PLoS ONE: Menneskelig equilibrativ nukleosid Transporter-1 Knockdown Tunes Cellular Mechanics gennem Epithelial-Mesenchymale Transition i bugspytkirtelkræftceller

Abstrakte

Vi rapporterer celle mekaniske ændringer i respons til ændringer af ekspressionen af ​​det menneskelige equilibrativ nukleosid transporter-1 (hENT1), en mest rigelige og udbredte plasmamembranen nukleosid transporter i humane celler og /eller væv . Modulering af hENT1 ekspressionsniveau ændret stivheden af ​​pancreascancer Capan-1 og Panc 03.27 celler, som blev analyseret ved atomic force mikroskopi (AFM) og korreleret til mikrofluid platform. Den hENT1 knockdown induceret reduktion af cellulær stivhed i begge celler op til 70%. Derudover blev observeret cellulære fænotypiske ændringer såsom cellemorfologi, migration, og ekspressionsniveauet af epitel-mesenchymale overgang (EMT) markører efter hENT1 knockdown. Celler med undertrykt hENT1 blev aflange, migrerede hurtigere, og havde reduceret E-cadherin og forhøjede N-cadherin i forhold til forældrenes celler, som er i overensstemmelse med epitelial-mesenkymale overgang (EMT). Disse cellulære fænotypiske ændringer tæt korreleret med ændringer i cellulær stivhed. Denne undersøgelse tyder på, at hENT1 udtryk niveau påvirker cellulære fænotype og celle elastisk adfærd kan være en fysisk biomarkør for kvantificere hENT1 udtryk og opdage fænotypisk skift. Desuden kan Cellemekanik være en kritisk redskab til at opdage sygdommen og respons på behandling

Henvisning:. Lee Y, Koay EJ, Zhang W, Qin L, Kirui DK, Hussain F, et al. (2014) Humant equilibrativ nukleosid Transporter-1 Knockdown Tunes Cellular Mechanics gennem Epithelial-Mesenchymale Transition i bugspytkirtelkræftceller. PLoS ONE 9 (10): e107973. doi: 10,1371 /journal.pone.0107973

Redaktør: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina

Modtaget: Juli 3, 2014 Accepteret: August 16, 2014; Udgivet: 14 Oktober 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Forfatterne takker økonomisk støtte fra følgende kilder: Department of Defense giver W81XWH-09-1-0212 og W81XWH-12-1- 0414, National Institute of Health giver U54CA143837 og U54CA151668, den CPRIT tilskud RP121071 fra staten Texas, og Ernest Cockrell Jr. Distinguished Begavet Chair. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas adenocarcinom (PDAC) er en af ​​de mest dødelige menneskelige kræftformer med en yderst dårlig prognose [1]. PDAC har lav overlevelsesrate, selv efter fuldstændig resektion af tumoren, som er den eneste mulighed for helbredelse. Desværre er de fleste af tumorer er inoperabel og metastatisk. Således, kemoterapi og /eller strålebehandling er de eneste muligheder [2], [3]. Gemcitabin (2 ‘, 2’-difluordeoxycytidin) er en af ​​effektive anticancermidler for pancreascancer [1]. Det er et cytotoksisk pyrimidin deoxynukleosid analog, som transporteres i det cellulære rum gennem det primære transportprotein, human equilibrativ nukleosid transporter-1 (hENT1), og til sidst inhiberer DNA-replikation. Den hENT1 udtryk niveau i bugspytkirtelkræftceller har tidligere været korreleret til terapeutisk effekt, hvor celler med højere hENT1 udtryk viste sig at reagere bedre på gemcitabin. Desuden har celleniveau undersøgelser også vist, at bugspytkirtelkræftceller med lav hENT1 ekspression er meget modstandsdygtige over gemcitabin [4]. Desuden har kliniske undersøgelser påvist, at hENT1 udtryk påvirke, hvordan patienterne reagerer på behandling, hvor patienter, hvis tumor udtrykt lav hENT1 biomarkør reagerede dårligt på gemcitabin terapi [3], [5].

