PLoS ONE: Anvendelse af metformin alene er ikke forbundet med Survival Resultater af kolorektal cancer Cell men AMPK Activator AICAR sensibiliserer Anticancer Effekt af 5-fluoruracil gennem AMPK Activation

Abstrakt

Kolorektal cancer (CRC) er stadig den tredje mest almindelige kræftform og den anden mest almindelige årsager til kræft dødsfald i hele verden. Metformin, et biguanid, som er meget udbredt til behandling af diabetes mellitus, er for nylig blevet vist at have en undertrykkende virkning på CRC risiko og mortalitet, men ikke alle laboratoriestudier tyder på, at metformin har antineoplastisk aktivitet. Her undersøgte vi effekten af ​​metformin og AMPK aktivator AICAR på CRC celler spredning. Som følge heraf havde metformin ikke inhiberer celleproliferation eller inducerer apoptose i CRC-cellelinier in vitro og in vivo. Forskellig fra metformin, AICAR opstod antitumoraktivitet og sensibiliseret anticancervirkning af 5-FU på CRC celler in vitro og in vivo. I yderligere analyse, viser vi, at AMPK aktivering kan være en central molekylær mekanisme for den additive effekt af AICAR. Tilsammen vores resultater antyder, at metformin har ikke antineoplastisk aktivitet for CRC-celler som et enkelt middel men AMPK aktivator AICAR kan inducere apoptose og forbedre den cytotoksiske virkning af 5-FU gennem AMPK aktivering

Henvisning:. Sui X, Xu Y, Yang J, Fang Y, Lou H, Han W, et al. (2014) Anvendelse af metformin alene er ikke forbundet med Survival Resultater af kolorektal cancer Cell men AMPK Activator AICAR sensibiliserer Anticancer Effekt af 5-fluoruracil gennem AMPK aktivering. PLoS ONE 9 (5): e97781. doi: 10,1371 /journal.pone.0097781

Redaktør: Demetrios Vavvas, Massachusetts Eye Ear Infirmary, Harvard Medical School, USA

Modtaget: Februar 16, 2014 Accepteret: April 23, 2014; Udgivet: 21. maj 2014

Copyright: © 2014 Sui et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse er støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (tilskud nr 81.301.891 og 81.272.593) og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (bevilge nr LQ13H160008). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er stadig en førende årsag til kræft-relaterede sygelighed og dødelighed i hele verden, selv om en masse der er gjort fremskridt i behandlingen af ​​CRC i de seneste år [1], [2 ]. Epidemiologiske undersøgelser har vist, at diabetes mellitus (DM) forøger forekomst og dødelighed af cancere, især gastrointestinal malignitet [3], [4]. Der er voksende beviser, der forbinder diabetes mellitus med en øget risiko for colorectal cancer [5], [6]. Imidlertid har nogle andre undersøgelser ikke understøttet dette synspunkt. En multi-center, dobbelt-blindt, placebo-kontrolleret, randomiseret, kontrolleret studie viste, at der var ingen statistisk signifikant forskel i colon-cancer specifik overlevelse i dem, der med diabetes [7]. Så forholdet mellem DM og CRC risiko stadig kontroversielt.

Metformin (1,1-dimethylbiguanide hydrochlorid), et biguanid derivat, der er meget brugt til behandling af diabetes mellitus, er blevet vist at udøve potentielt vigtige anticancer effekter [ ,,,0],8], [9], men andre har ikke støttet dette synspunkt [10], [11]. De involverede i antineoplastiske virkninger af metformin mekanismer er formentlig meget forskelligartet, herunder aktivering af adenosinmonophosphat kinase (AMPK) [12], phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) mutation [13], p53-mangel [14] og så videre. Blandt disse mekanismer, den AMPK- pattedyr mål for rapamycin (mTOR) akse spiller en central rolle for de antineoplastiske virkninger af metformin. Både metformin og 5-amino-imidazol-4-carboxamid-1-b-4-ribofuranosid (AICAR) kan aktivere AMPK pathway. AMPK er en serin /threonin-kinase og en cellulær brændstof sensor vej følsom over forhøjelsen af ​​AMP /ATP-forhold, som er blevet forbundet med flere humane tumor undertrykkere [15]. Virkningerne af metformin er primært forklares ved aktivering af AMPK, som inhiberer proteinsyntese og gluconeogenese under cellulært stress [16].

