PLoS ONE: bis-dehydroxy-Curcumin Triggers Mitochondrial-Associeret celledød i Humane Colon Cancer Cells gennem ER-Stress induceret Autophagy

Abstrakt

Baggrund

Aktiveringen af ​​autofagi er blevet grundigt beskrevet som en pro-overlevelsesstrategi, som hjælper til at holde celler i live efter berøvelse af næringsstoffer /vækstfaktorer og andre stressende cellulære betingelser . Foruden cytobeskyttende virkninger, kan autofagi ledsage celledød. Autophagic vakuoler kan observeres før eller under celledød, men er stadig kontroversiel rolle autophagy i dødsprocessen. Et komplekst samspil mellem autofagi og apoptose er kommet for dagens lys, idet der tages hensyn til, at mange gener, såsom p53 og Bd-2 familiemedlemmer, er delt mellem disse to veje.

Metodologi /vigtigste resultater

i denne undersøgelse viste vi en potent og irreversibel cytotoksisk aktivitet af det stabile Curcumin derivat

bis

-DeHydroxyCurcumin (bDHC) på humane colon cancerceller, men ikke på humane normale celler. Autophagy er fremkaldt af bDHC før celledød som demonstreret ved øget autophagosome dannelse -measured ved elektronmikroskopi, fluorescerende LC3 puncta og LC3 lipidation- og autophagic flux -measured ved at blande sig LC3-II omsætning. Ophobningen af ​​poly-ubiquitineret proteiner og ER-stress forekom opstrøms for autophagy induktion og resulterede i celledød. Cellecyklus og Western blot analyser fremhævet aktiveringen af ​​en mitochondrial-afhængig apoptose, der involverer caspase 7, 8, 9 og cytochrom c-frigivelse. Brug farmakologiske hæmninger og RNAi eksperimenter, vi viste, at ER-stress induceret autofagi har en vigtig rolle i at udløse bDHC-celledød.

Konklusion /Betydning

Vores resultater beskriver den mekanisme, gennem hvilken bDHC fremmer tumor selektiv hæmning af spredning, der giver utvetydige beviser af den rolle autophagy i kontrastfarve spredning af tyktarmskræft celler

Henvisning:. Basile V, Belluti S, Ferrari E, Gozzoli C, Ganassi S, Quaglino D, et al. (2013) bis-dehydroxy-Curcumin Triggers Mitochondrial-Associeret celledød i Humane Colon Cancer Cells gennem ER-Stress Induced Autophagy. PLoS ONE 8 (1): e53664. doi: 10,1371 /journal.pone.0053664

Redaktør: Regine Schneider-Stock, Patologisk Institut, Tyskland

Modtaget: June 12, 2012; Accepteret: December 3, 2012; Udgivet: 11 Jan 2013

Copyright: © 2013 Basile et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro-MFAG (tilskud nummer 6192 til CI) og Fondazione Cassa di Risparmio di Vignola til CI og EF. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Apoptose, også kendt som type i celledød, er den bedste beskrevne mekanisme for celledød og er morfologisk kendetegnet ved celle krympning, membranblæredannelse, cellekernekondensation, og dannelse af apoptotiske [1] organer. En energi-afhængig kaskade af molekylære begivenheder koordinerer den apoptotiske proces, som kan skelnes i to hovedgrupper veje: den ydre død receptor pathway og den indre mitokondrielle pathway. De to veje synes at være knyttet og påvirket hinanden, og begge udløse aktivering af caspaser 3, 6 og 7, proteaser målrettet hundrede proteiner og førende til celle nedrivning [2].