bugspytkirtelkræftceller der erhverver gemcitabin-modstand er kendetegnet ved epitel-mesenkymale overgang (EMT) fænotype og viser tydelige morfologiske ændringer fra epitel til spindel-formet og stigende cellulære motilitet [6], [7]. EMT er en biologisk proces, polariserede epithelceller skifte til en mesenchymal-lignende fænotype gennem multiple biokemiske ændringer. Denne fænotypiske overgang er karakteriseret ved tab af celle-celle-adhæsion og dynamiske ændringer i strukturen af ​​cytoskelettet, som medfører celler at løsne sig fra epitel og at få mulighed for at migrere til fjerne steder [8], [9]. Således i denne undersøgelse, vi hypotese, at modulation af hENT1 ekspressionsniveauerne i bugspytkirtelkræftceller kan ændre deres fysiologiske egenskaber, da det kan fremkalde fænotypisk skift ved at hæmme gemcitabin optagelse. Foruden biokemiske metoder til at identificere cellulære fysiologiske ændringer, kan forståelse Cellemekanik tilvejebringe nye biologiske indsigt. Nylige undersøgelser viser, at mekaniske egenskaber af celler giver afgørende information for at forstå forskellige biofysiske adfærd, der omfatter celle form, motilitet, og celleadhæsion at generere en kaskade af biokemiske signaler, der er kritiske for biologiske reaktioner [10]. De mekaniske underskrifter fra celler kan være et vigtigt redskab i forskellige aspekter: (1) Identifikation af cancerceller fra normale celler baseret på deres relativt lavere stivhed [11]; (2) forventning om en metastatiske potentiale af cancerceller som cellulær stivhed omvendt korrelerer med migration og invasion [12] – [14]; (3) Anerkendelse af fænotypiske forandringer, der er forbundet med ændring i intracellulær struktur og motilitet i cancerceller ved måling af stigninger eller fald i elasticitetsmodul [11], [15] – [18]. Selv om der ikke er nogen direkte beviser for, at hENT1 er relateret til fænotypiske begivenheder i bugspytkirtelkræftceller, kan vi spekulere, at hENT1 udtryk kan modulere cellulære biofysiske adfærd baseret på den tætte sammenhæng mellem hENT1 udtryk og gemcitabin følsomhed. Den cellulære fænotypiske skift fra gemcitabin resistente celler etableret ved dyrkning af celler i serielt stigende koncentration af gemcitabin understøtter også vores hypotese.

I denne undersøgelse to forskellige metoder, AFM og en mikrofluid platform, blev anvendt til at vurdere, hvordan modulering af hENT1 ekspressionsniveau indflydelse på stivhed af pankreatiske cancerceller. Så de ledsagende morfologiske ændringer, cytoskeleton omlejringer, cellulære motilitet, og ændringer i ekspressionsniveauer af EMT markører til at undersøge cellulære fænotypiske skift blev karakteriseret (figur 1). Sammen vores resultater på hENT1 udtryk niveau og celle stivhed korrelerer meget godt med de mekanistiske ændringer af intracellulær cytoskeletal struktur, cellulære motilitet, og antyder, at cellulære elastiske egenskaber kan estimere hENT1 udtryk niveau samt fænotypisk skift.

hENT1 knockdown inducerer ændringer i cellulære mekanik via EMT ledsaget af ændringer i E-cadherin og N-cadherinekspression niveauer, cellulære morfologi og motilitet bugspytkirtelkræftceller. Endvidere hENT1 knockdown fremkalder fald i celle stivhed som demonstreret på repræsentative kraft adskillelse kurver opnået fra Panc 03.27 celler (øverste graf fra en forælder celle, den anden graf fra en hENT1 knockdown celle). Hjælp AFM

materialer og metoder

Cellekultur

Alle cellelinier blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). AspC-1, BxPC-3, MIA Paca 2, og Panc-1-celler blev dyrket i Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA) med 10% føtalt bovint serum (FBS, ATLAS Biologicals, Fort Collins , CO), Capan-1 i DMEM med 20% FBS, og Panc 03,27 i RPMI 1640 (Thermo Scientific Hyclone, Waltham, MA) med 15% FBS og humant rekombinant insulin (10 enheder /ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i nærvær af 5% CO

2 ved 37 ° C.

hENT1 knockdown med siRNA transfektion

cellerne blev dyrket i 6 cm celledyrkningsskål ved en densitet på 5 × 10

5 celler /skål. Efter vask med PBS blev cellerne behandlet med INTERFERin (POLYPLUS transfektion ™), der indeholder siRNA mod hENT1 (SMARTpool: ON-TARGET plus SLC29A, Dharmacon, Inc., Pittsburgh, PA) eller negativ siRNA (Lyddæmper negativ kontrol No. 1 siRNA, AM4635 , Invitrogen, Grand Island, NY) ved en koncentration på 50 nM i Opti-MEM (Invitrogen, Grand Island, NY). Efter 24 timers transfektion blev cellerne vasket to gange med PBS og inkuberet i 3 dage.

