PLoS ONE: Kombination af autoantistof Signature med PSA Level Aktiverer en meget nøjagtig Blood differentiering af prostatakræft patienter fra patienter med benign prostatahyperplasi

abstrakt

Selvom et forøget niveau af prostata-specifikt antigen kan være en indikation for prostatakræft, andre årsager ofte føre til en høj forekomst af falske positive resultater. Derfor kunne en yderligere serologisk screening af autoantistoffer i patienters sera forbedre påvisningen af ​​prostatacancer. Vi udførte protein macroarray screening med sera fra 49 prostata kræftpatienter, 70 patienter med benign prostatahyperplasi og 28 raske kontrolpersoner og sammenlignede den autoimmune reaktion i disse grupper. Vi var i stand til at skelne prostatakræft patienter fra normale kontroller med en nøjagtighed på 83,2%, patienter med benign prostatahyperplasi fra normale kontroller med en nøjagtighed på 86,0% og prostata cancer patienter fra patienter med benign prostatahyperplasi med en nøjagtighed på 70,3%. Kombinere seroreaktivitet mønster med en PSA-niveau på mere end 4,0 ng /ml denne klassificering kunne forbedres med en nøjagtighed på 84,1%. For udvalgte proteiner var vi i stand til at bekræfte den differentielle ekspression ved hjælp Luminex på 84 prøver. Vi giver en minimalt invasiv serologisk metode til at reducere falske positive resultater i påvisning af prostatakræft og ifølge PSA-screening for at skelne mænd med prostatakræft fra mænd med benign prostatahyperplasi

Henvisning:. Leidinger P, Keller A, Milchram L, Harz C, Hart M, Werth A, et al. (2015) Kombination af autoantistof Signature med PSA Level Aktiverer en meget nøjagtig Blood differentiering af prostatakræft patienter fra patienter med benign prostatahyperplasi. PLoS ONE 10 (6): e0128235. doi: 10,1371 /journal.pone.0128235

Academic Redaktør: Mohammad Saleem, Hormel Institute, University of Minnesota, UNITED STATES

Modtaget: Juni 17, 2014, Accepteret: April 24, 2015; Udgivet: 3 Juni 2015

Copyright: © 2015 Leidinger et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er en af ​​de mest dødelige kræftformer hos mænd verden over og den næsthyppigste cancer-relaterede dødsårsag i USA. I 2012 blev prostatakræft skønnes at tegne sig for mere end 417.000 nye tilfælde og 92.000 kræft dødsfald i Europa [1]. For det meste er mere end to tredjedele af alle prostatakræft diagnosticeres hos mænd i alderen 65 år og ældre. [2] Prostatakræft er ofte præget af en gradvis udvikling og fremskridt. [3] I henhold til histologiske mønstre af carcinomaceller de fremskridt prostatakræft er klassificeret af Gleason score:. veldifferentierede carcinomceller (Gleason score 2-4), moderat differentierede carcinomceller (Gleason score 5-7), og dårligt differentierede carcinomceller (Gleason score 8-10) [4] Prostatacancer patienter med Gleason score 8 til 10 køre en mere end tre gange højere risiko for at dø af prostatakræft inden for 10 år, end patienter med Gleason score 2 til 4 (8,3%). [5] Faktisk er sygdommen helbredes, når det er tidligt opdaget [2].

Cirka to tredjedele af de amerikanske mænd i alderen 50 og derover jævnligt-eller mindst en gang-screenet for prostatakræft. [6] Digital rektal eksamen (DRE), og prostata-specifikt antigen (PSA) screening er blevet veletablerede metoder i prostatakræft diagnose. Men DRE kræver lang tids erfaring i afsløring af kræft. Endvidere DRE er ikke en følsom værktøj til tidlig sygdom. Den detekterer ofte kræft på sene stadier. [7]

