PLoS ONE: en ny tilgang til bestemmelse Cancer Genomisk Brudpunkter i overværelse af normale DNA

Abstrakt

CDKN2A

(koder p16

INK4a og P14

ARF) sletning, hvilket resulterer i både Rb og p53 inaktivering, er den mest almindelige kromosomale anomali i menneskelig cancere. Til præcist kortlægge sletning breakpoints er vigtigt at forstå den molekylære mekanisme af genomisk omlejring og kan også være nyttige til kliniske anvendelser. De nuværende fremgangsmåder til bestemmelse brudpunktet er enten af ​​lav opløsning eller kræver isolering af relativt rene cancerceller, hvilket kan være vanskeligt for kliniske prøver, der typisk forurenet med forskellige mængder af normale værtsceller. For at overvinde denne hurdle, har vi udviklet en ny tilgang, der er udpeget Primer tilnærmelse Multiplex PCR (PAMP), for at berige breakpoint sekvenser efterfulgt af genomisk fliser række hybridisering at lokalisere breakpoints. I en serie af proof-of-concept eksperimenter, var vi i stand til at identificere kræft-afledte

CDKN2A

genomiske breakpoints, når mere end 99,9% af vildtype genom var til stede i et modelsystem. Dette design kan skaleres op med bioinformatik støtte og kan anvendes til at validere andre kandidatlande cancer-associeret loci, der er afsløret af andre mere systemiske men lavere gennemløb analyser

Henvisning:. Liu YT, Carson DA (2007) A ny tilgang til Bestemmelse Cancer Genomisk Brudpunkter i overværelse af normale DNA. PLoS ONE 2 (4): E380. doi: 10,1371 /journal.pone.0000380

Academic Redaktør: David Levens, National Cancer Institute, USA

Modtaget: Februar 20, 2007; Accepteret: 27 mar 2007; Udgivet: 18 april, 2007

Copyright: © 2007 Liu, Carson. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes delvist af tilskud til UCSD NanoTumor center of Excellence for Cancer Nanoteknologi (CA119335), CA23100 (DAC) og AI36214-12S1 (YT L.) fra National Institutes of Health

Konkurrerende interesser:. det forfattere (Y.-TL DAC) har indgivet en foreløbig patentansøgning baseret på denne undersøgelse

Introduktion

Tumorer udvikle sig gennem løbende ophobning og udvælgelse af tilfældigt muterede gener.. Mens sæt af fordelagtige mutationer er valgt i tumorer, kan neutrale eller endda lidt skadelige mutationer også opstå på grund af genomisk ustabilitet og genetisk drift. For nylig har meget arbejde er blevet brugt til at identificere i primære humane kræftformer peger mutationer i exon af cancer-relaterede gener. Imidlertid har systemisk kortlægning af genomiske DNA-omlejringer vis forsinkelse, på grund af tekniske vanskeligheder ved at detektere mindre deletioner, tumor heterogenitet, og nødvendigheden af ​​at oprense maligne fra normale celler [1]. Historisk set blev dette arbejde udført af tidskrævende og arbejdskraftintensive genetik og molekylær kloning på etablerede kræft cellelinjer [2], [3], [4]. Et af de mest slående eksempler er homozygot sletning af

CDKN2A

(

INK4a /ARF

) tumor suppressor locus, som blev opdaget i denne og andre laboratorier [3], [4], [5], [6], [7], [8].

CDKN2A

sletninger forekomme tidligt under tumor udvikling [9], [10], [11]. Den p16

INK4a (en af ​​de

CDKN2A

produkter [12]) protein begrænser cellecyklusprogression af Rb-vejen og kan være ansvarlig for nedgangen i den replikative potentiale af stamceller under aldring [13] . Den p14

ARF (den anden alternative læseramme af

CDKN2A

[14]) genproduktet regulerer ekspressionen af ​​MDM2, omsætningen af ​​p53, og dermed styrer den cellulære reaktion på stress (revideret i [6 ], [7], [8], [15], [16], [17]). Fordi Rb og p53 veje er centrale for kræft gate-føring og bevogtning [18], [19], findes der stærke udvalg pres for afbrydelsen af ​​hele

CDKN2A

gen segment på begge kromosomer. Få andre sletninger er så godt karakteriseret, selv om det forventes, at flere vil blive fundet, når flere data fra matrix baseret komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) rapporteres og også gennem The Cancer Genome Atlas (TCGA) projektet [20], [21 ], [22], [23], [24]. Det vil være vigtigt at validere relevansen af ​​disse genomiske rearrangementer til udvikling af kræft, da mange af de genomiske strukturelle ændringer kan være simpelthen på grund af genome ustabilitet i kræft. undersøgelser i stor skala med kliniske prøver vil være den mest pålidelige bekræftelse.