Hidtil 5-fluorouracil (5-FU) er fortsat en meget anvendt kemoterapeutisk lægemiddel i behandling af colorektal carcinom. For nylig, er metformin rapporteret at have en synergistisk effekt i kombination med nogle kemoterapeutiske midler [17], [18]. Det forbliver imidlertid uklart, om metformin eller AICAR kan anvendes i kombination med 5-FU at forbedre anticancervirkning, da der ikke undersøgelse af korrelationen mellem metformin /AICAR og 5-FU behandling in vitro og in vivo.

Vi undersøgte effekten af ​​metformin og AMPK aktivator AICAR på CRC celleproliferation. Her demonstrerer vi, at brugen af ​​metformin alene ikke er forbundet med overlevelse resultater af kolorektal cancer celle, men AICAR kan inducere apoptose og forbedre den cytotoksiske effekt af 5-FU gennem AMPK aktivering, som bør overvejes i de igangværende kliniske forsøg, hvor metformin anvendes i behandling af kolorektal cancer.

Resultater

metformin hæmmede ikke kolorektal cancer Cell Growth

for at undersøge, om metformin påvirker menneskets kolorektal cancer celledeling undersøgte vi effekten af lægemidlet på tre cancercellelinier: HCT116, RKO og HT29-celler. Celler blev dyrket i 10% føtalt bovint serum (FBS), behandlet med metformin (1 og 5 mM) og AICAR (5 mM) som en kontrol. AICAR vides at inducere apoptose. MTT levedygtighed blev udført efter tilsætning af midlerne i 24 timer. Som et resultat, AICAR reducerede cellelevedygtigheden med 50-70% i de tre cellelinier, men lille fald i cellelevedygtighed blev fundet i de tre cellelinjer blev behandlet med metformin (figur 1A), hvilket indikerer metformin kan have nogen virkning på kolorektal cancercelle vækst. For at bestemme om metformin inhiberer forankringsuafhængig vækst, udførte vi en blød-agar-kolonidannelse assayet i fravær eller nærvær af 5 mM metformin fornys dagligt. Efter 2 uger blev cellerne talt under et mikroskop. Efter aftale med MTT levedygtighedsassay resultater, havde metformin ikke formindske antallet og størrelsen af ​​kolonierne (figur 1b). Disse resultater antyder, at metformin ikke havde vækstinhiberende aktivitet i kolorektal cancercelle.

(A) HCT116 blev RKO og HT29 podet i plader med 96 brønde. Efter 24 timer, metformin (1 og 5 mM) og AICAR (5 mM) blev sat til dyrkningsmediet. 24 timer efter tilsætningen af ​​midlerne, blev virkningen af ​​metformin på kolorektal cancer celleoverlevelse udført en celleviabilitetstest (MTT). (B) Fotografier af blød agar kolonier af HCT116, RKO og HT29-celler 2 uger efter behandling med 5 mM metformin og 5 mM AICAR. (3) Cancer cellelinjer blev behandlet med forskellige koncentrationer af metformin (1, 5 og 10 mM) til forskellige tidspunkter, da ekspressionen af ​​aktiv caspase-3 og LC3-II /I-forholdet blev bedømt ved western blotting.