PSA, en serinprotease, er et organ specifikt molekyle produceret af prostata epitel. PSA test indført i 1980’erne giver mulighed for at opdage kræft uden et positivt DRE resultat. Ifølge den amerikanske Food and Drug Administration, som tillod PSA-test som diagnostisk værktøj i 1994 en PSA, niveau større end 4 ng /ml betragtes som en kritisk værdi. En PSA-niveau på under 4 ng /ml svarer til normalområdet. kan detekteres PSA enten som “fri” (frit PSA) eller “bundet” (PSA-ACT) -form i patienternes sera. [8] Stenman og medarbejdere vist, at mænd med et højt niveau af bundet PSA løber en større risiko for lidelse af prostatacancer henviser niveauet af frit PSA blev vist at være lavere i prostatacancerpatienter end hos mænd med benign prostatahyperplasi. [9] Partin et al. var i stand til at opdage prostatakræft med en følsomhed på 95% og en specificitet på 20% af en fri PSA-screening. [10] Selvom PSA screeninger nedsætte dødeligheden af ​​patienter med prostatacancer, screening metode er ineffektiv og fører til begrænsninger, som ofte resulterer i en høj falsk positive resultater efterfulgt af unødvendige prostata biopsier [11-13]. Endvidere ældre mænd har almindeligvis et højere PSA-niveau ikke svarer til nogen prostata sygdom. [14] High PSA niveauer er også påviselige i patienter, der lider benign prostatahyperplasi. [15] Derfor yderligere screeningsfremgangsmåder med højere effektivitet for kræft er nødvendige.

Biomarkører har udviklet sig til en nødvendig klinisk værktøj. Især kræft markører skal opfylde flere kriterier. De skal have en høj følsomhed og specificitet, være let at opdage, økonomisk, og betydeligt udtrykkes. Aktuelle undersøgelser viste potentialet i autoantistof screening i forskellige typer af kræft, fx lungekræft, brystkræft karcinom, ovarie tumor og meningeom. [16-19] Autoantistoffer afslører muligheden for tidlig opsporing og efterfølgende behandling. Starten af ​​autoantistof giver også en mere detaljeret indblik i molekylære processer i tidlig udvikling af sygdom. Vi beskrev for nylig et blodprøver fremgangsmåde under anvendelse af autoantistoffer for at identificere lungekræft med en følsomhed på 97,9% og en specificitet på 97,0%. [20] Desuden Wang og kolleger etableret en fag-protein microarray at identificere autoantistoffer i prostatacancer. [ ,,,0],21] i deres undersøgelse, de opdager prostatakræft med en specificitet på 88,2% og en sensitivitet på 81,6%. Faktisk undersøgelsen detekterede også flere proteiner med mindre homologi med kendte proteiner.

I den foreliggende undersøgelse beskriver vi et protein macroarray screening for at detektere autoantistoffer i prostatakræft patients`sera. I alt vi analyseret 136 blodprøver: 48 prøver af prostatacancerpatienter, 60 prøver af godartet prostatahyperplasi, og 28 blodprøver fra raske individer. Vi viser, at screeningen tillader diskrimination af sera af prostatakræft patienter og kontroller. Vi viser også, at immunogene antigener kan være nyttigt at skelne prostata cancer patienter fra godartede prostatahyperplasi patienter. Derudover kan patienter med benign prostatahyperplasi adskilles fra kontroller. Derudover har vi fokuseret på følgende spørgsmål:? Kan kombinationen af ​​PSA og autoantistof test forbedre følsomheden og specificiteten til diagnosticering af prostatakræft

PSA-test som en enkelt diagnostisk metode ofte fører til falske positive resultater. Ny biomarkør kan give mulighed for at øge følsomheden og specificiteten for prostatakræft. Specifik autoantistof screening sammen med PSA-test kan være et nyttigt diagnostisk værktøj til at opdage prostatakræft på et tidligt tidspunkt og reducere prostatakræft-relateret dødelighed. Desuden kan identifikation af nye immunogene antigener være et første skridt mod udviklingen af ​​nye behandlingsformer.