Udover apoptose, har autofagi været beskrevet som en alternativ selvdestruktiv cellulær proces. Autophagy har været længe kendt at tilvejebringe cellulær overlevelse efter næringsstoffer /vækstfaktorer berøvelse eller andre stressende forhold, og kun for nylig er det blevet knyttet til celledød. Også kendt som type II celledød, er autophagy aktivering karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​autophagic vakuoler i cytoplasmaet, og udvidelse af det endoplasmatiske reticulum (ER) og Golgi-apparatet [3]. Dobbelt-membraned autophagic vesikler indkapsle cytoplasmaet og organeller, og efter deres fusion med lysosomer, autophagolysosomes forringe deres indhold [4]. Den klassiske autophagy vej virker nedstrøms for mTOR (pattedyr mål for rapamycin) kinase. Når denne Ser /Thr-kinase er associeret i mTORC1 proteinkompleks, det er i stand til at undertrykke den autophagic maskiner. 16 autophagy-relaterede (ATG) proteiner er blevet beskrevet til at deltage i autophagy vej [5], og de fleste af dem spiller en rolle i den komplekse proces med dobbelt membraned vesikler dannelse og vækst, neden for mTORC1 [6]. Selvom hæmning af mTORC1 vej er det bedst kendte mekanisme, gennem hvilken autofagi induceres, kan mange andre signaleringskaskader og transkriptionelle begivenheder være involveret i aktiveringen af ​​autophagic proces. Navnlig forskellige kinaser styre forskellige trin i denne kataboliske proces, såsom AMP-aktiveret protein kinase, Akt, mitogenaktiveret proteinkinase (ERK, p38 og JNK) og proteinkinase C [7].

rolle autophagy i celle overlevelse snarere end celledød er afhængig af celler og væv sammenhæng samt af naturen af ​​stress stimulus [8] Salg

Apoptotiske og autophagic celledød er ikke gensidigt udelukkende veje:. de kan inducere celledød samtidigt og kooperativt (for en gennemgang se [9]). Autophagic morfologier af celler observeres umiddelbart inden eller under celledød; selv, uanset om autophagy er den mekanisme, hvormed celler faktisk dø, og om celledød udføres af autophagy eller med autofagi stadig diskuteres [10].

Sondringen mellem apoptotiske og autophagic celledød endnu mere kompliceret af to overvejelser: i) forskellige cellulære spændinger udløser signaltransduktionsveje kan fremkalde både apoptose og autofagi og ii) mange proteiner er essentielle for autofagi er også involveret i apoptotisk-celledød, såsom ATG5, transkriptionsfaktoren p53 og Bcl-2-familiemedlemmer.

p53 er et velkendt oncosuppressor, aktiveres efter en række stress stimuli, og ansvarlig for transkriptionel regulering af både pro- og anti-apoptotiske gener. Mens de pro-apoptotiske gener, såsom Bax, Puma og Noxa er opreguleres, anti-apoptotiske dem, som Bcl-2α, er nedreguleres ved nuklear p53. Også cytoplasmatisk lokaliseret p53 har vist sig at være vigtige ved regulering af apoptotisk respons, ved at inducere Bax oligomerisering på mitokondrier eller ved at løsne de pro-apoptotiske BH3-only proteiner fra deres anti-apoptotiske partnere Bcl-2 /Bcl-XL [11] .

rolle p53 i tumor undertrykkelse er også tilskrevet dets aktivitet i regulering autofagi. p53-medieret aktivering af autofagi fører til celledød ved transaktivering af autofagi-inducerende protein DRAM og inaktivering af mTOR pathway [12], [13]. I opposition, farmakologisk hæmning og inaktivering af p53 tyder på en negativ regulering af autophagy gennem transskription-uafhængige mekanismer [14].

Udover p53, de Bcl-2 familiemedlemmer er almindelige spillere af apoptose og autofagi. De er centrale for reguleringen af ​​den ydre mitokondrielle membran permeabilisering (MMP), som er ansvarlig for frigivelsen i cytoplasma proteiner medierer celledød, såsom cytochrom C. Bcl-2 proteiner er blevet vist at hæmme autophagy ved at forstyrre Bcl -2 /Bcl-XL-Beclin-1-komplekser [15]. Det er ikke klart, hvordan Bcl-2-proteiner deltager til den apoptotiske

versus

den autophagic proces, men de to forskellige funktioner kunne bestemmes ved protein lokaliseringer på mitokondrierne stedet ER [16]. Relative niveauer af Bcl-2 og Beclin-1 opstod blandt de mange cellulære faktorer, der kontrollerer, om autofagi bidrager til kræft hæmning eller overlevelse (revideret i [17]).

Forskellige naturlige produkter og lægemidler er i stand til at fremkalde kræft celle død gennem aktivering af autofagi eller ved at målrette de veje for autophagy [18]. Tamoxifen, Imatinib, Resveratrol og Curcumin er eksempler på molekyler udøver deres cytotoksiske aktivitet mod cancerceller

via

induktion af autophagic celledød [17], [18].