metformin ikke inducere apoptose, autophagy og cellecyklusstop

for at undersøge om metformin inducere apoptose og autophagy, blev tre cancer cellelinjer behandlet med forskellige koncentrationer af metformin (1, 5 og 10 mM ) til forskellige tidspunkter, da ekspressionen af ​​aktiv caspase-3 og LC3-II /i-forholdet blev bedømt ved western blotting. Som vist i figur 1C, blev apoptose og autofagi ikke aktiveres dosis- og tidsafhængig måde, når cellerne blev behandlet med metformin. For yderligere bekræftelse blev alle disse behandlede celler analyseret ved elektronmikroskopi og flowcytometri. Disse tre celler udviste omfattende apoptotiske celler (figur 2A) og en forøget sub-G1 population (figur 2B) efter AICAR behandling. I modsætning hertil var meget få apoptose observeret for metformin behandlede celler. Vi spurgte, om metformin påvirker cellecyklus. Som det ses i figur 2B, observerede vi den samme procentdel af celler i G0 /G1, G2and S fasen i metformin behandlede celler i forhold til deres kontroller. Tilsammen vores data, at metformin ikke inducerede apoptose, autofagi og cellecyklusstop.

(A) 24 timer efter tilsætning af 5 mM metformin og 5 mM AICAR, virkningen af ​​metformin på kolorektal cancercelle overlevelse blev observeret. Repræsentativ celle morfologiske ændringer påvises ved lysmikroskopi; blev observeret karakteristiske morfologiske træk ved apoptose, herunder frigørelse og celle krympning. (B) Dele af celler i sub-G1, G0 /G1, S eller G2 /M faser af cellecyklus undersøges efter behandlingen med metformin og AICAR.

AICAR forstærkes Anti-cancer virkning af 5-FU in vitro og in vivo

Det er blevet erkendt, at 5-FU sædvanligvis anvendes i kombination med andre kemoterapeutiske lægemidler, der kan forbedre den terapeutiske effektivitet for CRC patienter. For at undersøge, om AICAR kan bevidstgøre anticancer effekt af 5-FU, vi evaluerede effekten af ​​AICAR på 5-FU-induceret apoptose. Vi fandt, at levedygtigheden af ​​celler behandlet med AICAR i kombination med 5-FU var signifikant lavere end for kontrolgruppen (figur 3A). Flowcytometri viste, at procentdelen af ​​apoptotiske celler var signifikant højere i celler behandlet med AICAR i kombination med 5-FU sammenlignet med kontroller (figur 3B). Disse resultater antyder, AICAR forbedrer 5-FU-induceret apoptose i kolorektale cancerceller.

(A) HCT116 blev RKO og HT29 podet i plader med 96 brønde. Efter 24 timer, metformin (5 mM), AICAR (5 mM), 5-FU (20 uM) og AICAR plus 5-FU blev sat til dyrkningsmediet. 24 timer efter tilsætningen af ​​midlerne, blev virkningen af ​​metformin og AICAR på kolorektal cancer celleoverlevelse udført en celleviabilitetstest (MTT). (B) Repræsentative resultater af annexin V-FITC /PI-farvning og kvantitativ analyse; værdier er gennemsnit ± SD af tre uafhængige forsøg; * P. 0,05

For at undersøge, om metformin og AICAR kunne påvirke tumorvækst in vivo, vi derefter injiceret nøgne mus subkutant med HT29-celler. Musene med tumor xenografter på 100 mm