Western blotting-analyse

Celler blev lyseret med RIPA Pierce puffer (Thermo Scientific, Waltham, MA) med proteasehæmmer cocktail (Thermo Scientific, Waltham, MA). Cellelysater (10 ug) med loadingpuffer (LDS prøvebuffer ikke-reducerende, Thermo Scientific, Waltham, MA) blev opvarmet i 5 minutter ved 95 ° C. Cellelysater og protein stige (Xpert 2 Prestained Protein Marker, GenDEPOT) indlæst på polyacrylamidgeler (Alle kD Mini- PROTEAN TGX Precast Gel, Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til nitrocellulosemembran (Bio-Rad, Hercules, CA) . Blottene blev blokeret med blokerende buffer, TBST (20 mM TRIS pH 7,6 /150 mM NaCl /0,05% Tween 20) indeholdende 5% mælk i en time. Blottene blev inkuberet natten over med TBST og 5% mælk med primære antistoffer ved bestemte forhold: anti-hENT1 antistof (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anti-E-cadherin antistof (1:1000, Abcam, Cambridge, MA); anti-N-cadherin antistof (1:500, Abcam, Cambridge, MA); cytokeratin 18 (1:1000, cellesignalering teknologi, Danvers, MA); Lamin A /C (1:1000, cellesignalering teknologi, Danvers, MA); anti-GAPDH-antistof (1:2000, cellesignalering teknologi, Danvers, MA). Efter vask tre gange med TBST blev blottene inkuberet med TBST og 5% mælk indeholdende sekundære antistoffer, anti-muse-IgG, HRP-bundet antistof (1:5000, Cell signaling teknologi, Danvers, MA) eller anti-kanin IgG, HRP -bundet antistof (1:5000, cellesignalering teknologi, Danvers, MA), i en time ved stuetemperatur. Derefter blottene anbragt på en blanding af Pierce ECL western blotting substrat (Thermo Scientific, Waltham, MA) og Lumigen TMA-6 (Lumigen, Inc., Southfield, MI), og blev påvist proteiner.

Immunofluorescens

pancreascancer celler blev podet i 6-brønds plader indeholdende steriliseret, collagen i (Invitrogen, Grand Island, NY) -belagt dækglas (22 × 22 mm, Corning) med en tæthed på 2 x 10

5 celler /brønd. Cellerne blev fremstillet med tre grupper: 1) kontrol (uden behandling); 2) scramble (transficeret med negativ kontrol siRNA); og 3) hENT1 knockdown. Cellerne blev fikseret med 4% paraformaldehyd (Affymetrix, Santa Clara, CA) i 30 minutter ved stuetemperatur og derefter permeabiliseret med 2% Triton X-100 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) i 10 minutter. Efter blokering med 2% bovint serumalbumin (Calbiochem) i 1 time blev cellerne inkuberet natten over med anti-Vinculin antistof (1:200, Abcam, Cambridge, MA), anti-E-cadherin (1:200), anti- N-cadhrein (1:100), anti-cytoketarin 18 (1:200), eller anti-Lamin A /C (1:200) ved 4 ° C med forsigtig rystning. Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS i 10 min og inkuberet med Alexa 488 eller 594-konjugerede sekundære antistoffer i en time ved stuetemperatur. Efter vask med PBS, for F-actin-farvning blev celler inkuberet med Alexa Fluor 488 Phalloidin (1:250, Invitrogen, Grand Island, NY) i 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter blev kernerne farves ved anvendelse af Hoechst 33342 (Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, NY) i 10 minutter. Cellerne blev overvåget ved konfokal laser scanning mikroskop (CLSM, Olympus FluoView FV1000).