Curcumin, den aktive komponent fundet i rhizom af

Curcuma longa

har vist terapeutisk aktivitet mod forskellige tumorer. Det kan inhibere initiering, progression og tumorcelleoverlevelse [19]. Især musemodeller og humane kliniske forsøg vist sin kemoforebyggende potentiale for colorectal cancer [19]. I kolorektale carcinom-cellelinier, Curcumin inhiberer celleproliferation ved at inducere en G2 /M cellecyklusstop eller apoptose, når de anvendes i høje doser [20], [21]. Endvidere modulationen af ​​cellulære apoptotiske veje ved Curcumin er for nylig blevet observeret på cancerceller af patienter med colorectal cancer [22].

Microarray undersøgelser viste, at curcumin-induceret apoptose reguleres af multiple signalveje [23], [24]. Curcumin opregulerer pro-apoptotiske proteiner (Bax, Bim, Bak, Puma og Noxa) og nedregulerer anti-apoptotiske dem (Bcl-2 og Bcl-XL) i forskellige cancerceller, udløser frigivelse af cytochrom C og aktiveringen af ​​caspase 3 [24]. I humant melanom, HL-60-leukæmi og gastriske celler, Curcumin aktiverer apoptose gennem Fas-receptoren /caspase 8 pathway [25], [26], [27]. Ud over den apoptotiske aktivitet, Curcumin inducerer ER stress i forskellige humane tumorceller, blandt hvilke liposarkom celler [28], ikke-småcellet lungecancer-celler [29] og leukæmiceller [30].

autofagi proces deltager til de anti-proliferative og apoptotiske aktiviteter curcumin, både

in vitro

in vivo

: i kræftceller og i en xenograft musemodel, Curcumin og dets metabolit tetrahydrocurcumin hæmme væksten af maligne celler ved at aktivere autophagic-celledød

via

Akt /mTOR /p70S6K signalering og ERK1 /2 veje [31], [32], [33]. I gliom initierende celler, Curcumin administration resulterer i tumor undertrykkelse på grund af autofagi-induceret differentiering arrangementer [34].

På trods Curcumin hæmning af centrale molekylære veje for tumorigenese, kliniske undersøgelser lave biotilgængelighed, begrænset distribution væv og hurtig metabolisme [35]. 90% af curcumin nedbrydes hurtigt i neutrale og grundlæggende vilkår gennem oxidation, reduktion, glukuronidering og sulfatering [28], [29]. For at overvinde disse begrænsninger har naturlige og syntetiske analoger blevet syntetiseret, blandt hvilke

bis

-DeHydroxyCurcumin (bDHC) (fig. 1A, venstre panel). Celler administration af bDHC i 72 timer ved IC50-koncentrationer resulterede i et lille fald af anti-proliferativ aktivitet sammenlignet med curcumin i androgenafhængige og-uafhængig prostatacancer-cellelinier og i østrogen-afhængige og -uafhængige brystkræft cellelinier [36], [37].

A. Venstre panel: Opbygning af bDHC. Højre panel: Dosis-respons virkning bDHC på cellelevedygtighed efter 24 timer behandling, sammenlignet med kontrol og DMSO-behandlede celler. B. PI /FACS-analyse af cellecyklusprogression efter DMSO, Curcumin (10 uM) og bDHC (30 uM) behandlinger for 16 og 24 timer (venstre og højre panel, henholdsvis). De angivne begivenheder er gennemsnit af ti uafhængige forsøg (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. PI /BrdU todimensionale FACS-analyse af 16 og 24 timer behandlinger med DMSO, Curcumin og bDHC. Analyse blev gated at udelukke SubG1 population. D. Venstre panel: Procentdelen af ​​Annexin V positive celler på 24 timers behandling med bDHC sammenlignes med DMSO og Curcumin-behandlede celler. Data er gennemsnit af tre uafhængige forsøg – /+ SD. Midterste panel: PI /monoparametric cellecyklus analyse af bDHC-behandlede celler

versus

bDHC-celler frigivet i 24 timer i frisk medium. Begivenheder er vist som hjælp af tre uafhængige forsøg (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). Højre panel: γ-H2AX ekspressionsniveauerne

versus

actin i celler behandlet med bDHC i 24 timer

I denne rapport, vi undersøgte tumor-selektive hæmmende effekt af bDHC på. spredning af humane kolorektal cancer celler. Sammenlignet med Curcumin, bDHC er mere aktive i at inducere en irreversibel cytotoksisk virkning i HCT116 og LoVo celler, men ikke i humane normale celler.

akkumulering af poly-ubiquitineret proteiner og induktionen af ​​ER stress er opstrøms signaler af autophagy, hvilket udløser mitokondriel-afhængig apoptose. Farmakologisk og RNAi-medieret hæmning af ER-stress og autofagi fremhæver, at autofagi forstærker den anti-proliferative effekt af bDHC. Vores undersøgelser viser, at bDHC fungerer som en pro-autophagic cytotoksisk lægemiddel, optrevling dets terapeutiske potentiale i kampen selektivt tumor udvikling.