3 blev tilfældigt inddelt i 5 eksperimentelle grupper: kontrolgruppe, metformin 200 mg /ml /d (i drikkevand, hvilket svarer til 15 mg /kg) -gruppe, AICAR 400 mg /kg /2 dage gruppe, 5-FU 40 mg /kg /2 dage gruppe og AICAR plus 5-FU-gruppen i 5 uger. Behandling blev administreret via intratumoral injektion. Alle mus tålte denne behandling godt uden signifikant toksicitet og havde stabile legemsvægte. Først blev metforminkoncentration analyseret (3 timer og 15 timer efter metformin injektion) ved hjælp af høj-performance væskekromatografi og metforminkoncentration i musesera var i gennemsnit 1,15 (± 0,31) pg /ml for top, som svarede til ca. humane topniveauer for 500 mg po (Mundtligt) dagligt. Forsøgene blev udført in triplo, og resultatet viste, at niveauerne af metformin i plasmaet af kvindelige nøgne mus sædvanligvis blev opnået i mennesker. Derefter tumorstørrelserne fra xenotransplantater blev målt. Som et resultat blev tumorstørrelse fra xenotransplantater af AICAR gruppe ikke metformingruppen mindre i forhold til kontrolgruppen. Desuden størrelserne af AICAR plus 5-FU-gruppen var signifikant mindre i forhold til AICAR alene eller 5-FU-gruppen, hvilket antyder, at AICAR kunne potensere 5-FU-induceret anticancervirkning af HT29 (figur 4A).

( A) vækst kurve af xenograft tumorer behandlet med angivne lægemidler. (B) Virkningen af ​​AICAR på AMPK aktivering. Ekspressionen af ​​aktiv caspase-3, blev p-AMPK og p-mTOR analyseret ved Western blotting.

AICAR Måske Enhance Anticancer af 5-FU gennem AMPK Aktivering

Det har været erkendte, at virkningerne af AICAR hovedsagelig forklares ved aktivering af AMPK, som regulerer cellulær energimetabolisme. For at undersøge om AMPK aktivering kan være forbundet med den additive virkning af AICAR, blev phosphorylering af AMPK og mTOR vurderes ved western blotting under anvendelse af specifikke antistoffer. Vi fandt, at p-AMPK induceret af 5-FU blev forstærket af AICAR, sammen med nedsat p-mTOR og forøget aktiv caspase-3 (figur 4B), hvilket indikerer, at aktivering af AMPK ved AICAR potenserede 5-FU-induceret apoptose.

diskussion

Selvom stigende tegn støtter tanken om, at hyperinsulinæmi og hyperglykæmi fremme carcinogenese hos patienter med diabetes mellitus [19], [20], er det stadig kontroversielt, om risikoen for kolorektal cancer også er forbundet med diabetes mellitus og metformin behandling kan reducere risikoen for CRC [10].

metformin, et biguanid derivat, er en anvendt og veltolereret lægemiddel til behandling af type 2-diabetes mellitus. Effektiviteten af ​​metformin som et antidiabetisk lægemiddel kan forklares med dens evne til at nedsætte hepatisk gluconeogenese og stimulere glucoseoptagelse i muskulatur, hvilket resulterer i reducerede cirkulerende glucosekoncentrationer [21]. Metformin hos mennesker er i mikro molære niveauer, men gut kan eller kan ikke se Mili-molær niveauer. De seneste data tyder på, at metformin kan beskytte mod kræft, herunder CRC og har anti-tumor effekt i mus xenografter [22], [23]. Interessant nok er en modstridende rapport vedrørende den potentielle rolle af metformin og cancer. Bodmer og kolleger fandt, at brug af metformin ikke var forbundet med en nedsat risiko for colorectal cancer og metformin også ændrede ikke risiko for lungekræft [10], [24]. Det er også rapporteret, at der ikke var nogen statistisk signifikant sammenhæng mellem metformin eksponering og dissemineret kolorektal kræft på diagnose [25]. Metfromin fungerer muligvis ikke på regelmæssige tumorceller, men arbejde på stamceller. Det er vist, at metformin selektivt kunne målrette kræft stamceller [26], og handle sammen med kemoterapi for at blokere tumorvækst og forlænge remission i flere cancer celletyper [26], [27]. Metformin kan også inhibere den inflammatoriske respons er forbundet med cellulær transformation og cancer stamceller vækst [28]. Desuden kan metformin accelerere væksten af ​​BRAF V600E-drevet melanom ved opregulering VEGF-A [29] og fremme angiogen fænotype i ERalpha negative MDA-MB-435 breast cancer model [30]. Samlet set kan metformin kun have virkning i forebyggelse tumor initiering, men efter kræften er blevet etableret, kan det ikke have en effekt. Vores data viste også, at metformin eksponering ikke hæmme kolorektal cancer cellevækst, inducere apoptose eller autofagi og cellecyklus arrest. Efter aftale med in vitro, in vivo-undersøgelse viste, at metformin ikke undertrykke tumorvækst men AMPK aktivator opstod AICAR antitumoraktivitet. Derfor metformin kan have nogen antineoplastisk aktivitet for CRC celler som enkeltstof.

