigtigere, blev sletning /insertionsmutationer altid opdaget inden for de mikrosatellitmarkørerne sekvenser mens ingen mutation opstod i flankerende sekvenser omgiver AAAG gentagelse (Figur S1). Disse observationer indikerer, at vi har etableret et pålideligt eksperimentelt system til at overvåge forekomsten af ​​EMAST i CRC celler.

(A) Genomisk DNA isoleret fra EGFP-negative og -positive celler, der bærer eksperimentelle konstruktioner (D8-AF og /eller D20-aF) blev anvendt til at opformere DNA-fragmenter indeholdende EMAST loci at undersøge, om læserammeforskydningsmutationer havde fundet sted. (B) mutationsfrekvenser blev beregnet ved at dividere procentdelen af ​​EGFP positive population i forsøgsgruppen (AF) med den procentdel af EGFP positive i sin negative kontrol (MR-AF) for at beregne forøgelsen af ​​EGFP-positive population i folder. Der var signifikant flere EGFP-positive celler i

hMLH1

– og

hMSH3

deficiente celler sammenlignet med MMR-dygtige og /eller

hMSH6

deficiente celler. *: P. 0,05

rammeforskydningsmutationer på tetranukleotid gentagelser af

D8S321

D20S82

Loci er afhængige MMR Background

Til undersøge effekten af ​​MFR baggrund på læserammeforskydningsmutationer på tetranukleotid

D8S321

D20S82

loci, vi beregnede mutation frekvenser af markørerne ved at sammenligne hver forsøgsgruppe (aF) til dens negative kontrol (MR -af) ved hjælp af følgende formel: “(EGFP positive celler /totale levende celler fra aF) /(EGFP positive celler /totale levende celler fra MR-aF)”.

hMLH1

– /-

celler (fuldstændig blottet for DNA MMR aktivitet) og

hMSH3

– /- celler viste 7-12 gange højere mutationsfrekvenser sammenlignet med kontroller for både loci (figur 1B). Især mutationsfrekvenser observeret i

hMSH3

– /- var sammenlignelig med den i

hMLH1

– /- for både loci (figur 1B). De -4 bp mutationsrater for både loci i hver MMR baggrund blev også beregnet (tabel 1). Med komplet MMR-mangel (

hMLH1

– /-

), mutationsrater for begge loci var 27 og 56 × 10

-4 mutation /celle /generation. Tilsvarende

hMSH3

– /-

celler genererede 33 og 34 × 10

-4 mutationer /celle /generation. Således mutationsrater med

hMSH3

-deficiency er meget sammenlignelig med det for komplet MMR-mangel. Dette står i skarp kontrast til

hMSH6

-deficiency ( 1 × 10

-4 mutation /celle /generation), væsentlige er identisk med MMR-dygtige celler. Disse resultater tyder stærkt på

hMSH3

-deficiency er driveren til EMAST dannelse.

Direkte Knockdown af hMSH3 Expression i MMR-dygtige celler Årsager EMAST

For at bekræfte en rolle hMSH3 i EMAST, vi bankede ned

hMSH3

udtryk i MMR-dygtige celler huser

D8S321

-EGFP konstruere ved transfektion plasmider bærer

hMSH3

-specifikke shRNA og /eller krypteret kontrol, så måles

D8S321

tetranukleotid læserammeforskydningsmutationer som ovenfor. Før shRNA transfektion hMSH3 ekspressionsniveauer i udvalgte MMR-dygtige kloner var sammenlignelige med hinanden (figur S2). Efter generation af shRNA stabil cellelinier (enkelt celle kloner), blev hMSH3 ekspression signifikant reduceret i

hMSH3

shRNA transficerede celler (figur 2; varierer mellem 26-34% af proteinet niveauer af kapløbet kontroller).

hMSH3

shRNA transfektion held og specifikt reduceret hMSH3 ekspressionsniveauerne i CRC celle kloner. Bemærk, at ekspressionsniveauerne af andre DNA mismatch reparation gener forbliver uændrede.