Materialer og metoder

studiepopulation

Blodprøver af patienter med prostatacancer og patienter med benign prostatahyperplasi blev opnået fra Institut for urologi, Saarland Universitetshospital. Blodprøver fra raske donorer blev opnået fra Institut for Hemostaseology og Transfusion Medicine, Saarland Universitetshospital. Serum blev fremstillet ud fra serum monovettes og opbevaret i 2 ml portioner ved -70 ° C. Alle prøver blev opnået med patienternes skriftligt informeret samtykke forud for deltagelse. Undersøgelsen herunder godkendelsesproceduren blev godkendt af den lokale etiske komité (Re.-No. 3755). I alt blev 147 sera analyseret oprindelse fra 49 prostatacancer (PSA) patienter, 70 benign prostatahyperplasi (BPH) patienter og 28 raske frivillige mænd. Detaljerede oplysninger om alle patienter og raske personer er angivet i tabel 1.

Protein macroarray screening

Vi screenede high-density protein makroarrays indeholdende 38.016

E

.

coli

udtrykte proteiner ifølge hex1 (human føtal hjerne-cDNA-ekspression) bibliotek med puljer af 150 sera fra patienter med forskellige tumor- og non-tumor sygdomme, herunder to puljer af PCa sera (5 sera per pool) og én pool af 5 BPH sera. [22] i alt 1.827 kloner, der var positive for autoantistoffer i mindst en serumpulje, blev udvalgt og spottet i dubletter på undergrupperingen filtre. Disse sub-makroarrays blev screenet med 49 PCa, 70 BPH og 28 normale sera (se S1 Fig).

I korte træk blev makroarrays vasket to gange i TBSTT (TBS, 0,05% Tween 20, 0,5% Triton X -100) og fire gange i TBS. Efter blokering med 3% fedtfri tørmælk i TBST (TBS, 0,05% Tween 20) blev makroarrays inkuberet natten over med fortyndet sera (1: 1000). Efter inkubation blev sera opbevares i en anden runde af inkubation. De makroarrays blev underkastet tre vasketrin med TBST efterfulgt af inkubation med 70 ° C stripping opløsning. Bagefter blev makroarrays vasket to gange i TBST og fire gange i TBS. Efter inkubering med blokeringsopløsning makroarrays blev underkastet anden runde af seruminkubation. Makroarrays blev vasket tre gange i TBST og inkuberet med sekundært antistof (kanin-anti-humant IgG, IgA, IgM-Cy5 (H + L), Dianova, 1: 1000). Endelig blev makroarrays vasket fire gange i TBST, to gange i TBS og tørret natten over. Signaler blev påvist ved scanning med Typhoon 9410 scanner (GE Healthcare).

Billedanalyse og statistik

Spot intensitetsværdier blev beregnet ved ARCADIA, et billede analyse software, som vi udviklet specielt til proteinarray evaluering [20]. Kort fortalt blev billedet af macroarray opdelt i subgrids. Disse subgrids blev yderligere opdelt i spot områder indeholdende ét protein spot. Endelig blev intensiteten af ​​hver plet beregnes som middelværdien af ​​alle pixels af det respektive protein spot.

Vi udførte standard fraktil normalisering for at minimere matrix-til-matrix variationer. Især for funktioner på kanten af ​​array vi observerede svagt faldende kvalitet. De respektive funktioner vil imidlertid potentielt forspænder analysen. Således har de respektive pletter blevet markeret som ikke er til rådighed. Dernæst vi udelukkede 169 protein pletter, der var fraværende på mere end 10 analyserede makroarrays. De resterende 1.658 kloner blev brugt til klassificeringer ved en lineær Support Vector Machine (SVM).