Materialer og metoder

Cell kultur og narkotika

Menneskelig kolorektal carcinom HCT116, HCT116 /E6 og HCT116 Bax – /- blev generøst tilvejebragt af Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Celler blev dyrket i Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS). Primære humane fibroblaster (HF) blev dyrket i DMEM 10% FCS, med glutamin (2 mM) og gentamicin (55 mg /l). Hepatiske føtale humane epitelial WRL68-celler og colon adenocarcinoma LoVo celler blev holdt i DMEM-medium suppleret med 10% FCS. Fordoblingstid er blevet anslået til at være 16 timer for HCT116 og LoVo tumorceller, og 24 timer for HF og WRL68 normale celler.

Curcumin [1,7-bis [3-methoxy-4-hydroxy-phenyl] hepta-1,6-dien-3,5-dion] og bDHC [1,7-bis [3-methoxy-phenyl] hepta-1,6-dien-3,5-dion] blev syntetiseret som tidligere beskrevet [20 ]. Renheden af ​​syntetiserede forbindelser, bestemt ved NMR teknikker og forbrændingsanalyse, var 98%. Curcumin og bDHC blev tilsat til at varme medium ved 10 uM og 30 uM koncentrationer hhv. C3-bDHC blev administreret til celler ved 3 uM koncentration. HCT116-celler blev inkuberet med adriamycin (1,3 uM) i 48 timer. For farmakologiske hæmninger blev celler forbehandlet i 1 time og derefter co-inkuberes med bDHC for yderligere 16 eller 24 timer med 25 pM zVAD-fmk (Enzo Life Sciences), 5 uM LEVD-fmk (Enzo Life Sciences), 3 uM wortmannin (Enzo Life Science), 2 uM cycloheximid (Sigma Aldrich), 20 uM chloroquin (Sigma Aldrich), 50 uM Salubrinal (Santa Cruz). Thapsigargin (Sigma-Aldrich) blev administreret til celler i 36 timer ved 1 uM koncentration.

cytometrisk analyse (FACS)

Flowcytometrisk cellecyklus-analyse blev udført som tidligere beskrevet [20]. Indirekte fluorescens-farvning blev udført under anvendelse af anti-phospho-Histone H3 (Ser10) (Cell Signaling # 9706) og muse anti-FITC (Dako # F0313) antistoffer. Celler blev høstet efter lægemiddelbehandlinger, vasket to gange med PBS 1 ×, fikseret i 1% formaldehyd i 10 minutter ved 37 ° C, og post-fikseret med 90% methanol o.n. ved -20 ° C. Efter permeabilisering med 0,25% Triton X-100 i PBS 1 × i 5 minutter blev celler farvet med primært antistof (1:25) o.n. ved 4 ° C, og sekundært antistof (1:50) i yderligere 2 timer ved 4 ° C. Celler blev derefter behandlet med RNAse A i 40 min, inkuberet med propidiumiodid (30 pg /pl) i yderligere 30 minutter ved 4 ° C i mørke og analyseret med cytometeret.

Apoptotiske celler blev identificeret ved hjælp af FACS under anvendelse af annexin V-FITC-konjugat (Bender Medsystems) ifølge protokollen fra producenten.

Cellular uptake undersøgelser

bDHC blev udvundet fra celler og dyrkningsmedium som tidligere rapporteret [20].

Crystal Violet assay

inhiberingen af ​​proliferation blev målt ved krystalviolet farvning og den koncentration, hvor cellevæksten inhiberes med 50% (IC50), blev bestemt efter 24 timers behandling med bDHC. Efter fjernelse af celledyrkningsmediet, blev cellemonolaget fikseret med methanol og farvet med 0,05% krystalviolet opløsning i 20% methanol i 30 min. Efter vask blev cellerne lov til at tørre. Den inkorporerede farvestof blev solubiliseret i sur isopropanol (1 N HCl: 2-propanol, 1:10) og bestemt spektrofotometrisk ved 540 nm bølgelængde. Den ekstraherede farvestof var proportional med celleantal. Procentdel af cytotoksicitet blev beregnet ved at sammenligne absorbansen af ​​behandlet med ubehandlede celler.