Mens kan detekteres punktmutationer og meget små insertioner eller deletioner i genomisk DNA ved exon re-sekventering, kan det være vanskeligere at opdage gen dosis ændres af større genomiske fragmenter, især deletioner [1]. Aktuelle etablerede teknikker til sletning kortlægning, herunder Southern blotting [25], fluorescerende

in situ

hybridisering (FISH) [26], kvantitativ PCR [26], [27], [28], [29], [ ,,,0],30], og array-CGH [31] stole på fraværet af en påviselig vildtype signal [1]. Dette er problematisk, når et betydeligt antal normale celler er til stede i en tumorprøve. Array-CGH har potentiale til at analysere ændringer af DNA-kopital på en genom-plan med relativt høj opløsning, alt efter om BAC’er, PCR-produkter eller oligonucleotider anvendes til arrayelementerne. Men disse teknikker mislykkes ofte hvor der er en heterogen cellepopulation eller prøver af dårlig kvalitet [31]. FISH er mindre sårbar over for tilstedeværelsen af ​​heterogene cellepopulationer, men har relativt lav opløsning og er vanskelig at opskalere. Bortset FISH, de andre teknikker nævnt, er ikke praktisk for kortlægning genomiske translokationer og inversioner. End-sekventering profilering blev udviklet for at løse dette problem, men tilgangen var dyrt og svært at skalere op [32]. Derfor er der et behov for at udvikle en skalerbar tilgang til påvisning af sådanne genomiske strukturelle ændringer i solide kræftsvulster, hvor heterogene cellepopulationer er til stede.

Her rapporterer vi en ny tilgang, der er udpeget som Primer Tilnærmelse Multiplex PCR (PAMP), at berige små mængder af slettede genomiske DNA-sekvenser i nærvær af vildtype-DNA. De genomiske placeringer af berigede sekvenser efterfølgende afkodes af en genomisk flisebelægning array og bekræftet ved sekventering.

Resultater

CDKN2A

locus

CDKN2A

er placeret på kromosom 9p21 (figur 1). Det koder to proteiner i forskellige læserammer: p16

INK4a og P14

ARF, som begge har 3 exons og dele exon 2 og 3.

CDKN2B

(p15

INK4B) og

MTAP Hotel (methylthioadenosin phosphorylase) (ikke vist) er centromere og telomere tilstødende gener henholdsvis [3], [17], [33], [34]. BAC-klon RP11-149I2 indeholder hele

CDKN2A

genomisk fragment og blev brugt som skabelon til at generere prober (ekskl repetitive regioner) til udskrivning på den minigenomisk fliser array. Hyppigheden af ​​repetitive sekvenser forudsagt af RepeatMasker vises i bunden af ​​diagrammet.

Den genomiske kort dækker omkring 55 kb omkring

CDKN2A

ifølge Ensemble [59].

CDKN2A

/B ligger på kromosom 9p21 og deres RNA-produkter kodes af den omvendte streng.

CDKN2A

koder 2-proteiner (p16

INK4a og P14

ARF), der deler de samme exon 2 og 3. De første exoner af

INK4a

og

ARF

er omkring 20 kb fra hinanden.

CDKN2B

koder p15

INK4B der er homolog med p16

INK4a. Ud over udskrifter, kortet viser også repetitive sekvenser (Gentag) og tilgængelig BAC klon (Human tilepath kloner), RP11-149I2.