anticancer effekter af AICAR medieres ved aktivering af AMPK og reduktion af mTOR signalering [31]. AMPK aktivering kan undertrykke mTOR pathway at inhibere cellevækst og proliferation. AICAR er blevet rapporteret at øge effektiviteten af ​​konventionelle kemoterapeutiske midler i behandlingen af ​​lokale og metastatisk nasopharyngeal carcinoma (NPC) [32]. AMPK aktivatorer såsom AICAR give en terapeutisk strategi for blodkræftsygdomme [33], [34]. For det første kan AICAR inducere apoptose i B-celle kronisk lymfatisk leukæmi celler [35] og dræbe kronisk myeloid leukæmi (CML) -celler via PKC-afhængig induktion af autophagic celledød [36]. For det andet, AICAR har antileukæmiske virkninger på BCR-ABL-udtrykkende celler [37] og barndom akut lymfatisk leukæmi (ALL) celler [38]. For det tredje kan AICAR fremkalde G (1) /S anholdelse og Nanog nedregulering via p53 og forbedre erythroid differentiering [39]. Endelig kan AICAR også inducere apoptose uafhængigt af AMPK og p53 gennem opregulering af BH3-only proteiner BIM og NOXA i kronisk lymfatisk leukæmi-celler [40]. Foruden NPC og leukæmi, er AICAR involveret i neural stamcelle væksthæmning og standsning af cellecyklus ved nedregulering phospho-retinoblastoma protein og cyclin D [41]. AICAR kan hæmme væksten af ​​retinoblastoma ved at nedsætte angiogenese og inducere apoptose [42] eller aktivering af AMPK [43]. AICAR demonstreres også at inhibere proliferation af EGFRvlll udtrykkende glioblastom gennem AMPK pathway [44]. Desuden kan AICAR anvendes i kliniske forsøg som en kardiobeskyttende under ATP-depleterede betingelser og har vist sig at være en øvelse mimetisk i dyr [45]. I overensstemmelse med disse resultater, vi rapporterede, at AICAR kan inducere apoptose at dukke antineoplastisk aktivitet. Endvidere AICAR forøgede cytotoksiske virkning af 5-FU gennem AMPK aktivering.

Som konklusion viste vores undersøgelse, at brugen af ​​metformin alene er ikke forbundet med overlevelse resultater af kolorektal cancer cell men AMPK aktivator AICAR kan inducere apoptose og emerge antineoplastisk aktivitet. Desuden kan aktivering af AMPK være en central årsag, at AICAR kan forbedre den cytotoksiske effekt af 5-FU i kolorektale cancerceller.

Materialer og metoder

Cell Culture

human colorectal carcinom cellelinjer HCT116 blev RKO og HT29 købt fra ATCC (LGC Standards SLU, Barcelona, ​​Spanien). Cellelinjerne blev opretholdt i McCoys 5A eller Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Gibco BRL, Rockville, MD, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Invitrogen), og 2 mmol /L L-glutamin ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 95% luft og 5% CO

2.

Materialer Salg

5-FU blev indkøbt fra Jinyao amino Acid Co, Ltd (Tianjin, Kina). AICAR og metformin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Anti-phospho-eIF2α og fosfor-AMPK blev købt fra Cell Signaling.