Brug af shRNA stabilt-transficerede celler indeholdende

D8S321

locus, vi undersøgte de cellelinier til forekomsten af ​​EMAST ved flowcytometri. En EGFP-positive population dukkede op i celler, hvor

hMSH3

udtryk blev slået ned.

hMSH3

KD celler viste 5 gange (klon 1) og 6-fold (klon 2) stige i mutation frekvenser (figur 3A) sammenlignet med scrambled shRNA kontrol celler. Reduktion i hMSH3 udtryk stærkt øget mutationsrater af

D8S321

konstruere til 12,7 og 18,4 × 10

-4 mutation /celle /generation, sammenlignet med 1 × 10

-4 mutation /celle /generation i kapløbet kontroller (tabel 2). EGFP-negative og -positive celler blev separeret ud til DNA-sekventering til at undersøge rammeforskydningsmutationer. I begge kloner, mere end 90% af EGFP negative celler bibeholdt WT sekvensen [(AAAG)

12], mens ca. 90% af EGFP-positive celler afslørede en deletion af en gentagelse af AAAG (figur 3B). Udvidelse af de mikrosatellitmarkørerne gentagelser blev også påvist (inkluderet som “andre” i figur 3B). Samlet set vores observationer indikerer, at direkte KD af

hMSH3

forårsager

hMSH3

-deficiency alene er i stand til at generere EMAST i tidligere MMR-dygtige CRC celler.

( A) SW480 celler (MMR dygtige) bærer EMAST konstruktion (D8-aF eller D8-MR-aF) blev transficeret med

hMSH3

shRNA konstruere (

hMSH3

KD) eller scramble kontrol (scramble ) separat. To uafhængige

hMSH3

kapløbet KD-kloner samt forældrenes celler blev inkluderet for denne undersøgelse. EMAST mutationsfrekvenser blev beregnet som beskrevet i figur 1B for forældrenes, scramble, og /eller

hMSH3

KD celler. Der var signifikant flere EGFP-positive celler i

hMSH3

KD celler sammenlignet med forælder og /eller kapløbet kontrol celler. *: P 0,001; **: P 0,05. (B) EGFP-negative og -positive celler fra

hMSH3

KD celler der bærer D8-AF blev sorteret for genomisk DNA isolering til at undersøge læserammeforskydningsmutationer ved sekventering.

Oxidative Stress Årsager Subcellulær kompartmental Skift af hMSH3 fra Nucleus til cytosolen

EMAST er blevet observeret at være tæt forbundet med heterogen tab af hMSH3 udtryk samt nuklear heterogen udtryk (Haugen

et al

, 2008.; Lee

et al

., 210, Devaraj

et al

., 2010). Vores undersøgelser giver ovenstående yderligere tegn på, at reduktionen af ​​hMSH3 udtryk alene kan fremkalde EMAST i humane CRC celler. Vi begyndte at undersøge, hvordan hMSH3 kan blive mangelfuld i EMAST-positive tumorer med den observerede reduktion fra fuld til heterogene udtryk. I CRC, er EMAST associeret med inflammatoriske celler [13], [14], [16], kan lette oxidativ stress, som har vist sig at svække MMR funktion [23]. Brug H

2O

2 som et surrogat, vi undersøgte effekten (r) oxidativ stress på hMSH3 udtryk. MMR-dygtige celler blev behandlet med stigende koncentrationer af H

2O

2 (50 uM -500 uM) i op til 24 timer. Vi har ikke afsløre eventuelle reduktioner i det samlede hMSH3 protein niveauer i alle forhold vi forsøgte (data ikke vist). Dog efter behandling af celler med 50 uM H

2O

2 til 4 timer blev hMSH3 fundet homogent i både kernen og cytosolen i en betydelig procentdel af celler (40-60%, for det andet panel kolonne i figur 4A). Bemærkelsesværdigt hMSH3 blev observeret for fuldstændigt rømme kerner i nogle celler [10-20% af totale celler (tredje panel kolonne i figur 4A], i skarp kontrast til de ubehandlede celler, hvor hMSH3 overvejende forblev lokaliseret i kernen (venstre paneler i figur 4A ). kunne påvises skiftet af hMSH3 lokalisering, så snart som 2 timer i behandling, og effekten toppede mellem 4 og 8 timer efter H

2O

2 behandling startes (data ikke vist). i modsætning til hMSH3, hMLH1, hMSH2, og hMSH6 ændrede ikke deres cellulære lokalisering og forblev i kerner (figur 4B og figur S3A, S3B, og S3C). Cell fraktionering at adskille nukleare og cytosol fraktioner matchede vores immuncytokemi observationer (bane 1-3 og 5-7 i figur 4B).