Primer Tilnærmelse Multiplex PCR (PAMP)

det er vanskeligt at detektere en lille brøkdel af slettede mutant genomisk DNA i nærvær af et stort overskud af vildtype DNA med matrix CGH eller andre populære molekylærbiologiske værktøjer [26], [27], [35]. I typisk forurenede tumorprøver, er genomisk DNA sammensat af forskellige forhold mellem WT og

CDKN2A

mangelfuld DNA. Vi havde til formål at drage fordel af det faktum, at en kortere slettet genomsekvens bør fortrinsvis amplificeret i sammenligning med en meget længere WT sekvensen ved hjælp af “tilnærmet” flankerende primere (figur 2A) [36].

Effektiviteten af ​​PCR-amplifikation er omvendt relateret til afstanden opstrøms og nedstrøms primere. I dette eksempel til primere opformere genomiske sekvenser omkring locus af interesse (LOI) er opdelt i 20 grupper: 10 hver for forlæns (F1-F10) og reverse (R1-R10) grupper (A). Mens alle de mulige fremadrettet og revers primer par er for langt til hinanden til PCR-amplifikation i vildtype-genomet, er visse par af primere bringes tættere ( “tilnærmet”) på grund af deletion (F3 og R3) i muterede genom. Multiplex PCR-reaktioner fastsættes og repræsenteret som en matrix til at omfatte en fremadrettet og en revers primer gruppe. De forventede PCR-resultater er vist som skala skygger i matrixen (B) grå. Dette eksempel viser, at kun gruppens par tæt på breakpoint opnåelse PCR-produkter (F3-R3, F3-R4, F4-R3).

Fremgangsmåden er illustreret i figur 2. I dette eksempel relativt jævn -spaced primere (gennemsnit 1 kb fra hinanden) omgiver locus af interesse er inddelt i 20 grupper til PCR. Der er 10 grupper med hver af fremadrettede primere, F1, F2 …, F10 og revers primer R1, R2, …, R10, henholdsvis (figur 2A). Derfor er der 100 par (F1-R1, F1-R2, …, F1-R10; F2-R1, F2-R2, …, F2-R10; …;. F10-R1, F10-R2, …, F10- R10) i PCR-reaktioner (figur 2B). Det forventes, at kun en eller to par af PCR-reaktioner vil producere specifikke PCR-produkter, der spænder over deletion grænse, da de andre primerpar skal være for langt væk fra breakpoint for effektiv amplifikation. Derefter alikvoter fra hver reaktion kan blandes til at hybridisere på en enkelt genomisk flisebelægning array. I modsætning til traditionelle matrix-CGH, ​​forventes det, at kun pletter repræsenterer genomiske sekvenser nær brudpunkterne vil blive teoretisk lyser op, hvilket blev bekræftet i de følgende eksperimenter.

For at øge gennemløbet og reducere omkostningerne af reagenser , hver fremad (F1-10) og omvendt (R1-10) primer gruppe kan have flere primere. Derfor hver PCR-gruppe (for eksempel F1-R1) parret bliver multiplex-PCR. Derfor vi har udpeget denne procedure som Primer Tilnærmelse Multiplex PCR (PAMP).

sletning breakpoint kloning ved PAMP og minigenomisk fliser vifte

Vi rapporterede tidligere, at Detroit 562 cellelinje har en omtrentlig 20 kb (herunder

INK4a

exon 1 og 2) sletning på kromosom 9p21 [3]. Vi brugte denne cellelinie for at teste vores sletning scanning tilgang. Fire grupper (F

A, F

B, R

Y og R

Z) af primere blev anvendt til fire Pamp reaktioner (figur 3A) under anvendelse af genomisk DNA-template enten fra Detroit 562 (

CDKN2A

mangelfuld) eller HEK293 (

CDKN2A

vilde typen) cellelinier. Portioner af alle 4 Pamp reaktionsprodukterne blev poolet og mærket til hybridisering på en

INK4a

minigenomisk flisebelægning array, der dækker omkring 25 kb, herunder alle de exoner

INK4a

. Som forudsagt i figur 2, kun pletter med prober, tæt på de breakpoints hybridiseret til amplikoner når Detroit 562 genomisk DNA blev anvendt som en skabelon (figur 3B). Næsten intet signal blev påvist, når HEK293 genomisk DNA blev anvendt som template. Styringen HEK293 prøve havde en signifikant højere signal på Cot-1-DNA pletter trods sin generelle absolutte signal intensitet er lav.