Måling af Cell Levedygtighed og Apoptose

Cell levedygtighed blev bestemt ved MTT-analysen. Celler blev podet i 96-brønds fladbundede mikrotiterplader ved en densitet på 1 x 10

4 celler pr. Midlerne blev tilsat ved de angivne koncentrationer i 24 timer. Absorbansen blev målt på en mikropladelæser (Synergy HT, Bio-Tek, USA) ved 570 nm.

Phartmingen annexin V-FITC Apoptose Ddtection Kit I (BD, USA) blev anvendt til at detektere apoptose og estimeringen proceduren blev udført ifølge producentens anvisninger. 2 × 10

6-celler blev podet i en 6 cm skål. Efter fastgørelse natten over blev celler vasket to gange med PBS, og mediet blev udskiftet medium med 5 mM metformin eller 20 ug /ml 5-FU. Alle celler, herunder de flydende celler i dyrkningsmediet høstet. Cellerne blev resuspenderet i iskold 1 × bindingspuffer i en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml. 100 pi cellesuspension blev hver blandet med 5 pi FITC Annexin V og 5 pi PI. Blandingen blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke og derefter analyseret ved FACSCalibur flowcytometer (BD Biosystems, Heidelberg, Tyskland).

Soft-agar-kolonidannelse Assay Salg

500 celler var suspenderet i medium indeholdende 0,3% lav-smelte agarose, podet i en seks-brønds plade, der blev overlejret med 0,5% lav-smelte agarose og lades vokse i 2 uger ved 37 ° C i 5% CO

2. De kolonier indeholdende mere end 50 celler blev talt under et mikroskop. Tre brønde blev analyseret for hvert eksperiment.

Cell-cycle analysis

Celler blev trypsinbehandlet, vasket to gange i iskold PBS og resuspenderet i 200 pi citratbuffer (250 mM saccharose, 40 mM tri-natriumcitrat, 5% dimethylsulfoxid (DMSO) indstillet til pH 7,6 med 40 mM eddikesyre). Propidiumiodid (40 ug /ml) opløsning blev tilsat til cellerne og inkuberet i 45 minutter i mørke ved 4 ° C før analyse.

Western blot-analyse Salg

Celler blev høstet fra dyrkede fade og blev lyseret i en lysebuffer [20 mM Tris-HCI pH 7,6, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, 1% NP-40, 1% aprotinin, 1 mM phenylemethylsulfonyl (PMSF), 1 mM natriumvanadat]. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et BCA Protein Assay Kit (Pierce). Cellelysater (40 ug protein /linje) blev adskilt på en 5 til 20% Tris-Tricine Ready Gel SDS-PAGE (Bio-Rad) til nitrocellulosemembran blotting. De blottede membraner blev blokeret med 5% skummetmælk i 1 time og blev inkuberet med primære antistoffer. De immunreaktive bånd blev visualiseret ved forøget kemiluminescens under anvendelse af peberrod Perox-idase-konjugeret IgG sekundære antistoffer. Band densitet blev målt ved densitometri, kvantificeret under anvendelse gel plotte makroer af NIH Image 1,62, og normaliseret til en angivet prøve i samme membran.

In vivo Subkutan tumormodel

Alle in vivo eksperimentelle protokoller blev godkendt af dyret pleje udvalg af Sir køre køre Shaw Hospital, Zhejiang University. Levedygtige HCT116 celler (1 x 10

7cells i 0,1 ml phosphatbuffer saltvand) blev injiceret subkutant i højre dorsale flanke af 6 uger gamle BALB /c nøgne mus (seks mus pr gruppe). Tumorvolumen blev vurderet hver 2. dag i 4 uger. Tumorvolumen blev beregnet ved følgende formel: (kort diameter)

2 × (lang diameter) /2

Statistiske analyser

Resultater udtrykkes som værdier af middelværdi ± standardafvigelse (. SD). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 11.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vi udførte parret t-test (to-halet) statistisk analyse blev statistisk signifikans sat til p. 0,05