I alt 20 gentagelser af en standard 10-fold krydsvalidering blev udført og betyde følsomhed, specificitet og nøjagtighed for de fire klassifikation opgaver blev beregnet. Som et mål for informationsindholdet af enkelte antigener for deres evne til at differentiere sera fra to forskellige grupper areal under modtager-operator-egenskaber-kurve (ROC) værdier (AUC) blev beregnet. ROC kurve viser specificitet som funktion af 1-følsomhed. For hvert antigen blev alle normaliserede intensitet værdier for alle sera anvendt som tærskler til at skelne patient sera fra kontrollerne. Af alle disse tærskler, blev patient sera med intensitet værdi over tærsklen betragtes som sandt positive (TP), patient sera med intensitet værdi under tærskelværdien som falsk negative (FN). Følgelig blev kontrolsera med intensitet værdi under den tærskel, betragtes som sandt negative (TN), kontrol sera med intensitet værdi over tærsklen som falsk positiv (FP). Efterfølgende følsomhed (TP /(TP + FN)) og specificitet (TN /(TN + FP)) af alle tærskler blev anvendt til at beregne ROC-kurve og AUC værdi betragtede antigen. Hvis intensitetsværdier af den betragtede antigen i patientens sera er højere end i kontrol sera, AUC værdier går fra 0 til 0,5. AUC-værdier i området fra 0,5 til 1 bibringer en højere gennemsnitlig intensitet af antigenet i kontrolsera sammenlignet med patientsera. Vi overvejede antigener med AUC-værdier under 0,3 eller over 0,7 som oplysende for den givne klassificering. Endelig har vi beregnet hyppigheden af ​​seroreaktivitet mod antigenerne i de betragtede grupper ved hjælp af en plet intensitet tærskel på 50 for positiv seroreaktivitet. De macroarray data protein blev deponeret i den offentligt tilgængelige database Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/hjemmeside, GSE67068).

Validation

for at validere autoantistoffer mod immunogene kloner, vi købte respektive kloner fra Source Bioscience, dvs D02594, E19574, L16556, A22594, og C11549. Inserter blev sekventeret fra 5 ‘og 3′ enderne for at bekræfte identiteten og længden af ​​de repræsenterede antigener. Sequence data viste, at klon D02594 var en hybrid af de to proteiner YBX1 og PDP1, repræsenterer dets 5’afslutte det første 275aa i YBX1 og ved dens 3’-ende den sidste 91aa (starter ved aa446) af PDP1 med en ukendt linker sekvens ind imellem. Dette protein blev udelukket fra yderligere analyse. De andre 4 kloner blev bekræftet at omfatte sekvenser af RPS27A, RPL15, DDX54 og RPL7. For at bestemme tilstedeværelsen af ​​autoantistoffer mod disse antigener, brugte vi Xmap teknologi (Luminex, Austin, TX, USA). Kort sagt blev hans-mærkede antigener udtrykkes i

E

.

coli

efter leverandørens anbefalinger og oprenses ved hjælp af Ni-NTA agaroseperler og koblet til magnetiske mikrosfærer ifølge producentens instruktion med mindre modifikationer. Halvtreds pi af en beadmix indeholdende 1000 koblede mikrokugler pr analyseret protein blev inkuberet med sera fra patienter og kontroller (1: 400 fortyndet i 100 mM Tris-HCl pH 7,0, 1% BSA 300 mM, NaCl 0,1% Tween-20) i 2 timer ved RT på en ryster. blev påvist bundne autoantistoffer under anvendelse af en 1: 1 blanding af 2,5 ug /ml R-Phyco AffiniPure F (ab ‘) 2 Frag Gt anti-HMN IgG [Fcy] (Jackson ImmunoResearch kat 109-116-098) og 2,5 ug /ml R-Phyco AffiniPure F (ab ‘) 2 Frag Gt Anti-HMN IgG [F (ab’) 2] (Jackson ImmunoResearch kat 109-116-097). Efter 1 time inkubation med sekundære antistoffer, blev perlerne vasket tre gange med PBS-Tween 0,05% og målt med Luminex FlexKort 3D. Udover standard hypotesetest såsom t-test eller variansanalyse, er AUC beregnet. Endelig blev målingerne korreleret til Gleason score og PSA niveauer.

Resultater

I alt 1.827 cDNA-kloner blev screenet med 147 serumprøver, herunder 49 PCa sera, 70 BPH sera, og 28 sera fra raske mænd (tabel 1). Ud af disse sera vi valgt en alder-matchede delmængde, der omfattede 44 PCa og BPH sera, hver med en median alder på 67 år. Derudover sammenlignet vi delmængder af 36 sera fra patienter med PCA PSA-niveau 4 ng /ml og 33 sera fra BPH-patienter også med PSA-niveau 4 ng /ml.