(A) Fem grupper af primere (F

A, F

B, R

x, R

Y og R

Z, de små pile og pilespidser) nær de potentielle breakpoints blev genereret for PAMP baseret på vores tidligere kortlægning [3]. De kortlagte

CDKN2A

breakpoints i Detroit 562 cellelinje (figur 5) er angivet for afklaring. Den “E1”, “E2” og “E3” betegnelser (blå skrifttyper) er de relative positioner af

INK4a

exons. Den første exon af

ARF

er længere til højre for denne diagram og er ikke omfattet af dette array. De flisebelægning prober til array er angivet med to skiftende farver (korte sorte og orange linjer) for at lette identifikation. (B) Den første række i

INK4a

minigenomisk vifte blev spottet med flisebelægning prober vist i panel A. Cot-1 DNA (repetitiv sekvens af genomisk DNA) pletter er angivet på denne array. Resten af ​​pletterne er sildesperm DNA. Både Cot-1 og sild sperma DNA anvendes som ikke-specifikke kontroller. Denne matrix blev hybridiseret med mærkede prøver afledt fra to cellelinier. De samme sæt primere (F

A, F

B, R

Y og R

Z) blev anvendt til Pamp reaktioner på Detroit 562 (mutant) og HEK293 (vildtype) genomisk DNA til kortlægge de potentielle

CDKN2A

breakpoints. Amplikonerne blev mærket med forskellige farvestoffer, hvilket gav et grønt signal (Cy-3) for mutanten prøven og et rødt signal (Cy-5) til vildtype prøven, som skal samtidigt hybridiseret på array’et (tofarvet array). De to grønne pletter på den første række afslørede breakpoint placering som diskuteret i figur 2.

Derudover blev fire separate arrays anvendes til at hybridisere de enkelte Pamp produkter beskrevet ovenfor. En simpel plot af signal intensitetsforhold af mutante /WT PCR-produkter på flisebelægning arrayet afslørede den genomiske placering af brudpunktet (figur 4). Denne analyse viser en meget enkel udlæsning-placeringen af ​​sletningen er omgivet af to toppe. Kun F

B-R

Y (array 27) og alle produkter pooling (array-29) giver det samme resultat, som vist i figur 3. I modsætning til de tre andre par gav kun svage baggrund signaler på arrays. Dette resultat indikerer, PAMP produkt pooling med et enkelt array analyse giver samme breakpoint oplysninger som fire individuelle arrays. Dataene understøtter de originale eksperimentelle forudsigelser, og tyder på, at proceduren skal være generelt anvendelig til sletning og translokation scanning.

Fire grupper (F

A, F

B, R

Y og R

Z) af primere blev anvendt til fire Pamp reaktioner hver ved parring alle de mulige forward og reverse primer grupper under anvendelse Detroit 562 (mutant) og HEK293 (kontrol) som skabeloner. Proceduren er kort beskrevet i figur 3. Produkterne blev mærket og anvendt til opstilling hybridisering: F

A-R

Y for arrayet 25; F

A-R

Z for opstilling 26; F

BR

Y for opstilling 27 og F

AR

Z for opstilling 28. Prøver af de enkelte Pamp prøver blev også samlet sammen og mærket til matrix hybridisering (array 29, sin vifte billede vises i figur 3B). Resultaterne er præsenteret med forholdet signalintensitet (Y-akse) af prøver fra Detroit 562 (mutant) og HEK293 (kontrol) mod sonden placering (X-aksen). De breakpoints kan identificeres gennem dette plot ved at finde de to toppe, der er analoge til de lyse grønne pletter i figur 3B.

For at lokalisere mere præcist området for sletning, indlejret PCR med par af specifikke primere designet ifølge de tidligere Pamp resultater. PCR-produktet blev mærket for arrayet hybridisering, hvilket gav et resultat meget lig den vist i figur 4 og er vist i figur 5A. Desuden blev den eneste større produkt af PCR-reaktioner forsvandt ved agarosegelelektroforese, udskåret, udvundet og sekventeret (figur 5B). Den breakpoint klonede er i overensstemmelse med to andre rapporter (Figur 5B) [37], [38].

