PLoS ONE: Regulering af MYC Expression og differentieret JQ1 følsomhed i cancerceller

Abstrakt

Højt MYC udtryk er forbundet med næsten alle menneskelige kræftformer. JQ1, en kemisk forbindelse, der inhiberer MYC-ekspression er terapeutisk effektiv i prækliniske dyremodeller i midterlinjen carcinom og Burkitts lymfom (BL). Her viser vi, at JQ1 ikke hæmmer MYC udtryk til et lignende omfang i alle tumorceller. BL-celler viste et fald -90% i MYC transkription efter behandling med JQ1 blev der imidlertid ingen tilsvarende reduktion ses i flere ikke-BL celler. Molekylært, disse forskelle forekomme på grund af krav Brd4, den mest aktive version af Positive Transskription elongeringsfaktor B (P-TEFb) inden for Super Elongation Complex (SEC), og transkriptionsfaktorer såsom Gdown1, og MED26 og også andre ukendt celle specifikke faktorer. Vores undersøgelse viser, at reguleringen af ​​høje niveauer af MYC udtryk i forskellige kræftceller er drevet af unikke reguleringsmekanismer, og at sådanne eksklusive regulatoriske signaturer i hver kræftceller kunne anvendes for målrettede lægemidler

Henvisning:. Fowler T, Ghatak P, Pris DH, Conaway R, Conaway J, Chiang CM, et al. (2014) Regulering af

MYC

Expression og differentieret JQ1 følsomhed i kræftceller. PLoS ONE 9 (1): e87003. doi: 10,1371 /journal.pone.0087003

Redaktør: Arun Rishi, Wayne State University, USA

Modtaget: September 23, 2013; Accepteret: 16. december 2013; Udgivet: 23 januar 2014

Copyright: © 2014 Fowler et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist understøttet af midler til CM. C (NIH CA103867, CPRIT RP110471, og Welch Foundation I-1805), og A.L.R (American Heart Association, 12GRNT12180023). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. J.E.B. har et mindretal egenkapital tildeling i Tensha Therapeutics. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer

Introduktion

lymfomer er groft inddeles i to kategorier:. Hodgkins og non-Hodgkins lymfom (NHL) [1]. De to mest almindelige former for aggressiv NHL er diffust storcellet B-celle lymfom (DLBCL) og Burkitts lymfom (BL) [1], [2], [3]. Translokation af proto-onkogenet

MYC

til én af immunglobulin gen loci [

IG-MYC

translokation; meste af t (8; 14) Q24; q32 typen] resulterer i afvigende

MYC

ekspression betragtes som den dominerende genetiske begivenhed i tilblivelsen af ​​BL og omkring 10% af DLBCL [4]. Udover translokation,

myc

kan undergå onkogen deregulering via højt niveau genamplifikation samt mutationer i cis-regulatoriske elementer i flere cancertyper (f.eks myelom, coloncarcinom og neuroblastom) [5], [6] . Desuden mens de fleste BLS har dereguleret c-

MYC

(herefter benævnt

MYC

) udtryk som følge af en

IG-MYC

translokation, at størstedelen af ​​ikke -BLs ikke bære

IG-myc

translokationer, men andre genetiske abnormiteter, der fører til dereguleret

MYC

udtryk. Selvom høj ekspression er begrænset til BLS, MYC target udtryk varierer på et lavere niveau på tværs ikke-BL og mellemliggende lymfomer og udgør en negativ prognostisk markør i disse lymfomer.

MYC dimeriserer med MAX at binde sit mål sekvens (E -boks) og regulere genekspression. MYC ikke kun aktiverer transkriptionen men undertrykker også målgenekspression enten via direkte biding (med Miz-1 transkriptionsfaktor) eller via regulering af mikro-RNA’er (Mirs) [7]. Imidlertid er funktionen af ​​MYC kompliceret som to nylige undersøgelser viser, at MYC ikke har en transkriptionel signatur men tjener til at forstærke udgangssignalet fra eksisterende transskriptionelle programmer i en given celle i stedet for at udføre sin egen transkriptionelle program [8], [9] .