(A) MMR-dygtige SW480-celler blev serum-udsultet i 24 timer og derefter behandlet med 50 uM H

2O

2 i 4 h. efter fiksering blev celler farvet med anti-hMSH3 antistof og derefter Alexa 488 konjugeret anti-muse-antistof for at observere subcellulære lokalisering af hMSH3. For at teste om effekten var reversibel, blev celler dyrket i yderligere 24 timer efter fjernelse af H

2O

2. (B) SW480 celler var serum-udsultet i 24 timer og derefter behandlet med H

2O

2 til 4 timer (FBS + H

2O

2). Parentale celler (parentale) og celler, som blev serum-sultede uden efterfølgende H

2O

2 behandling (FBS) blev anvendt som kontroller. Cellulære proteiner blev separeret i kerner og cytosol fraktioner under anvendelse af en nuklear fraktionering kit. Lige volumen af ​​proteiner fra hver gruppe blev anvendt til SDS-PAGE og efterfølgende Western blotting for at kontrollere niveauer af hMSH3. Anti-histon H3 blev anvendt til nukleare fraktion lastning lighed, og tubulin blev anvendt til cytosolisk fraktion lastning ligestilling.

For at undersøge, om effekten af ​​H

2O

2 på hMSH3 var reversibel , erstattet vi H

2O

2 holdige medier med friske medier efter 4 timers behandling. hMSH3 viste sig at være nukleart ved 24 timer efter fjernelse af H

2O

2 (højre paneler i figur 4A og bane 4 og 8 i figur 4B). Dette resultat kan indikere, at virkningen af ​​H

2O

2 på hMSH3 var reversibel, hvor hMSH3 tillades at genindtræde ind i kernen, når oxidativ stress mindskes. Alternativt kan hMSH3, der var i cytosolen er blevet beskadiget og nedbrudt og dermed var ude af stand til at genindtræde i kerner, og kunne indikere, at den observerede nukleare hMSH3 blev nyligt syntetiseret. For at bestemme hvilket scenario kunne være korrekte, behandlede vi cellerne med 20 ug /ml cyclohexamid efter udtagning af H

2O

2 at stoppe proteinsyntese i 24 timer. hMSH3 fandtes at være i kernen (data ikke vist), hvilket viser, at hMSH3 der blev flyttet til cytosolen var faktisk i stand til at genindtræde ind i kernen.

Discussion

DNA MMR undersøgelser fra bakterier og gær indikerer, at hMutSβ, en heterodimer af hMSH2 og hMSH3, binder og dirigerer reparation af insertion-deletion loops ± 2 nukleotider [1], [5], [6]. Således

hMSH3

-deficiency ville forventes at give store insertion-deletion loop rammeskift mutationer, som er blevet stærkt foreslået i tidligere undersøgelser [13] – [16]. Bestemmelse konsekvensen af ​​

hMSH3

-deficiency var ikke tidligere af afgørende betydning, da der aldrig er blevet beskrevet en kimlinie mutation for

hMSH3

at forårsage Lynch syndrom, og der var ingen korrelation med sporadisk CRC indtil beskrivelsen af ​​EMAST i CRCs [13] – [16]. Sammenkædningen af ​​EMAST med heterogene tab af hMSH3 udtryk i sporadiske CRC’er foreslog, at dette DNA MMR protein kunne køre EMAST. I vores undersøgelse, satte vi os for at teste dette ved at skabe en human celle model til måling EMAST dannelse på en kvantitativ måde. Vores undersøgelse viser, at (a) EMAST dannelse er afhængig af MFR baggrund, med

hMSH3

-deficiency matchende komplet MMR-mangel i at forårsage EMAST, (b)

hMSH3

-deficiency mutationsrater for EMAST dannelse er markant højere sammenlignet med

hMSH6

-deficiency (hovedsagelig null for EMAST dannelse), (c) knockdown af

hMSH3

alene initierer dannelse af EMAST, og (d) oxidativt stress kan være en af ​​de faktorer, der forårsager mangel på hMSH3, da dette MMR protein skifter sin subcellulære placering med H

2O

2. Alt i alt, vores undersøgelse giver stærk støtte til det koncept, at

hMSH3

-deficiency driver EMAST dannelse og giver en mulig mekanisme, der kan bidrage til hMSH3-mangel i menneskelige CRC’er.

tetranukleotid rammeforskydninger der definerer EMAST i CRC tumorer kan være ved indsættelse eller sletning af tetranukleotid gentagelser. I vores eksperimenter, vi designet konstruktioner til at opdage en -4 bp sletning; men ved DNA-sekventering blev også påvist nogle indsættelser (ekspansion) af mikrosatellitter. Faktisk er størstedelen af ​​læserammeforskydningsmutationer påvist i vore forsøg skyldtes deletion af én AAAG enhed (figur 1A og 3B). Vi valgte den