For at kortlægge den nøjagtige breakpoint, blev et indlejret sæt PCR-primere designet til Uniplex PCR baseret på den tidligere PAMP resultater (figur 3 og 4). PCR-produkterne blev anvendt til mærkning og hybridiseret på arrayet og også for agarosegelelektroforese. Grupperingen data er vist som den samme plot i figur 4. Et enkelt større bånd på agarosegelen blev udskåret og oprenset til sekventering (B). Den breakpoint er indikeret (fra # 21.975.226 til # 21.960.809 ifølge NCBI menneskelige genom sekvens bygge 36).

For at efterligne den heterogen population af kræft og værtsceller typisk findes i solide tumorer, forskellige mængder af genomisk DNA afledt fra Detroit 562 (mutant) og HEK293 (vildtype) blev blandet i PAMP og array-hybridisering. For at teste følsomheden af ​​vores tilgang, udførte vi en titrering eksperiment. Den samlede genomiske DNA for hvert assay blev holdt konstant (100 ng). Det svarer til omkring 28.000 eksemplarer af haploide genom (baseret på estimatet på 2,8 × 10

5 molekyler /gg af haploid genom).

CDKN2A

udgår cellelinie Detroit 562 blev serielt fortyndet med

CDKN2A

vildtype HEK293 som angivet i tabel 1. Assayet var i stand til at detektere ca. 1 breakpoint sekvens i nærvær af et ca. 2000 gange overskud af vildtype-genom med følsomhed på 5-16 sådanne molekyler (tabel 1). Således pAMP fremgangsmåde tilvejebringer en fremgangsmåde til påvisning af genomiske DNA-deletioner i nærvær af mere end 99,9% vildtype DNA.

pAMP breakpoint kloningsstrategi blev bekræftet i en anden cellelinie. Fordi vores vifte dækker kun 25 kb af genomet, vi scannet vores tidligere kortlægning på 100 cellelinjer at finde en, der kunne have breakpoints i denne region [3], [33]. Den Hs578T brystcancercellelinje har en deletion i p16

INK4a exonerne 1-3. Med primere inden og telomert (F

A og R

X-grupper, tabel 2) til den genomiske fragment, udførte vi PAMP og array-hybridisering, og identificerede en enkelt plet på arrayet (vist som en enkelt top i figur 6A). Sekvensen af ​​denne probe er placeret fra 69971 til 71219 i RP11-149I2 BAC-sekvensen (GenBank-adgangsnummer AL449423). Derfor bør centromerregionen ende af breakpoint være placeret i nærheden af ​​denne region. Uniplex PCR med primere fra de to grupper for PAMP blev udført til sekventering. Et PCR-produkt ca. 2 kb blev genereret med et par af primere og blev udsat for direkte sekventering (figur 6B). Centromerregionen ende af breakpoint identificeret ved PAMP er i overensstemmelse med en tidligere rapport [37]. Den telomere ende af breakpoint blev udledes af de anvendte primere for PAMP og også bekræftet ved direkte sekventering, selv om der ikke var nogen genomisk sonde nær breakpoint, der var inkluderet på array’et

To grupper af primere:. F

A (F

A1-F

A4) og R

X (R

X1-R

X5) blev anvendt til PAMP baseret på vores tidligere kortlægning. Produktet blev mærket for arrayet hybridisering (A). Kun enkelt top fremgår af plottet. Det indikerer placeringen af ​​anden breakpoint er ikke omfattet af denne minigenomisk array. To primere (R

X3 og R

X4) placeret nær den genomiske placering af sonden (humant kromosom 9, 21969229 til 21970477, NCBI bygge 36), blev hybridiseret og to primere (F

A1 og F

A2) placeret uden array dækning blev valgt til Uniplex PCR. F

A2-R

forventes X3 par at have den korteste afstand, når en sletning opstår. Et bånd på ca. 2 kb på agarosegel blev udskåret fra gelen, oprenset og sekventeret (B). Den breakpoint og placering er angivet (fra # 21.955.827 til # 21.968.338 ifølge NCBI menneskelige genom sekvens bygge 36).