AFM målinger

Cellulær stivhed blev målt af den kraft-kurven teknik på en Bioscope (Bruker Corporation, Billerica, MA). Cellerne blev dyrket på 6 cm celledyrkningsskål og alle målinger blev udført i dyrkningsmedium ved 37 ° C. AFM var udstyret med en omvendt lysmikroskop (Olympus IX81), således at cellerne blev konstant overvåget. For at minimere celleskader, silica mikropartikel (diameter: 5 um) modificerede siliciumnitrid cantilevere (Novascan Technologies, Inc., Ames, IA) med omtrentlig foråret konstante værdier på ~0.06 N /m var ansat i alle AFM eksperimenter. Den nøjagtige fjeder konstant værdi blev målt ved den termiske tuning metoden. Sonder blev placeret i cellernes kerner proximities under optisk kontrol, og tvinge kurver blev erhvervet til en sampling rate på 1 Hz. Youngs modul, E, blev beregnet ud fra opnået kraft kurver baseret på Hertz model (ligning. 1) under anvendelse Nanoscope analyseprogram fra Bruker corporation. (1), hvor F = kraft, E = Youngs modul, ν = Poissons forhold (ν = 0.5, i denne undersøgelse), R = radius af indrykning (R = 2500 nm, i denne undersøgelse), og δ = indrykning dybde.

for at opnå Youngs modul blev to uafhængige forsøg udført og kraft kurver fra mindst 50 celler blev indsamlet i hvert forsøg.

MS-chip design og fabrikation

siliciumskiver (4 tommer) fra Corning Inc. SU-8 2015 fotoresist, og SU-8 Udvikler fra MicroChem Corp. og polydimethylsiloxan (PDMS RTV615) fra Momentive performance Materials Inc. blev anvendt. Den mikrochip mønster designet med AutoCAD (Autodesk Inc.) og printes ud som 10-um opløsning krom masker ved Photo Science Inc. fotomaske mønster blev først oversat til en mikrostruktur på en 4-i silicium wafer hjælp SU-8 2015 fotoresist, hvilket er en form til støbning PDMS materialer. Kort fortalt blev formen fremstillet ved spin-coating SU-8 2015 fotoresist på en siliciumskive og tværbinding ved UV i 180 sekunder. Efterfølgende blev designet mønster udviklet ved hjælp SU-8 fremkalder (MicroChem Corp.) og rengøres med isopropylalkohol og nitrogengas. Hullerne til ind- og udløb blev udstanset hjælp nåle. PDMS lag blev renset ved skylning med isopropylalkohol og deioniseret vand og tørret med nitrogengas. Efter behandling med oxygenplasma blev PDMS lag bundet straks til en 75 x 50-mm objektglas. Endelig blev det bundne enhed bagt i 2 timer ved 80 ° C.

On-chip celleseparation

Kanalerne i MS-chip og Tygon rør forbundet til chip-tilførsel blev befugtet med PBS og derefter holdes med 0,5% BSA i PBS i 1 time. BSA blokerer overfladen og forhindrer yderligere uspecifik adhæsion af celler til PDMS. Membraner af kontrol og hENT1 knockdown celler blev farvet ved anvendelse Alexa Fluor 594 eller 488-konjugeret hvedekimagglutinin (Invitrogen, Grand Island, NY), hhv. Celleblandingen i lige store mængder ved en endelig densitet på 1 x 10

5 celler /ml blev fremstillet. Suspenderede celler blev derefter anvendt på MS-chip via en Tygon-rør. Under eksperimentet blev komprimeret nitrogengas anvendes til cellesuspensionen ved et tryk på ~ 10 psi (69 x 10

3 Pa). En typisk adskillelse varede -15 min, og den gennemsnitlige strømningshastighed blev reguleret til 1-2 ml /time. Celler anvendt til MS-chippen blev afbildet ved fluorescensmikroskopi (IX81, Olympus). Antal celler tilbageholdt på chip efter separation blev talt af Image J.

In vitro

scratch assay

ridse assay blev udført på enten native celler (kontrol) eller transficeret celler (kapløbet og siRNA mod hENT1) at undersøge effekten af ​​hENT1 knockdown på celle migration. Capan-1 eller Panc 03,27 celler blev podet i 24-brønds plade. Når cellerne er ca. 50-60% konfluente blev celler vasket med PBS og derefter transficeret med INTERFERin indeholdende siRNA mod hENT1 eller negativ siRNA ved en koncentration på 50 nM i Opti-MEM. Efter 6 timers transfektion blev cellerne vasket to gange med PBS og inkuberet i 2 dage. En ridse af cellemonolaget blev oprettet ved hjælp af en pipette spids. Derefter blev pladerne vasket og erstattet med det ønskede medium. Den time-lapse mikroskop (EVOS FL Auto Imaging System, Life Technologies) med kammer (95% luft og 5% CO

2) og temperatur kontrol (37 ° C) blev anvendt til at erhverve billederne fra det samme felt automatisk for 18 timer. Billederne overtagne blev analyseret kvantitativt ved hjælp af Image J.