Hyppigheden af ​​immunogene kloner

For at minimere vifte-til-matrix variationer i 147 analyserede makroarrays blev normaliseret ved hjælp standard fraktil normalisering. Vi vælger en plet intensitet tærskel på 50 til bestemmelse af positive seroreaktivitet. Vi udelukkede alle cDNA kloner, der udviste manglende seroreaktivitet på mere end 10 af de 147 arrays. Af de resterende 1658 cDNA-kloner, 1612 kloner reagerede med mindst en PCa serum. Hyppigheden af ​​seroreaktivitet varierede fra 2,3% til cDNA klone reagerede mindst med PCA sera, til 97,7% for de mest reaktive cDNA klon. Vi fandt 1613 kloner, der reagerede med mindst en BPH serum. Hyppigheden af ​​seroreaktivitet varierede fra 2,3% til 95,5%. Interessant, 1.533 kloner reagerede med normale sera (frekvenser fra 3,6% til 96,4%. Sammenligningen af ​​de ovennævnte kloner afslørede et overlap af 1.485 kloner mellem PCa, BPH og normale sera. De kloner kunne såkaldte naturlige autoantistoffer, der er til stede i hvert serum fra raske personer på bemærkelsesværdige konstante niveauer og karakteriseret ved minimale individuelle kvantitative variationer. [23] Venn-diagram i figur 1 viser fordelingen af ​​de reagerende kloner.

Venn-diagram viser fordelingen af ​​1658 omsætning kloner for de tre serum grupper (PCA, BPH, Normal). de fleste af klonerne er reaktive i alle tre grupper mens et lille antal kloner er bare reaktivt i hver enkelt gruppe.

Som de fleste af de analyserede antigener var reaktive i sera fra PCA patienter, BPH-patienter, såvel som raske kontroller de kloner syntes ikke at være meget meningsfuldt for yderligere tiltag. Derfor fokuserede vi på de kloner, som kun reagerede med sera fra en af ​​de tre serum grupper , dvs. enten PCa sera, eller BPH sera eller normal sera. Her fandt vi ti kloner kun reaktivt med mindst en PCa serum, kun 12 kloner reaktive med mindst en BPH serum og 5 kloner kun reaktivt med mindst en normalt serum. Med hensyn til seroreaktivitet frekvenser af hvert serum gruppe Resultaterne var noget skuffende, som højst kun syv af 49 PCa sera reagerede med PCA specifikke antigener, højst kun syv af de 70 BPH sera reagerede med BPH specifikke antigener, og kun én normal serum omsat med de 5 specifikke antigener kun findes i normale sera. Det synes derfor, at disse antigener kan afspejle individuelle variationer.

indholdet af immunogene kloner oplysninger

Som overvejer kun seroreaktivitet frekvenser pr serum gruppe synes ikke at være en god foranstaltning, vi beregnet for hver cDNA klone arealet under receiver operator karakteristika kurven (AUC) som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. AUC er et mål for indholdet oplysninger af hvert antigen til adskillelse af to forskellige serum grupper fra hinanden. Her viste det sig, at kloner, der reagerer med mere end én serum gruppe kan imidlertid have en høj informationsindhold til visse adskillelser.

AUC-værdierne for de 1.658 analyserede kloner, herunder 461 i-ramme-kloner, er opsummeret i tabel 2. Vi rangeret cDNA klonerne ifølge informationsindholdet de bidrog til de forskellige opgaver klassifikation. Kloner med en AUC-værdi 0,7 eller 0,3 blev anset for at være meget oplysende for en opgave givet klassifikation.

For diskrimination af PCa og normal sera, 199 kloner (12%) blev anset for at være oplysende, herunder 52 i-frame-kloner. Blandt de informative kloner, viste 78 kloner AUC-værdier 0,7, herunder 32 i-frame kloner og 121 kloner viste AUC-værdier 0,3, herunder 20 i-ramme-kloner. Den out-of-frame klon D20552 med en sekvens homologi til hjernen kreatinkinase (CKB) viste den lavest AUC værdi (AUC = 0,142) for diskrimination af PCa og normal sera. Denne klon var også informativ for diskrimination af BPH og normal sera (AUC = 0,190), men ikke for diskrimination af PCa og BPH sera (AUC = 0,466). Den out-of-frame-klon E03526 med sekvenshomologi til dimethylarginin dimethylaminohydrolase en (DDAH1) viste den højeste AUC værdi (AUC = 0,811). Igen, dette klon var også informativ for diskrimination af BPH og normal sera (AUC = 0,760), men ikke for diskrimination af PCa og BPH sera (AUC = 0,558).