Acridin Orange farvning

HCT116 celler blev behandlet med DMSO og bDHC i 8 og 16 timer. Herefter blev cellerne inkuberet med acridin orange (1 ug /ml) i 15 minutter ved 37 ° C, efterfulgt af visualisering med et Zeiss Axioskop 40 fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).

Intracellulær ATP-indhold

Bestemmelse af intracellulær ATP indhold blev udført ved anvendelse ATP bioluminscensassayet kit CLSII (Roche) ifølge producentens protokol.

Mitokondriel membranpotentiale

mitochondriemembranpotential blev målt ved at vurdere bindingen af ​​3,3-Dihexyloxacarbocyanineiodide (DiOC6), et kationisk farvestof, som binder til mitochondrier med intakt membranpotentiale. Celler blev mærket efter DMSO eller bDHC inkubation i 16 og 24 timer med DiOC6 (4 nM) i 40 minutter ved 37 ° C. Derefter blev cellerne vasket to gange med PBS 1 × og fluorescensintensiteten blev analyseret ved anvendelse Beckman Coulter cytometer.

immunblotting

Celler blev lyseret i Laemmli prøvebuffer 1 × for de samlede cellulære ekstrakter. Nukleare /cytoplasmatiske ekstrakter blev fremstillet som rapporteret i Ref. [38]. Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [20]. De følgende primære antistoffer blev anvendt: anti-p53 DO-1 (Santa Cruz # sc-126), anti-phospo-H3 (Ser10) (Millipore # 05-817), anti-H2A syre-patch (Active Motif), anti -p21 (Upstate), anti-actin (Santa-Cruz), anti-PARP1 (Santa Cruz # sc-8007), anti-γH2AX (Millipore, # 05-636), anti-GADD153 (F168) (Santa Cruz # sc -575), anti-tubulin (Sigma-Aldrich), anti-spaltet caspaser 3, 7, 8, 9 (Cell Signaling), anti-caspase 4 4B9 (Enzo Life Sciences), anti-Bax (N-20) (Santa Cruz # sc-493), anti-Bcl-2 (Santa Cruz # sc-509), anti-Bcl-XL (Santa Cruz # sc-8392), anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543), anti-Ub (Santa Cruz # sc-8017), anti-ATG7 (Sigma Aldrich # A2856), anti-Beclin 1 (Sigma-Aldrich # B6061) og anti-H3 (C16) (Santa Cruz # sc-8654). Kemiluminescerende påvisningsreagens er blevet købt fra Millipore (Luminata Classico og Forte vestlige HRP).

Isolering af cytosolisk fraktion ved digitonin lysis metode

2.000.000 HCT116 celler blev vasket to gange i PBS 1 × og derefter resuspenderet i digitonin lysepuffer (75 mM NaCl, 1 mM NaH

2PO

4, 8 mM Na

2HPO

4, 250 mM saccharose, 190 mg /ml digitonin, proteaseinhibitorer). Hver prøve blev inkuberet på is i 5 minutter og derefter centrifugeret ved 15.000 x g ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatanterne blev opsamlet og anvendt til Western blotting ved anvendelse af anti-cytochrom C-antistof (Santa Cruz # sc-13560).

Immunofluorescens

Immunofluorescensanalyse blev udført som tidligere beskrevet [20], [ ,,,0],39], under anvendelse af anti-p53 DO-1 (Santa Cruz # sc-126) og anti-LC3B (Sigma Aldrich # L7543) antistoffer fortyndet 1:100 i PBS + BSA 1%. p53 cellulære lokalisering blev undersøgt med Zeiss Axioskop 40 fluorescens mikroskop (Carl Zeiss, Jena, Tyskland), billeder, indsamlet med en AxioCam HRc kamera og AxioVision version 3.1 softwarepakke. Farvning af endogen LC3B blev analyseret ved konfokal mikroskopi (Leica DM IRE2).

plasmider og transient transfektion

HCT116 blev transient transficeret med Bcl-2, Bcl-XL eller bærer plasmider med FuGENE (Promega ). Humant bcl-2 og Bd-XL ekspressionsvektorer blev venligst stillet til rådighed af M. Priault (CNRS IBGC UMR 5095, Bordeaux, Frankrig) [40]. Cellerne blev genvundet 48 timer efter transfektion til Western blot og cellecyklus-analyse.