Statistisk analyse

Dataene er udtrykt som gennemsnit ± standardafvigelse. Statistisk signifikans blev identificeret ved tovejs ANOVA analyse ved hjælp af GraphPad Prism 5.0. AP værdi. 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater og Diskussion

For at undersøge sammenhængen mellem hENT1 udtryk niveau og celle mekanik, to typer af kræft i bugspytkirtlen cellelinjer, Capan-1 og Panc 03,27 med relativt højere hENT1 udtryk (figur S1 i File S1), blev valgt. Af siRNA transfektion blev hENT1 nedreguleret celler fastsat (figur 2). Vi derefter målte ændringer i celle mekanik ved to forskellige metoder, AFM og mikrofluid separation. AFM foranstaltninger elastiske egenskaber af levende celler via en direkte mekanisk vekselvirkning mellem en probe og celleoverfladen. Celle stivhed påvirker omfanget af cantilever deformation efter interaktion med overfladen af ​​adhærente celler [19]. En levende celle indrykning inducerer deformation af celle rum, der omfatter membran, cytoskelet, kerne, og forskellige organeller. Således er de elastiske egenskaber af celler skyldes de aggregerede virkninger af deformering talrige cellulære komponenter. Vi brugte en silica mikropartikel (diameter: 5 um) modificeret cantilever (Figur S2 i File S1) for at reducere celleskader membran under kontakt og forvrænge datasættet anderledes end en skarp spids. For at optimere indrykning kraft, anvendt vi kraft op til 10 NN som vist i figur S2 i File S1. En konstant Youngs modul på Panc 03.27 celler blev opnået inden indrykningsindstillinger kræfter op til 200 PN, der angiver måling af cellulær stivhed under anvendelse AFM er kun gyldig ved små deformationer af levende celler. Begge cellelinjer viste en lignende tendens under samme indrykning kraft, dvs. 100 pN. De kontrolceller og celler transficeret med negative siRNA var betydeligt stivere end hENT1 knockdown celler (figur 2 og figur S3 i File S1). Den gennemsnitlige celle stivhed af både kontrolceller er 2,95 ± 1,55 kPa (Capan-1) og 1,91 ± 0,78 kPa (Panc 03.27); imidlertid viste, at af hENT1 knockdown celler faldt betydeligt Youngs moduli med værdier på 1,50 ± 0,63 kPa (Capan-1) og 0,59 ± 0,22 kPa (Panc 03.27).

(A) Western blots af hENT1 (55 kDa ) og GAPDH (37 kDa) i Capan-1 (til venstre) og Panc 03.27 celler (til højre) uden behandling (CTRL) eller efter behandling af negativ siRNA (SCRL) eller hENT1 siRNA (hENT1 ↓), (B) Bar histogrammer viser Youngs modulus af kontrol, negativ siRNA transficeres og hENT1 knockdown celler. (N.S: statistisk ikke signifikant)

Da AFM er begrænset til lokal måling af celle mekanik, vi også vurderet cellulære deformerbarhed hjælp mikrofluid adskillelse metode [20] for at bekræfte AFM fund.. En mekanisk adskillelse chip (MS-chip, figur 3A) er designet med kunstige microbarriers i kombination med hydrodynamiske kraft til separat deformerbare fra stive celler [21]. For at demonstrere evnen af ​​MS-chip til separate celler baseret på deformerbarhed, testede vi adskillelsen af ​​en blanding indeholdende to forskellige celler: kontrol og hENT1 Knockdown. Membran af kontrol og hENT1 knockdown celler blev farvet ved hjælp af Alexa Fluor 594 og 488 konjugeret hvedekimagglutinin (WGA), hhv. Som vist i figur S4 i File S1, virkningen af ​​WGA cell stivhed er ubetydelig. Andelen af ​​de to cellelinier varierede langs længden af ​​chippen. Som vist i figur 3D og 3G, diametre på begge celler, kontrol og hENT1 knockdown, var ens. Celleblandingen i lige store mængder ved en tæthed på 1 x 10