MYC

tilhører en klasse af gener kaldet primært respons gener (prg), hvoraf mange havnen standsede Pol II på den proksimale promotor område, ved aktivering hurtigt kan skifte til en forlængede Pol II og funktionelle transkription [10]. Signalgivere afhængig stimulering resulterer i forøget acetylering ved histon 3 lysin 14 (H3K14Ac) og enten af ​​to H4 lysin parvis H4K5 /12 eller H4K8 /16, en begivenhed, som synes afgørende for bindingen af ​​bromodomain (BRD) proteiner, der rekrutterer transkriptionsfaktorer nødvendige for transkription [11], [12]. Rekruttering af positiv transskription elongeringsfaktor b (P-TEFb), og muligvis den generelle indledning cofaktor Mediator, spiller en vigtig rolle i Brd4-regulerede transskription af mange gener, herunder

MYC

. Faktisk efter ansættelsen af ​​Brd4, P-TEFb phosphorylerer forlængelsesfaktorer DSIF (Spt4 og Spt5), negativ elongeringsfaktor (NELF), og Pol II resulterer i frigivelse af på pause Pol II og efterfølgende forlængelse af transskription [10], [13] og for nylig revideret i [14]. Kollektivt, disse og andre resultater tyder på, at forlængelsen af ​​transskription er en kritisk regulatorisk punkt i orkestrere

MYC

regulering [10].

Som der kræves mange MYC-drevne processer til homeostase og vækst, terapeutisk strategier rettet mod graduering af

MYC

udtryk snarere end decideret undertrykkelse virke tiltrækkende. Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation første gang beskrevet thienodiazepine analoger, der kan hæmme kromatin binding af bromodomains relateret til BET familien [15]. Efterfølgende en nært beslægtet lille molekyle inhibitor, JQ1, har vist sig at være terapeutisk effektiv i prækliniske dyremodeller [16], [17], [18]. Disse og beslægtede små molekyler kompetitivt besætte acetyl-bindende lommer af BET bromodomains, hvilket resulterer i frigivelse af BET-proteiner (især Brd4) fra kromatin [19]. På trods af disse lovende demonstrationer, er JQ1 ikke hæmmer

MYC

udtryk i et tilsvarende omfang i alle tumorceller [19]. Således er det vigtigt at forstå, hvorfor JQ1 er effektiv i kun visse

MYC

-afhængige cancere, hvilket i sidste ende kan bestemme kliniske virkning af denne forbindelse i patienter.

Vi observerede, at selv om JQ1 behandling faldt Brd4 belægning til en lignende grad i de celletyper testet, evnen af ​​JQ1 reducere

MYC

transkription mellem celler afveg. I JQ1-sensitive celler, inhibering forekom på niveauet for spirende transkription påvirker Pol II, “paused” Pol II-Ser5-P, “forlængede” Pol II-Ser2-P, og P-TEFb belægning. Desuden er der en forskel i belægning af medlemmer af Super Elongation Complex (SEC), og faktorer forbundet med RNA-polymerase II, ved

MYC

promotorregioner i de to celletyper. Tilsammen indikerer vore data høje niveauer af

er MYC

opretholdt i forskellige cancerceller via distinkte mekanismer på niveauet for transkription forlængelse med forskellige komplimenter af transkriptionsfaktorer og er derfor udsat for forskellige JQ1 følsomhed.

Materialer og metoder

Cell Culture

Den modne mus B-celle lymfom Bal17 [20], menneskelige BL linjer Akata [21], Raji [22], og Ramos [23], og den menneskelige epitelial HeLa-S3 [24] blev dyrket i RPMI-medium med HEPES (Invitrogen) suppleret med 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 0,5 mM 2-mercaptoethanol-opløsning (Invitrogen) og 10% føtalt kalv Sera (Atlanta Biologicals). RNA assays anvendes 1-2 × 10

6 celler og 2 × 10

7-celler blev anvendt til chromatin immunoprecipitation (chip). JQ1, solubiliseret i DMSO, blev fortyndet i medier ved 1 uM og inkuberet med cellerne i 2 timer ved 37 ° C. Ingen virkninger på transkription blev observeret med DMSO kontroller (data ikke vist). Forsøg vist i figur S1 (File S1), der involverer BCR stimulering bestod af en 2 timers forbehandling med en uM JQ1 efterfulgt af 30 minutters udsættelse for antistoffragmenter specifikke for enten human eller mus BCR (Jackson Immunoresearch).