klon D02594 med sekvenshomologi til nuklease følsomme element bindende protein 1 (YBX1) var den i ramme klon med den laveste AUC værdi (AUC = 0,209) og klonen A06579 med sekvenshomologi med protein (peptidyl-prolyl-cis /trans-isomerase) (Ben4) var den i-ramme klon med den højeste AUC værdi (AUC = 0,806).

i diskrimination af BPH og normale sera, 110 kloner (6,63%), herunder 24 i-ramme kloner blev anset for at være oplysende. Blandt dem, viste 39 kloner AUC-værdier 0,7, herunder 5 i-frame kloner og 71 kloner viste AUC-værdier 0,3, herunder 6 i-ramme-kloner. Ud-af-ramme klon C18596 viste den laveste AUC værdi (AUC = 0,144) for diskriminering af BPH og normale sera, dvs. viste denne klon et stærkere immunrespons med sera fra BPH-patienter sammenlignet med normale sera. Denne klon blev også informativt for diskrimination af PCa og normale sera (AUC = 0,236) og viste stærkere immunrespons i sera fra PCA patienter sammenlignet med normale sera. Men for diskrimination af BPH sera og PCa sera klonen C18596 nåede kun en AUC-værdi på 0,528, og havde derfor mindre information indhold til denne adskillelse. Den out-of-frame-klon E13519 med en sekvens homologi til oxidase (cytochrom c) samling 1-lignende (OXA1L) viste den højeste AUC værdi (AUC = 0,782) specifik for diskrimination af BPH og normal sera, dvs højere immunogenicitet i normale sera end i BPH sera. Men denne klon havde intet indhold til separation af PCa fra normale sera (AUC = 0,646) og for adskillelse af BPH fra PCa (AUC = 0,446) information. For diskrimination af BPH og normal sera klonen E19574 med sekvenshomologi til pseudogenet ligner ubiquitin og ribosomale protein S27a forløber blev identificeret som den mest informative i-frame-klon med AUC 0,3, dvs. højere immunrespons i sera fra BPH-patienter end i normale sera (AUC = 0,175). Den i-frame-klon L16556 med sekvenshomologi til ribosomale protein L15 (RPL15) blev identificeret som den mest informative i-frame-klon med AUC 0,7, dvs. højere immunogenicitet i normale sera sammenlignet med sera fra BPH patienter (AUC = 0,773).

Når man sammenligner PCa og BPH sera, 99,3% (1646 kloner) af de immunogene kloner viste AUC værdier mellem 0,3 og 0,7, hvilket betyder, at de er ikke-informative. Kun 18 informative kloner (1,09%), herunder fire i-ramme-kloner, blev tilbage. Blandt dem, viste 5 kloner AUC-værdier 0,3 og 13 kloner viste AUC-værdier 0.7. Den out-of-frame-klon N22510 med en sekvens homologi til MARCKS-lignende 1 (MARCKSL1) viste den højeste AUC værdi (AUC = 0,773) for diskrimination af PCa og BPH. Klonen A22594 viste laveste AUC værdi (AUC = 0,266). Begge kloner var også informativt for diskriminering af BPH og normale sera, men ikke til PCA sera vs. normale sera. Sidstnævnte klon A22594 var i ramme og derved klonen med den laveste AUC. Klonen C11549 med sekvenshomologi med 60S ribosomale protein L7 var i ramme klon med den højeste AUC værdi (AUC = 0,710).