5 celler /ml blev injiceret til MS-chip og flød i 15 minutter. Mellemrummene mellem indlæg array i dette designet MS-chip spænder fra 22 um til 2 um. Kanalerne undgå obstruktion, der opstår i gentagne arrays af stillinger, der regulerer og udligne hydrodynamisk pres hele chippen. Det antages, at der ikke er fysisk kontakt mellem PDMS søjler og celler, fordi PDMS er belagt med BSA. Forskydningsspændingen er en væsentlig faktor til at interagere med celler. Når hullet størrelse af post arrays er større end cellediameter, trykkraft (F

s, 10 psi i denne undersøgelse) er den eneste kraft, der virker på celler. Hvis cellediameter er den samme eller større end spalteåbningen, friktionskraft (F

f) modsætter trykkraft (figur 3B). Hvis celler er stivere, de skubbe hårdere på indlæg arrays, og derefter F

f er væsentligt forøget. Figur 3C viser Panc 03.27 celler fanget på MS-chip afbildes ved fluorescensmikroskopi; rød fluorescens viser kontrolceller og grøn fluorescens viser hENT1 knockdown-celler. Ved indløbet, lige antal røde kontrol Panc 03.27 (eller Capan-1) celler og grøn hENT1 knockdown Panc 03.27 (eller Capan-1) celler blev observeret (figur 3C og 3E-I). I denne region, kanaler var meget bredere, at diameteren af ​​celler, hvilket resulterer i nogen væsentlig adskillelse af fleksible og stive celler. Grundet mindre diameter af Capan-1-celler (gennemsnitlig diameter: 15 pm) blev separationen opnås med 8 um hul størrelse af post arrays. Men i tilfælde af Panc 03.27 celler (gennemsnitlig diameter: 19 um), de store adskillelse forekommer ved 12 um. I disse cellelinjer blev celler i kontrolgruppen konsekvent fanget mens hENT1 knockdown celler passeret gennem hullerne oftere. Disse eksperimenter viser den samlede effektivitet af adskillelse af de to forskellige fænotyper med tilsvarende diameter i MS-chip. Således konkluderer vi begge kontrol celler er relativt stivere end hENT1 knockdown celler, og disse resultater er i overensstemmelse med AFM fund.

(A) Fotografi (venstre) af mikrofluid adskillelse chip (MS-chip) visualiseret ved rød farvestof inde og en repræsentant scanning elektronmikroskopisk (til højre) billede af stillingen array (diameter søjle: 35 um, højde på søjle: 30 pm). (B) Lyse billedfeltet og opbygningen af ​​celler flyder i MS-chip når cellen diameter er mindre end forskellen søjle størrelse (rød pil viser celler). Det antages her, at friktion er kun på grund af forskydningsspænding (F

s: trykkraft mod det anvendte tryk (10 psi i denne undersøgelse), F

f: friktionskraft). (C) Det fluorescens billede af en af ​​kanaler blandt otte shows beholdt Panc 03.27 celler i MS-chip efter separation af Panc 03.27-ctrl (rød fluorescens) og Panc 03.27-hENT1 knockdown (grøn fluorescens). Repræsentative højere forstørrelse konfokale mikroskopiske billeder af MS chip (hul størrelse fra 12 um til 6 um) viser effektiviteten af ​​separationen gennem hullerne. Størrelsesfordelingen af ​​celler (D: Capan-1, G: Panc 03.27 celler). Statistisk analyse af celler (E: Capan-1, H: Panc 03,27) og fraktion forhold mellem celler (F: Capan-1, I: Panc 03,27) tilbageholdes på chippen. Værdier repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse.

For at forstå, hvordan hENT1 påvirker celle mekanik, fysiologiske forandringer i celler efter hENT1 knockdown blev undersøgt ved konfokal mikroskopi. Vi observerede, celle morfologiske ændringer forbundet med hENT1 knockdown. Som vist i figur 4 blev celler visualiseret ved anvendelse af konfokal laser scanning mikroskop og cellen rundhed blev kvantitativt analyseret ved beregner formfaktorer (FF). FF fås ved ligningen, 4π (område) /(omkreds)