Diskussion

Vi har udviklet en generel strategi, der kan søges indkredse de genomiske breakpoints i urensede primære kræftformer. Den her beskrevne amplifikation og flisebelægning protokol muliggør en enkel og præcis

CDKN2A

breakpoint kloning, med kontamineret DNA som skabelon. I modsætning til de nuværende tilgængelige teknikker til sletning kortlægning (herunder Southern blotting, fluorescerende

in situ

hybridisering, real time PCR, og array CGH), der er afhængige af fraværet af en påviselig vildtype signal, PAMP direkte måler udgår DNA. Derfor er denne fremgangsmåde er langt mindre sårbar over for problemer forbundet med normal forurening celle. Den eksperimentelle fremgangsmåde er robust nok til at afsløre deletioner i nærvær af forurening vildtype mindst 99,9% sekvens, der ikke kunne opnås ved andre procedurer [3], [5], [26], [27], [28], [33], [35], [39].

Primer tilnærmelse PCR-screening har været et nyttigt redskab til isolering deletionsmutanter i

C. elegans

[36]. Metoden bygger på at identificere et enkelt bånd, der er produktet af en vellykket PCR-reaktion, når et par af specifikke primere er bragt sammen ved deletion, på en agarosegel. Proceduren kan kun identificere sletninger, der sker i en meget lille genomisk fragment (3 kb) i et relativt lille produktion mode. Det lider også af relativ høj falsk positiv sats, fordi identiteten af ​​båndene på agarosegel er vanskeligt at vide. Men ved at anvende multiplex-PCR sammen med en genomisk flisebelægning array, kan man samtidigt screene et større udvalg af genomiske regioner [40]. Desuden præferentiel amplifikation af sekvenserne nær brudpunkterne genererer en forholdsvis enkel udlæsning på fliser array. Signal-støj-forhold på de hybridiserede pletter er indlysende i forhold til udlæsningen fra arrayet CGH (se figur 4). Krydset kan let identificeres, så længe den ene ende af den nærliggende genomiske placering af brudpunkterne er dækket af fliser array, som vist i tilfældet med Hs578T brystcancer celle (figur 6). Da højdensitets-genomiske flisebelægning arrays er kommercielt tilgængelige, kan denne tilgang let vedtaget. Derudover kan high-throughput genomsekvensering teknologi også lokalisere den nøjagtige breakpoint sekvens efter PAMP, uden om behovet for arrayet hybridisering [41], [42], [43].

Vi anvendte multiplex-PCR til at reducere arbejdsbyrde og omkostninger for PAMP. Vi var i stand til at multiplekse 28 primere let i en enkelt PCR-reaktion. Teoretisk kan man dække over 90% af de 0,5 Mb af genomisk fragment rundt

CDKN2A

locus med i alt 500 primere i en enkelt PCR-reaktion gennem beregningsmæssige simulation, som vil blive beskrevet andetsteds (manuskript indsendt). En nylig papir rapporteret en vellykket multiplex-PCR med mere end 1000 primerpar gennem hjælp af beregningsmæssige design [44]. PAMP tilgang målrettet deletion størrelser mellem 10 kb og 1 Mb. De mindre eller større sletninger kan påvises ved igen at sekventere og FISH henholdsvis.

Ligesom andre PCR-teknologier, kan PAMP let vedtaget til et robotsystem til kliniske og forskningsmæssige formål. Et eksempel på en potentiel klinisk anvendelse er at anvende den unikke breakpoint sekvens som en personlig cancer-specifik biomarkør for overvågning sygdom efter behandling, når den præcise brudpunkt er blevet kortlagt. For eksempel, i modsætning til mange nuværende tumormarkører, såsom CA19-9, CA125 og PSA, som ikke rigtig kræftspecifikke,

CDKN2A

breakpoints er specifikke og enestående for hver kræft med dette locus slettet. En yderst følsomme assay, såsom realtids-PCR, kan designes til at overvåge status for cancer progression i blodet eller andre kropsvæsker. Assayet skal være meget specifik, fordi amplifikation forventes kun at forekomme fra deletion-holdigt DNA på grund af meget lange afstand mellem primerne i vild type genomet (se Figur 2). Dette er analogt til påvisning af en udenlandsk virus sekvens, som er blevet anvendt som en nyttig biomarkør for Epstein-Barr virus associeret nasopharyngeal karcinom [45], [46].