RNA-Real Time PCR analyse

Udføres som beskrevet tidligere [25]. Ct-værdier blev beregnet og signalet rapporteret som forholdet mellem mål løbet ACTB mRNA via lineære ligninger er specifikke for hvert primerpar. Myc primere er angivet i S3 (File S1), medmindre vist nedenfor.

mRNA Primere-mus

Myc Primere ikke er anført i figur S3 (File S1)

In1 /Ex1 5′-AGAGCTCCTCGAGCTGTTTG

5′-CGTCTACATTCAAGACGCAGA

ACTB 5′-AGGCATGGAGTCCTGTGGTATC

5′-AGCCACAGGTCCTAAGGCCAG.

Fos 5′-GGATTTGACTGGAGGTCTG

5’TGGGCTCAGGGTCGTTGA

mRNA Primere Menneskelig

Myc Primere ikke er anført i figur S3 (File S1)

In1 /Ex2 5′-GCACCAAGACCCCTTTAACTC

5′-TCCTGTTGGTGAAGCTAACGEx2 /In2 5′-AGCGACTCTGGTAAGCGAAG

5′-GTGGCCCGTTAAATAAGCTG

ACTB 5′-CTCTTCCAGCCTTCCTTCCT

5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG

Fos 5′-CTCCGGTGGTCACCTGTACT

5′-GTCAGAGGAAGGCTCATTGC

Western Blotting

Nuclear ekstrakter fra 2 × 10

6 celler blev udsat for 10% (Myc) eller 6% (Brd4) SDS-PAGE efterfulgt af Western blotting. Primære antistoffer (kanin-anti-C-terminale Brd4-C IgG og kanin-anti-Brd4-S484 /488-phos) [26], [27], kanin-anti-CREB IgG (cellesignalering) og sekundære (gede-anti-kanin peberrod peroxidase-bundet IgG, Invitrogen) antistoffer ved 1:1500. Blots blev visualiseret med Novex ECL kemo-selvlysende Substrat Regent Kit (Invitrogen) og densitometri udføres med ChemiDoc MP Imaging System (Biorad).

Strand-specifikke Detection

380 ng af RNA med 1 uM endelig primerkoncentration blev anvendt for hver RT-reaktion under anvendelse Invitrogens klonede AMV First Strand syntese kit. Strand-specifikke primere; for (+) streng de omvendte primere svarende til TSS området (+17 for muse og +11 til menneskeføde) og for (-) streng forward primere svarende til enden af ​​genet (+3948 for muse og +4791 til menneskeføde, sekvenser i figur S3, i File S1). Standard realtids-PCR-amplifikation af den blev anvendt med de angivne primere og deres fæller, vist i figur S2 (File S1), og de resulterende Ct-værdier blev omregnet til relativ ng og normaliseret til udgangs-koncentration af kromosomal RNA.

chromatin Immunfældning (chip)

En standard chip assay blev udført, og er blevet beskrevet tidligere [25]. PCR-primere og opbygning er vist i fig S3, i File S1. Ct-værdier blev beregnet og signalet repræsenteret% af input DNA via lineære ligninger er specifikke for hvert primerpar.

Chip Antistoffer Salg

Kanin polyklonalt anti-muse-RNA Pol II (N-20, sc -899, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser5P monoklonalt muse (sc-47701, Santa Cruz), RNA Pol II-Ser2P H5 muse-ascites (Covance), H3K36me3 polyklonalt (ab9050, Abcam), anti-cyklin T kanin-polyklonalt (H-245, sc-10750, Santa Cruz), kanin anti-C-terminale BRD4 IgG [27], MED26 muse-anti-MED26 /CRSP7 (Ab50619, Abcam), Gdown1 fåre anti-Gdown1 IgG [28], anti- AFF4 antistof [29] og anti-ELL2 antistof [29].