D8S321

D20S82

loci for vores eksperimenter, fordi sletning af en AAAG enhed havde vist sig at være den mest fremherskende mutation findes blandt loci anvendes til at detektere EMAST [14], [16 ]. Fordi vores system er designet til kun at detektere én type mutation, vores priser beregnede sandsynligvis en undervurdering af foranderlighed af disse loci med

hMSH3

-deficiency. Individuel sekvens kontekst og flankerende sekvenser kan også bidrage til den forskellige udfald af mutationen (fx insertion vs. deletion) [11], [12], [24]. På

D20S82

locus, kun omkring en tredjedel af EGFP-positive

hMSH3

– /-

celler demonstrerede en AAAG enhed sletning og dette kunne være på grund af denne særlige klon indeholder flere kopier af konstruktet. Dette er i kontrast med mere end 70% af EGFP positive celler der bærer den samme konstruktion i

hMLH1

– /-

viser sletning af én AAAG enhed, der angiver konstruktionen opførte sig som designet. For

hMSH3

– /-

celler, mutation på en af ​​kopierne ville føre til EGFP udtryk, mens resten forblev WT, confounding sekventering analyse. Dette ville imidlertid ikke påvirke mutationen frekvens og mutation sats som beregningen var baseret på antallet af EGFP-positive celler.

Det er ikke helt klart for EMAST-positive tumorer, hvordan

hMSH3

nedreguleres at initiere EMAST. Der er klare beviser for, at EMAST-positive tumorer er stærkt forbundet med inflammatoriske celler, især inden for de epiteliale komponenter af tumor og i stroma omgiver tumoren (såkaldte “tumor reder”) [16]. Således er en hypotese er, at inflammation udløser en erhvervet reduktion af hMSH3, som efterfølgende driver EMAST. Interessant, H

2O behandling

2 (simulerer oxidativ stress) fører til en forskydning af hMSH3 i cytosolen væk fra dets funktionelle sted i kernen uden at mindske de samlede udtryk niveauer. Med korte H

2O

2 behandling, kunne vi ikke vise detekterbare niveauer af EMAST dannelse i vores model (data ikke vist). En længere og konsekvent forekomst af oxidativt stress kan være nødvendigt at påbegynde EMAST, overvejer EMAST synes at være forbundet med kronisk inflammation og med avanceret histologi af tumorer [14]. Alternativt kan andre komponenter af inflammation og /eller det miljø tumor arbejde synergistisk med oxidativt stress at forårsage EMAST. EMAST synes at være en dårlig prognostisk faktor for patienter med CRC [16], [18]. Dette er i modsætning til klassiske MSI, for hvilke patienter med CRC har bedre overlevelse på samme trinvis tumoren af ​​patienter med MSS tumorer [1]. Det er endnu ikke fastslået, om det er uløseligt forbundet med den type MMR defekt (

hMLH1

vs.

hMSH3

) eller nogle andre faktorer, såsom graden eller typen af ​​betændelse i tumoren.

sammenfattende viser vi gennem oprettelse af en ny celle model,

hMSH3

-deficiency driver EMAST. Vores data kraftigt supplerer observation af heterogene tab af hMSH3 udtryk i EMAST-positive tumorer, og foreslår, at erhvervet

hMSH3

-deficiency, drevet af oxidativ stress, kan være den mest almindelige DNA MMR defekt blandt menneskelige CRCs.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

De humane coloncancer-cellelinjer, HCT116 (

hMLH1

– /- hMSH3

– /-

), DLD-1 (

hMSH6

– /-

), HCT116 + CH3 (

hMLH1-

restaureret, men

hMSH3

– /-

), og SW480 (MMR-dygtige) celler blev dyrket som tidligere [10] beskrevne. HCT116 blev DLD-1, og SW480 indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, Virginia). HCT116 + CH3-celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Minoru Koi, Baylor University Medical Center, Dallas, TX [10]. Anti-hMLH1, hMSH2, hMSH3, og hMSH6 antistoffer blev indkøbt fra BD Pharmingen (San Diego, CA). Anti-tubulin antistof var fra Sigma (St. Louis, MO). HRP-konjugeret anti-muse-antistof blev købt hos Cell Signaling (Danvers, MA). Alexa 488 konjugeret anti-mus antistof var fra Invitrogen (Grand Island, NY).