Vores tilgang kan også lette traditionel labora- intensive forsøg, der har til formål at forstå, hvordan genomisk breakpoints genereres under udviklingen af ​​kræft, især i primære tumorer. Selvom uægte V (D) J rekombination kan være ansvarlig for at skabe

CDKN2A

deletioner i akut lymfoblastær leukæmi, vil blive behov for flere breakpoint sekvensdata for andre typer af kræft til at afgrænse de molekylære mekanismer [37], [38] , [47], [48]. Desuden kan den i dette dokument teknik bruges ikke kun til sletning kortlægning, men det kan også anvendes til at kortlægge andre typer genomisk omlejring, såsom translokationer og inversioner. Svarende til tilfældet med genomisk deletion (se figur 2), kun “tilnærmet” primere kan generere amplikoner når disse primere er nær de genomiske fragmenter, der er genanbragt i translokationer og inversioner.

Brug breakpoint sekvenser som kræftspecifikke biomarkører til at overvåge minimal resterende sygdomme er blevet udforsket [49], [50], [51], [52], [53]. overvågning sygdom baseret på personlig genomisk DNA breakpoint anses for at være særdeles attraktivt tilgang af flere årsager [49]. Først mange genomiske DNA omlejringer direkte relateret til onkogen proces, derfor er virkelig cancer-specifikke og stabil over tid. Dette er i modsætning til mere bekvem Ig /TCR omlejring baseret assay. Faktisk fandt vi nøjagtig det samme

CDKN2A

breakpoints for de to cellelinier anvendt i denne undersøgelse som rapporteret af andre. For det andet DNA er mere stabilt end RNA selvom det er lettere at kortlægge fusion transcript, hvis den eksisterer, såsom

BCR-ABL

. For det tredje, de genomiske breakpoints er meget sandsynligt at være forskellige fra hver patient og blive personlig biomarkører derved reducerer risikoen for falske positive resultater grundet krydskontaminering. Men det er også den største forhindring at overvinde. For eksempel mange bestræbelser på at forbedre PCR-amplifikation rækkevidde til detektering

C-MYC-service /immunoglobulin translokationer har haft begrænset succes, fordi de breakpoints er spredt over en mere end 300 kb region [54], [55], [ ,,,0],56]. Vores strategi kan være nyttige for en sådan anvendelse.

Vores tilgang har til formål at identificere breakpoints i en 1 Mb genomisk fragment som fisk eller andre cytogenetiske teknikker er til rådighed for større genomiske omrokeringer og omkostningerne og arbejdskraft øge når målområdet udvider. Vi er i stand til billigt at producere en flisebelægning vifte der dækker et genomisk fragment på 0,5 Mb rundt om

CDKN2A

med 1 kb opløsning. Vi arbejder i øjeblikket på metoder til at øge multiplexing og reducere mængden af ​​hver PAMP reaktion til bredere programmer.

Materialer og metoder

Cell kultur og prøve forberedelse

cellelinjer beskrevet i artiklen blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) og dyrket som anbefalet. Den genomiske DNA blev ekstraheret med DNAzol (Molecular Research Center, Inc., Cincinnati, OH) at følge instruktionerne fra producenten.

minigenomisk flisebelægning vifte

Vi skabte en

INK4a

minigenomisk flisebelægning vifte der dækker en 25 kb fragment i

CDKN2A

locus for at bevise begrebet vores tilgang. DNA-prober blev genereret ved PCR med BAC klon RP11-149I2 (fås fra BacPac Resources Center på Børnehospital Oakland Research Institute, Oakland, CA) som skabelon og undgå de gentagne genomiske sekvenser, der blev forudsagt af RepeatMasker. PCR-produkterne blev oprenset med DNA Clean-up og Concentrator-5 (Zymo Research, Orange, CA), resuspenderes i 3 x SSC og udskrives på poly-L-lysin objektglas ved 0,1 mg /ml sammen med human Cot-1-DNA ( Invitrogen, Carlsbad, CA), som er beriget for repetitive sekvenser, og sildesperma DNA (Promega, Madison, WI), som blev anvendt som ikke-specifik kontrol. Proceduren for udskrivning er blevet beskrevet og væsentlige fulgte vejledningen til DeRisi arrayer med silicium microcontact udskrivning stifter (parallel syntese Technologies, Inc. Santa Clara, Californien) [57], [58]. Arrays blev efterbehandlet med ravsyreanhydrid-baseret fremgangsmåde til blokering før hybridisering som tidligere beskrevet [57]. Protokollerne relateret til vifte trykning og hybridisering i almindelighed dette papir findes i microarrays.org (https://derisilab.ucsf.edu/microarray/protocols.html).