2, hvilket giver en værdi på 1 for en perfekt cirkulær omkreds og mindre og mindre mindre positive værdier for mindre cirkulære perimetre [22]. Capan-1 og Panc 03,27 celler er epitel type og de er tæt knyttet til hinanden via intercellulære adhæsionskomplekser. De har squarish former med FF værdier på 0,74 ± 0,08 og 0,77 ± 0,06, henholdsvis (figur 4B). I modsætning hertil blev begge celler efter hENT1 knockdown aflange med meget lavere FF med værdier på 0,44 ± 0,14 og 0,52 ± 0,16, henholdsvis

(A) Repræsentative konfokale mikrografier af bugspytkirtlen celler (Topplade:. Capan-1, Bundplade: Panc 03.27) viser f-actin fordeling, (B) formfaktor (f = 4πa /p

2; a: område; p: perimeter) analyseret af billede J (Capan-1 celler, ctrl: n = 37, SCRL: n = 59, hENT1 ↓: n = 29; Panc 03,27, ctrl: n = 36, SCRL: n = 28, hENT1 ↓: n = 28, NS: statistisk ikke signifikant)

.

Endvidere virkningen af ​​hENT1 knockdown på tilrettelæggelse af cytoskelet blev evalueret. Vi farvet for vinculin, som styrer dannelsen af ​​fokale adhæsioner (FA’er) ved direkte at interagere med actin og andre proteiner, som er involveret i FA formation [23]. FA’er, lokaliteter af sammenvoksninger mellem cellen og den ekstracellulære matrix (ECM), og stress fibre på marginen har klare roller i at flytte cellen frem [23], [24]. Undersøgelser har rapporteret, at FA størrelse er korreleret med cellens hastighed; større FA’er findes i mere aflange og hurtigere-bevægelige celler [25], [26]. I denne undersøgelse analyserede vi omfordeling af F-actin og ændringer i fokal adhæsion område i hENT1 knockdown celler (figur 5). Actin fibre i begge kontrolgrupper meste koncentreret omkring cellens periferi, og små, vordende FA’er blev observeret. Men efter hENT1 knockdown, var der en stigning i antallet af stress fibre samt målbare fokale vedhæftning områder. Disse resultater tyder på forøget cellulær motilitet i begge cellelinier.

Konfokale mikrografer (z-stakke af basal plane, 0-1,5 um), der viser vinculin (rød) og F-actin (grøn) i (A) Capan- 1 og (B) Panc 03.27 celler. Areal af fokal vedhæftning (pixel

2) analyseres af Image J.

Desuden for at forstå effekten af ​​hENT1 knockdown på celle motilitet undersøgte vi effekten af ​​nedregulering af hENT1 på celle migration. Et sår ridse blev indført i konfluent cellemonolag, og derefter såret forsegling blev observeret i 18 timer (figur 6). Arealet af sårlukning blev beregnet ved hjælp af Image J og migrationen hastighed (område sårlukning (um

2) /time) blev beregnet som vist i figur 6. Såret tætningsområde og migration hastighed begge kontrolceller og celler transficeret med scramble siRNA ligner hinanden. Men hENT1 undertrykte Capan-1 eller Panc 03.27 celler migrerer 1,8 (1,7) eller 1,5 (1,5) fold hurtigere end kontrol (scramble siRNA transficerede) celler, hhv. , Bekræfter vi, at nedregulering af hENT1 inducerer dannelsen af ​​større fokale sammenvoksninger og fremmer hurtigere celle migration. Baseret på celle morfologiske ændringer og øget cellemotilitet, er det muligt, at begge celler undergår fænotypiske forandringer, som er forbundet med løsnet adhæsion mellem celler og cytoarchitectural omlejring. Ved EMT, reorganisering af cytoskelet sammen med stigningen i FA dynamik er afgørende for celler til at forlade epitel og begynde at migrere gennem ECM [22], [27], [28]. For eksempel viste en nylig undersøgelse øget migration af post-EMT SKOV-3-celler, der var transformerende vækstfaktor-β (TFG-β), der genereres større FA mekaniske kræfter end præ-EMT-celler [16]. TGF-β er rapporteret som EMT inducer i forskellige epiteliale cellelinjer, herunder renal proximal tubulær og alveolære epitelceller [16], [29], [30]. Øget samspil mellem aktincytoskelettet og intracellulære molekyler med FA’er iværksat af sammenslutningen af ​​integrin α5β1 og fibronectin forbedret cellulære motilitet [16].