Kloning af pIREShyg2-

D8S321

-EGFP og pIREShyg2-

D20S82

-EGFP plasmider

de to menneskelige loci,

D8S321

D20S82,

er blevet rapporteret at have den højeste mutationsfrekvens i EMAST colon tumorer [13] – [16], og blev udvalgt at konstruere plasmider.

D8S321

og

D20S82

sekvenser indeholder 12 og /eller 16 gentagelser af AAAG hhv. Sense og anti-sense oligoer indeholder

D8S321

eller

D20S82

, omkringliggende sekvenser, samt

Pmel

I og

Asc

jeg kloning sites (tabel S1) blev syntetiseret (Integrated DNA Technologies, Inc., San Diego, CA) og underkastedes T4-polynukleotidkinase reaktioner at phosphorylere 5 ‘enderne (Invitrogen). Sense- og antisense-oligoer fik lov til at anneale og klonet ind pIREShyg2-EGFP plasmider via

Pmel

I-

ASC

stederne umiddelbart efter startkodonen af ​​EGFP-genet som tidligere beskrevet [ ,,,0],10] – [12], [24]. Eksperimentelle plasmider blev konstrueret en bp ud af rammen, således at den ene sletning af en tetranukleotid gentagelse inden

D8S321

eller

D20S82

(-4 bp læserammeforskydning mutation) ville flytte læserammen i den korrekte ramme for at tillade EGFP ekspression. Mutation resistente plasmider [MR-ud-af-ramme (AF)] blev konstrueret ved anvendelse af sense- og anti-sense-oligoer, hvor to nukleotider i hver tredje gentagelse af AAAG blev ændret for at forhindre læserammeforskydningsmutationer. Mutationen resistente i ramme (MR-D8-IF) plasmid, en positiv kontrol for EGFP ekspression, blev konstrueret ved at deletere 1 bp fra

D8S321

sekvens i MR-D8-AF plasmider ved anvendelse QuikChange II site-directed mutagenese (Stratagene, La Jolla, CA).

hMSH3

shRNA Construction

hMSH3

shRNA konstruere og dets parrede tom vektor blev venligst stillet til rådighed af Dr. Ajay Goel, Baylor University Medical center, Dallas, TX. GFP-sekvensen af ​​denne konstruktion blev fjernet ved fordøjelse af konstruktionen med

Apa

I og

Pac

I, udfyldning under anvendelse af Klenow-fragment til dannelse af stumpe ender, og derefter udføre stump-ende ligering. For at gøre en krypteret kontrol blev GFP-sekvensen fra det tomme vektor først fjernes som beskrevet ovenfor, og den krypterede sekvens, fjernet fra et kommercielt tilgængeligt konstrukt (GeneCopoeia, Rockville, MD), blev indsat på vektoren via

EcoR

I og

Xho

sites. Eksistensen og nøjagtigheden af ​​kapløbet og /eller

hMSH3

shRNA sekvenser på plasmider blev bekræftet ved DNA-sekventering.

Transfektion og Generation af stabile cellelinier

Celler var transficeret med forskellige pIREShyg2-

D8S321

-EGFP og pIREShyg2-

D20S82

-EGFP plasmider (beskrevet i tabel S1) ved hjælp Nucleofector kits (Amaxa, Köln, Tyskland). Stabile cellelinier blev etableret ved hygromycin B (Invitrogen) selektion. Hver cellelinje blev underkastet enkelt celle sortering under anvendelse af FACS ARIA (Becton Dickinson, San Jose, CA) til at fastsætte individuelle kloner. Alle enkelt celle kloner blev undersøgt ved DNA-sekventering til at sikre eksistensen og nøjagtigheden af ​​EMAST konstruktion de bar.

For

hMSH3

Knockdown (KD) celler, MMR-dygtige celler (SW480) bærer D8-aF og /eller D8-MR-aF konstruktioner blev transficeret med plasmider huser scramble eller

hMSH3

-specifik shRNA hjælp Fugene 6 (Roche, Mannheim, Tyskland), efterfulgt af puromycin (Invitrogen) valg til at etablere stabile linjer. To uafhængige kloner fra hver gruppe blev anvendt til undersøgelserne.

Mutation Analyse ved flowcytometri

Fire hundrede tusinde ikke-fluorescerende stabile-transficerede celler blev sorteret på hver brønd på plader med 6 brønde ved