I diskriminering af sera fra patienter med forskellige sygdomme i samme organ, dvs. , PCa eller BPH, tog vi også den præ-operative PSA værdi i betragtning. Derfor valgte vi 36 PCa sera og 33 BPH sera med PSA ≥ 4,0 ng /ml fra den første undersøgelse befolkning. Det overlap til den før omtalte alder-matchede serum kohorte var 32 PCa og 17 BPH sera. Den følgende klassificering afslørede 166 informative kloner, herunder 42 i-frame-kloner. Blandt de informative kloner, viste 81 kloner AUC-værdier 0.3, herunder 28 i-frame kloner og 91 kloner viste AUC-værdier 0,7, herunder 14 i-ramme-kloner. I diskrimination PCa versus BPH, hver med PSA ≥ 4,0 ng /ml, out-of-frame-kloner N12603 og N22510 viste de bedste AUC-værdier på 0,174 og 0,838 henholdsvis. Klon N12603 har sekvens homologi til cholinerge receptor nikotinsyre alfa (CHRNA2) og klone N22510 til MARCKS-lignende 1 (MARCKSL1). Interessant sidstnævnte klon N22510 var også klonen med den højeste AUC værdi for separation PCa versus BPH, uafhængig af PSA-niveau.

kloner A18602 (sekvenshomologi med ribosomalt protein S2 (RPS2)) og J04520 (sekvenshomologi med Y box-bindende protein 1 (YBX1)) var de i-ramme kloner med de bedste AUC-værdierne for 0,188 og 0,818, henholdsvis.

klassificeringsresultaterne Salg

Som beskrevet i Materialer og metoder sektion, blev klassificeringen foretages af en lineær Support Vector Machine (SVM). Her blev 20 gentagelser af en standard 10-fold validering kors udført og betyde følsomhed, specificitet og nøjagtighed for fire klassifikationsopgaver blev beregnet. Alle resultater klassifikation er anført i tabel 3. De bedste resultater blev opnået for klassificeringen BPH versus normal med en nøjagtighed på 86%. Klassificeringen PCa versus normal gav en nøjagtighed på 83,2%. Den værste klassificering nøjagtighed på 70,3% blev opnået for alder matchede prøver PCA versus BPH. Men i betragtning af den PSA-niveau i 4.0 klart forbedret klassifikationsselskaberne resultater. Her fik vi en nøjagtighed på 84,1%.

Validering

Siden af ​​avanceret teknologi ofte føre til falske positive biomarkør resultater, validering af uafhængige teknologi er afgørende. Fra den tidligere analyser, vi plukket fem kloner: D02594, E19574, L16556, A22594, og C11549. Disse svarer til proteiner RPS27A, RPL15, DDX54 og RPL7. Da re-sekventering viste, at klon D02594 var en hybrid af de to proteiner YBX1 og PDP1, blev det udeladt fra den statistiske analyse. Klonerne blev screenet med en kohorte af 84 personer, herunder 27 PCA patienter, 30 BPH patienter og 27 kontroller. En analyse af varians viste signifikante resultater for DDX54 (p = 0,03) og RPL7 (p = 0,04). En tredje klon, RPL15, lidt over tærsklen signifikans (p = 0,074).

I screening eksperimenter viste DDX54 en øget median seroreaktivitet i kontrol sera (44,9) og PCA-patienter (44,6) sammenlignet med BPH ( 41.2) patienter. Denne højere reaktivitet i kontrol sammenlignet med BPH patienter er blevet bekræftet af validering analyse (figur 2A). For det andet protein, RPL7, de første resultater øgede autoantistoffer i BPH patienter (44,8) sammenlignet med PCA patienter (39,0). Denne tendens blev også observeret i validerings- forsøg (Fig 2B). Selv om en smule ikke statistisk signifikant, blev den generelle tendens i højere seroreaktivitet mod RPL15 i normale prøver sammenlignet med både PCa og BPH patienter med succes gengivet i validering (fig 2C). Ved at korrelere protein udtryk for de PSA niveauer vi ikke observeret signifikante resultater.

Box-Whisker grunde til reaktivitet mod DDX54 (A), RPL7 (B) og RPL15 (C) med serum af patienter med benign prostata (BPH), prostata carcinom (PCA) og raske kontroller (N) i protein macroarray (venstre paneler) og Luminex validering (højre paneler). For hver gruppe, kasserne angiver 2. og 3. kvartil af seroreaktivitet, de knurhår viser minimum og maksimum værdi. De vandrette sorte streger angiver medianen seroreaktivitet i gruppen. Lignende tendenser seroreaktivitet er angivet med firkantede parenteser.