Små interfererende RNA (siRNA)

HCT116 celler blev transficeret (Lipofectamine 2000, Invitrogen) med 200 nM af parret ATG7, BCN1 og ikke-targeting kontrol små interfererende RNA’er (Sigma Aldrich), som beskrevet af Hoyer-Hansen et al. [41]. CHOP siRNA (HSC.RNAI.N004083.10.2 fra IDT) var en slags gave fra A. Pietrangelo (University of Modena og Reggio Emilia, Modena, Italien). Totale ekstrakter og FACS prøver blev fremstillet efter 72 timer upon siRNA transfektion.

RT-PCR-analyse

RNA-ekstraktion, retrotransskription og semikvantitative PCR’er blev udført som tidligere beskrevet [42], [43]. Actin og LC3B blev forstærket med følgende oligonukleotider: Actin

Til: 5′-GAGGCCCAGAGCAAGCGT-3 ‘; Actin

Rev: 5′-GCTCGAAGTCCAGGGCGACG-3 ‘; LC3B

Til: 5′-CCTGGAGAAAGAGTGGCATTT-3 ‘; LC3B

Rev: 5′-GAAGGCAGAAGGGAGTGTGT-3 ‘

Scanning elektronmikroskopi (SEM)

Celler dyrket i monolag på dækglas blev fikseret i 1,25% glutaraldehyd i PBS 1 × 30. min RT og vasket i PBS 1 × tre gange. Efter dehydrering i graduerede ethanol-løsninger, prøverne var kritiske punkt tørret med CO

2 ved hjælp af et kritisk punkt Dryer 010 Balzer, monteret på aluminium stubbe, og Katodeforstøvningscoatet med 10 nm guld-palladium i en Coating Unit E 500 ( polaron). Observationer blev udført af Philips XL-30 scanningselektronmikroskop.

Transmission Electron Microscopy analyse

Celler, skrabet fra petriskåle, blev centrifugeret ved 12.000 x g i 5 ‘ved 10 ° C. De resulterende pellets blev fikseret natten over med 2,5% glutaraldehyd (Agar Scientific, Stensted, UK) i Tyrodes puffer, post-fikseret i 2 timer i 1% osmiumtetroxid (Agar Scientific), dehydreret og indlejret i TLV harpiks (TAAB, Aldermaston, UK ). Semithin sektioner opnået gennem hele tykkelsen af ​​pellets blev farvet med toluidinblåt og observeret med et Zeiss Axiophot lysmikroskop (Oberkochen, Tyskland). Ultratynde snit blev farvet med uranylacetat og bly citrat og observeret med et Jeol 1200 EXII elektronmikroskop (Jeol, Tokyo, Japan).

chromatin Immunfældning (chip)

chips blev udført med kromatin fra DMSO og bDHC behandlede celler i 24 timer som beskrevet i Martens

et al.

[44]. PCR-oligonukleotider blev tidligere rapporteret [43].

Statistisk analyse

Resultaterne er vist som hjælp af mindst tre uafhængige forsøg +/- SD. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af en-vejs ANOVA efterfulgt af LSD test for at afgøre, om der var forskelle mellem bestemte grupper.

Resultater

Effekter af bDHC på bæredygtighed og cellecyklus progression af HCT116 celler

fuld dosis-respons-eksperimenter blev udført i HCT116-celler for at identificere evne bDHC at undertrykke cellevækst. bDHC cytotoksicitet blev analyseret gennem Crystal Violet vital farvning metode og den 50% inhiberende koncentration for cellevækst (IC50) blev estimeret lig med 30 uM, efter 24 timers behandling (fig. 1A, højre panel).

virkning bDHC på cellecyklusprogression blev undersøgt ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) analyse (fig. 1B). HCT116-celler blev behandlet i 16 og 24 timer med bDHC og fordelingen i cellecyklusfaser blev sammenlignet med DMSO og Curcumin behandlede celler. Som tidligere vist [20], curcumin standsede celler i G2 /M-fase og halveret befolkningen i G0 /G1 og S-fase inden for 16 timer; blev påvist nogen signifikant stigning af SubG1 begivenheder. Forskelligt, bDHC akkumulerede celler ikke kun i G2 /M (fra ca. 23% af kontrolceller til 37% af de behandlede celler), men også i SubG1 fase (fra 2,5% til 10%). Med længere tids påvirkning, SubG1 begivenheder lidt hævet over Curcumin (fra 4% til 8,6%), mens en tydelig stigning var påvises med bDHC (fra 4% til 33%).