Primer-tilnærmelse Multiplex PCR (PAMP ) og array hybridisering

En forenklet PAMP ordning er vist i figur 2. En serie af primere (tabel 2) mod

INK4a

exon 1-2 langs

CDKN2A

locus blev syntetiseret ved Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Grupper af forward og reverse primere (250 nM hver i den endelige reaktion) blev anvendt til frembringelse amplikoner fra 0,1 ug af genomisk DNA skabeloner i alt 10 pi opløsning blandes med 10 pi Taq 2 × Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA). Reaktionen blev samlet ved 4 ° C i en PCR-arbejdsstation og overføres til en thermocycler med blokken forvarmet til 94 ° C. Cykliseringsbetingelserne var 3 minutters denaturering ved 94 ° C efterfulgt af 35 cykler ved 92 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek og 68 ° C i 2,5 minutter med en endelig ekstension trin ved 68 ° C i 5 minutter. En pi af urenset produkt blev efterfølgende anvendt som templates for en anden runde af amplifikation at mærke amplikoner med samme PCR-protokol bortset fra, at dTTP blev erstattet af en 04:01 blanding af aminoallyl dUTP (Ambion, Austin, TX) og dTTP for probe mærkning . De mærkede amplikoner blev oprenset med DNA Clean-up og Concentrator-5 kolonner, elueret i 9 pi natriumbicarbonat (pH 9,0) og koblet med 1 pi DMSO opløste Cy3 eller Cy5 NHS-estere (GE Healthcare, Piscataway, NJ) i 30 til 60 minutter. Cy3 og Cy5 mærkede amplikoner blev oprenset med DNA Clean-up og Concentrator-5 søjler og elueres med 10 pi 10 mM Tris-HCI (pH 8,0). Parrede Cy3 og Cy5 mærkede amplikoner blev kombineret med 3,6 pi 20 x SSC, 0,5 pi HEPES (pH 7,0) og endelig 0,5 pi 10% SDS. Den blandede opløsning blev opvarmet i 2 minutter ved 95 ° C, afkøles til stuetemperatur og hybridiseret til de minigenomisk flisebelægning arrays ved 63 ° C natten over i det væsentlige som tidligere beskrevet [57], [58]. De hybridiserede arrays blev vasket og scannet med GenePix 4000B scanner (Molecular Device, Sunnyvale, CA) og analyseret af GenePix Pro 6.0 software.

Fliselægning array-dataanalyse

Den menneskelige Cot-1 DNA og sildesperm-DNA blev designet til at være positive og negative kontroller og plettet flere gange på arrayet (se figur 3). At normalisere for dag-til-dag og prøve-til-prøve variation, blev den mediane intensitet af alle funktioner repræsenterer sildesperm DNA (

I

50% -HS

), der anvendes til at opdele intensitet (

i

G

) for hver funktion repræsenterer genomiske prober. Hver (

I

G

): (

I

50% -HS

) ratio, det normaliserede genomiske probe signal, blev plottet på Y-aksen mod den tilsvarende sondens genomisk placering på X-aksen for at lette fortolkningen af ​​data (se figur 4).

CDKN2A

breakpoint kloning

for at bekræfte

CDKN2A

breakpoint kortlægning af PAMP tilgang, de genomiske fragmenter flankerer de breakpoints blev klonet ved traditionel PCR tilgange styret af resultaterne fra PAMP. To eksempler er givet i dette papir

Detroit 562 cellelinje

:. Den indlejrede fremgangsmåde blev anvendt til at klone den

CDKN2A

breakpoint i Detroit 562 humane epitelial carcinomceller. Primerne blev designet med spor fra pAMP eksperimentet (se figur 3 og 4). Eksterne primere (AGGTTTGGTTAAGAGTCGTTC og AAGATCTATATGGTGGCCTTTAG) blev anvendt i 35 cyklusser af PCR (92 ° C, 30 sekunder; 55 ° C, 30 sekunder; 68 ° C, 2 minutter).