Diskussion

Der er almindelig enighed om, at PSA-screening er faldet dødeligheden af ​​PCA patienter i årevis. Ikke desto mindre er PSA-test er stadig et omstridt emne for det fører ofte til falske resultater, overdiagnostik og falsk terapi går sammen med høje omkostninger. [24] Identifikationen af ​​yderligere biomarkører, fx PCA3, GSTP1, AMACR eller miRNA, afslører mulighed for at forbedre prostatakræft afsløring. [25] Derudover kan nye biomarkører forbedre overvågningen og give et mere detaljeret indblik i fremskridt og udvikling af kræft.

i vores undersøgelse, præsenterer vi en kombination af autoantistof signatur med PSA-niveau. Vi screenede et sæt af 1.827 cDNA kloner med 49 PCa sera, 70 BPH sera, og 28 sera fra raske individer med protein macroarray analyse. Desuden har vi sammenlignet seroactivity af PCA patienter, BPH patienter og kontroller ved at beregne AUC-værdier. AUC-værdier 0,3 og 0,7 blev anset som informativ. I alt har vi identificeret 199 informative kloner (herunder 52 in-frame-kloner) til klassificering af PCa versus normale, 110 informative kloner (herunder 24 in-frame-kloner) for klassificering af BPH versus normal, og kun 18 informative kloner (herunder 4 i-frame-kloner) til klassificering af PCa versus BPH. Overvejer kun PCa og BPH sera med PSA niveauer 4,0 ng /ml, vi har registreret 166 kloner (herunder 42 i-frame-kloner) til klassificering af PCa versus BPH.

Vi var i stand til at adskille sera fra PCA patienter og kontroller med en nøjagtighed på 83,2%, en følsomhed 70,2% og en specificitet på 91,5%. BPH sera og normale sera blev separeret med en nøjagtighed på 86,0%, en følsomhed på 73,9% og en specificitet på 93,6%. Den værste klassificering nøjagtighed med 70,3% blev opnået for PCa versus BPH. Interessant, forbedrer klassificeringen resultat efter taget PSA niveau 4,0 ng /ml i betragtning. Her har vi adskilt PCa sera og BPH sera med en nøjagtighed på 84,1%, en følsomhed på 84,5% og en specificitet på 83,8%. Dette er vigtigt, fordi denne metode gør det muligt at adskille malign sygdom fra godartet sygdom.

Vores resultater er baseret på specifikke reaktioner i immunsystemet. Udover PSA og andre biomarkører cancerassocierede antigener kan være meget specifik markør og egnet som diagnostisk værktøj. Immunsystemet genkender kræftceller ved at producere specifikke autoantistoffer mod disse cancer-associerede antigener. Autoantistoffer let kan afsløres i patients`sera. Desuden har de en lang halveringstid og er påviselige ved lave omkostninger. [26] De identificerede antigener påvises i sera fra PCA patienter og BPH-patienter kan tjene som biomarkører eller som mål for fremtidig behandling for patienter med forskellige prostata sygdomme. Antigenerne vi fundet, kan spille en funktionel rolle i udviklingen af ​​prostatacancer. I alt fandt vi 12 fag-peptid kloner med homologi med kendte proteiner. Kloner med homologi til CKB, DDAH1, YBX1, Ben4, OXA1L, pseudogen ligner ubiquitin og ribosomale protein S27a forløber, og RPL15 var informativt for diskrimination af normale sera og PCa og BPH, hhv. Kloner med homologi til 60S ribosomale protein L7, og MARCKS1 var informativt for diskrimination af PCa sera og BPH sera. Kloner med homologi til CHRNA2, RPS2, YBX1, og MARCKS1 var informativt for diskrimination af PCa sera og BPH sera taget PSA-niveau i betragtning. Interessant fagen-peptidet klon med en homolog sekvens til MARCKSL1 var meget informativ for klassificering af PCa versus BPH med og uden hensyntagen til PSA-niveau. MARCKSL1 er medlem af MARCKS familie, en gruppe af proteiner involveret i calmodulin (CaM) signalvejen, den proteinkinase C (PKC) signalvejen, og i reguleringen af ​​actincytoskelettet. [27] MARCKS kan være forbundet med