En celle cyklus profil blev derefter skabt af udførelse PI /BrdU biparametriske analyse og anvendelse af selektiv gating eksklusive SubG1 population (fig. 1C). Som forventet Curcumin halveret S fasen befolkning og fordoblet G2 /M-celler. Samt Curcumin, bDHC-behandlede celler viste et klart fald af tidlig S population (fra ca. 33% til 5,9% og 4,8% efter 16 og 24 timer, henholdsvis) og en ophobning af G2 /M begivenheder (fra ca. 25% til ca. 42% og 50% efter 16 og 24 timer), mens der ikke er konstateret væsentlige ændringer i G0 /G1 procent.

for at skelne mellem G2 og mitose populationer, cellerne var dobbelt tastede med PI og en specifik antistof mod de mitotiske markør phospho-histon H3Ser10 anvendelse af flowcytometri (fig. S1A). Mens omkring 90% 4N celler var positive for phospho-histon H3Ser10 efter curcumin behandling blev kun omkring 2% detekteret som mitotisk population upon bDHC administration.

Sammenligningen mellem monoparametric og biparametriske analyser (Fig. 1B og Fig . 1C) fremhævede, at den væsentligste effekt af bDHC behandling er en G2 blok efter 16 timer og celledød efter 24 timer.

cytotoksisk aktivitet af bDHC blev undersøgt ved SEM-analyse (fig. S1B). Deep morfologiske ændringer af overfladen, såsom tab eller forstørret mikrovilli, membran “blærer” og apoptotiske legemer var til stede i bDHC behandlede celler. Desuden var der en stærk stigning af Annexin V-positive celler påvist efter 24 timers bDHC administration (61%) sammenlignet med DMSO (7%) og Curcumin (24%) behandlede celler (fig. 1D, venstre panel), hvilket antyder aktivering af en apoptotisk celledød.

for at undersøge reversibilitet af bDHC-vækst anholdelse, blev HCT116 celler behandlet i 24 timer med bDHC derefter vasket for at fjerne døde celler og udgivet i 24 timer i frisk medium. Der blev observeret en irreversibel effekt på cellelevedygtighed, med en klar akkumulering af SubG1 begivenheder (38%) og ingen stigning i nogen anden fase af cellecyklussen (Fig. 1D, midterste panel).

Ligesom HCT116, humane colon adenocarcinoma LoVo celler viste en tydelig stigning af SubG1 begivenheder efter bDHC administration i 24 timer (fra 2,6% i DMSO til 27,7% i bDHC behandlede celler) (fig S1c).

i overensstemmelse med forekomsten af ​​celler med hypodiploid SubG1 DNA-indhold, bDHC udløste phosphoryleringen af ​​histon variant H2AX (γ-H2AX), hvis funktion er associeret med DNA-fragmentering under apoptose [45], både i HCT116 og LoVo-celler (fig. 1D, højre panel og fig. S1c , højre panel).

bDHC inducerer celledød i HCT116 celler, men ikke i humane normale celler

Vi næste spekulerede på, om bDHC havde en tumor-selektiv aktivitet. Utransformerede humane fibroblaster (HF) og hepatiske føtale humane epiteliale normale celler (WRL68), hvis fordoblingstid er 24 timer, blev behandlet i 24 og 48 timer med bDHC 30 pM og vækst undertrykkende aktivitet blev derefter undersøgt ved FACS (Fig. 2A og B , venstre og midterste paneler). I HF celler, bDHC inducerede en progressiv akkumulering af S (fra 19,8% til 21,9% og fra 11,4% til 17% inden for 24 og 48 timer, henholdsvis) og G2 /M begivenheder (fra 16,8% til 24,7% inden for 24 timer, fra 8,5% til 34,5% inden for 48 timer). bDHC administration til WRL68 resulterede i en stigning af både S og G2 /M begivenheder så godt, men anderledes end HF celler, blev påvist maksimale virkninger efter 24 timer (fra 14% til 20,6% i S-fasen, og fra 19,1% til 33,7% i G2 /M-fase). Interessant, hverken HF eller WRL68 celler blev forpligtet til apoptotisk celledød og sammenhængende, blev ingen stigning af γ-H2AX udtryk observeret ved bDHC behandling (fig. S1D).