De ridser blev introduceret til monolag (A) Capan-1 og (D) Panc 03,27 celler. Fotografier blev taget umiddelbart efter viklet induktion i 18 timer. Såret forsegling områder (B) Capan-1 og (E) Panc 03.27 celler blev beregnet under anvendelse Billede J og sammenlignet med kontrol, scramble siRNA transficeres og hENT1 knockdown celler. Migration hastighed (C) Capan-1 og (F) Panc 03.27 celler blev beregnet.

For at bekræfte disse fysiologiske forandringer som følge af hENT1 knockdown er relateret til EMT, vi analyserede ændringer i EMT markør proteiner, såsom E-cadherin og N-cadherin, efter hENT1 knockdown. E-cadherin er en af ​​celle-celle adhæsionsmolekyler. Der opretholder celle-celle-kontakter og epitelial arkitektur. Vekslen af ​​ekspression af cadheriner fra E-cadherin til N-cadherin, som primært udtrykkes i mesenchymale celler, forekommer under EMT. Denne vekslen fører til en drastisk ændring i de adhæsive egenskaber af celler, som det mister sin affinitet for epitelceller naboer og gevinster affinitet for mesenchymale celler, som er nonpolarized, manglende intercellulære junctions, og har en unik spindel-lignende form [27], [ ,,,0],31], [32]. Efter hENT1 nedregulering, viste begge cellelinier lav ekspression af E-cadherin og høj ekspression af N-cadherin, som er en væsentlig kendetegn for EMT (figur 7). Tabet af E-cadherin og forstærkning af N-cadherin forøger cellemotilitet og metastatisk potentiale. Flere undersøgelser har vist, at reduceret celle stivhed direkte korrelerer med forøget metastatisk potentiale ved anvendelse af forskellige in vitro biomekaniske analysemetoder [11], [17], [33]. Reduktion i cellulær stivhed modulerer at celler undergår EMT efter hENT1 knockdown som det er demonstreret i figur 2. Der er dog ubetydelig forskel i ekspressionsniveauerne af intermediære filamenter, cytokeratin 18 og nuklear cytoskelet, lamin A /C i begge cellelinier (Figur S5 i File S1).

Western blots og relative ekspressionsniveauer af E-cadherin (110 kDa), N-cadherin (140 kDa) i (A) Capan-1 og (C) Panc 03.27 celler efter behandling med hENT1 siRNA. Kolonner i histogrammerne er gennemsnittet af to uafhængige forsøg (intensitetsforhold af GAPDH til E-cadherin eller N-cadherin). Repræsentative konfokale billeder af E-cadherin (rød fluorescens) og N-cadherin (grøn fluorescens) udtryk i (B) Capan-1 og (D) Panc 03.27 celler.

For at bekræfte vores førnævnte undersøgelser, som antyder, at EMT kan karakteriseres ved ændringer i celle stivhed, evaluerede vi fænotypiske ændringer af pancreascancer celler efter behandling med TGF-β. TGF-β er blevet rapporteret i flere undersøgelser for at inducere EMT [15], [16], [30]. Derfor har vi yderligere undersøgt disse resultater i et andet eksperiment ved hjælp af EMT-induceret bugspytkirtlen kræftceller. Panc 03.27 celler blev udsat for TGF-β i 2 dage ved en koncentration på 10 ng /ml for at inducere EMT, og derefter målt cellulær stivhed. En hård undertrykte E-cadherin og forhøjede N-cadherin og vimentin udtryk indikerer, at EMT induceres i Panc 03.27 celler (figur S6A i File S1). Panc 03.27 celler behandlet med TGF-β blev demonstreret ved nedsat Youngs modul (1,42 ± 0,53 kPa) versus ubehandlede celler (1,91 ± 0,78 kPa). Dette resultat antyder, at celle stivhed falder, når cellerne undergår EMT. For nylig er der en rapport om cellulære stivhed ændringer i EMT-inducerede A549-celler med TGF-β behandling [15]. I deres undersøgelse, de målte lokale mekaniske egenskaber af A549-celler ved anvendelse af en skarp DNP cantilever (20 nm tip radius), som har et mindre kontaktområde sammenlignet med en mikropartikel-modificeret cantilever. Selvom der er afgørende beviser for celle fænotypisk ændring fra epitel til mesenchymale, dvs. cellulære formændringer og stigende stress fibre, stadig i overensstemmelse med vores arbejde.