A. PI /FACS-analyse af HF cellecyklusprogression efter DMSO og bDHC behandlinger i 24 og 48 timer (venstre midterste panel, henholdsvis). PI /monoparametric cellecyklus analyse af bDHC-behandlede celler

versus

bDHC-frigivne celler (højre panel) (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). B. Venstre og midterste paneler: Analyse af cellecyklus progression af WRL68 celler efter 24 og 48 timer efter behandling med DMSO eller bDHC. Højre panel: PI /FACS monoparametric analyse af WRL68 celler behandlet med bDHC i 48 timer og derefter i frisk medium i yderligere 24 timer (A = SubG1, B = G0 /G1, C = S, D = G2 /M). C. Kvantitativ evaluering af bDHC koncentration ved UV-vis spektroskopi. Øverste venstre panel: bDHC genvundet fra cellelysater af HCT116 (•) og HF (▴) celler efter 24 timers behandling ved forskellige koncentrationer (10, 20 og 30 uM). bDHC genvundet fra cellepellets (ng) blev nævnt totale cellulære proteiner (mg), bestemmes ved hjælp af Bradford-metoden. Øverst til højre panel: Sammenligning af cellulær optagelse (20 og 30 uM koncentrationer) i HCT116 (sorte histogrammer) og HF-celler (grå histogrammer). Underpanel: bDHC genvundet fra kulturmedier efter inkubation af HCT116 (•) og HF (▴) celler med bDHC ved 10, 20 og 30 uM koncentration. Alle data blev normaliseret på kontrol (DMSO). Drug beløb blev bestemt ved at læse absorbans ved λ

max = 393 nm. Rapporterede værdier er et gennemsnit af tre uafhængige forsøg -. /+ SD

For at undersøge stabiliteten af ​​cellecyklussen blok induceret i normale celler, blev HF celler behandlet med bDHC i 48 timer, derefter vasket og udgivet i medikamentfrit medium i 24 timer. I modsætning HCT116, blev detekteret HF-celler gik fra G2 /M til G1-fasen (fra 48% til 56,3% efter frigivelsen) og ingen forøgelse af SubG1 (fig. 2A, højre panel). De reversible virkninger af bDHC på normale celler var endnu mere tydeligt i WRL68 celler, hvis cellecyklusfordeling efter 48 timer, og efter overgang til frisk medium perfekt overlappede at kontrol- celler (Fig. 2B, midterste og højre paneler).

Disse data antyder, at bDHC reversibelt blokerer cellecyklusprogression af ikke-maligne celler uden at inducere apoptose.

i den hensigt at optrævling arten af ​​bDHC selektivitet over colon cancerceller snarere end normale celler, udførte vi yderligere undersøgelser for at estimere variationen af ​​cellulær optagelse som en funktion af koncentration behandling i HCT116 og HF cellelinier. Data blev normaliseret og præsenteret som ng /mg totale proteiner (fig. 2C, øvre paneler) og dyrkningsmedium restmængder (ug) (fig. 2C, nederste panel). Optagelse af lægemiddel forøges i en dosisafhængig måde i begge cellelinier, men HCT116 afslørede en signifikant højere optagelse sammenlignet med HF cellelinje ved 30 uM: 4575 ± 40

versus

2979 ± 21 ng /mg total protein ( fig. 2C, øverste højre panel).

bDHC-induceret celledød er en caspase-afhængig proces

for at udforske bidrag caspaser om fuldbyrdelse af apoptose, vi pre-rugede HCT116 celler med den bredt caspaseinhibitor zVAD før behandling celler med bDHC i 24 timer (fig. 3A, venstre felt). En dramatisk dråbe SubG1 hændelser blev observeret samtidigt til en progressiv akkumulering af celler i S og G2 /M-faser (fra 11,7% til 24,5% i S-fasen og fra 16% til 40% i G2 /M, ved zVAD forbehandling) . Inhiberingen af ​​apoptose ved zVAD bestemmes en tydelig nedgang af phosphoryleret H2AX (fig. 3A, højre panel, og fig. S2A). Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol. Actin blev anvendt som indlæsning kontrol.