Sequencing Analysis

Figur S2 (File S1) viser sekventering data fra University of California Santa Cruz Genome Browser (UCSC GB) spor “wgEncodeUtaChIPseqBaseOverlapSignalHelas3Pol2” (HeLa S3) og GEO datasæt GSM920942 (Raji), kortlagt til humant genom build hg18. The University of California Santa Cruz Genome web browser normaliseret til den højeste top i TSS.

Resultater

Differential JQ1 følsomhed

Vi udførte dosis- og tidsafhængig test af Brd4 hæmning med JQ1 og bemærkede effekten på

MYC

transskription i en række celler, herunder HeLa-S3-celler, hvis MYC udtryk blev rapporteret [19] for at være resistente over for JQ1 behandling. Vist i fig. 1A, testede cellelinier udtrykker

MYC dele på højt niveau, der svarer til niveauerne detekteret på toppen af ​​primær naive hvilende B-celle-induktion (data ikke vist). Steady state mRNA niveauer af

MYC

i en ikke-BL murin B-celle lymfom linje (Bal17), at over udtrykker

MYC dele på niveauer svarende til de BL-celler og HeLa-celler viste ingen signifikant følsomhed over for JQ1 (fig. 1A). Både HeLa- og Bal17 celler fortsatte denne modstand ved koncentrationer op til 5 uM (data ikke vist), mens

MYC

RNA i BL celler blev ensartet faldt med -90%, når behandlet med 1 uM JQ1 i en periode på to timer (fig. 1A). BL celler rapporteres at udtrykke 2- til 5-fold mere

MYC

-specifik RNA end B-cellelinier uden en translokation [30]. Selv Western blotting d angiver Raji BL linje udtrykker mere MYC protein, i overensstemmelse med mRNA-data (fig. 1A), JQ1 behandling faldt MYC proteinekspression i Raji, men ikke HeLa og Bal17 (data ikke vist). Sammen disse resultater viste, at JQ1 modstand opstod i både ikke-lymfom og lymfom cellelinjer, der repræsenterer både murine og humane arter.

Bal17 (Murin B-celle), Human HeLa og menneskelige BL Raji celler og enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM af JQ1 i 2 timer. (A) mRNA-analyse blev udført tredobbelt, rapporteres i forhold til ACTB mRNA-ekspression og er vist som gennemsnittet og standardafvigelsen for tre eksperimenter. (B) Påvisning af primær transskription af PCR-amplifikation ved anvendelse af primere tværs intern exon /intron grænser

MYC

blev udført tre gange og rapporteres i forhold til ACTB mRNA-ekspression. (C) Strand-specifik transkription blev påvist ved streng specifik revers transkription amplifikation som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder efterfulgt af standard PCR metoder. Disse forsøg blev udført to gange.

Da mRNA produktion ikke nødvendigvis korrelerer med primær udskrift produktion [25], [31], vi testede effekten af ​​JQ1 på primær transskription. Analyse af primære transkript, udført med primere mod exon /intron grænser

MYC

(vist skematisk i Supplemental Fig. 3 og /eller anført i Materialer og fremgangsmåder), viste, at primær transskription følsomhed over for JQ1 var parallel med at af mRNA (fig. 1B). Således lang, og formodentlig i fuld længde, primære transkripter enten var resistente (Bal17 eller HeLa) eller følsomme (Raji) til JQ1. Derfor er forskellen i JQ1 responser korreleret med primær transskription og ikke skete på niveauet for post-transkriptionel modifikation, såsom splejsning og mRNA eller proteinstabilitet.

divergerende transkription er almindelige af mange promotorer i organismer og spiller en vigtig rolle i genregulering [32]. Faktisk har antisense transskription fra

MYC

locus blevet observeret i flere cellelinjer [33]. Fordi vi kun målte totale steady state-RNA (fig. 1A), også differentiel JQ1 følsomhed afspejler forskelle i mulige transskription hidrørende fra 3′-enden blev testet. Selvom antisense transkription i både Bal17 og HeLa-celler var lille i forhold til sense transkription, var stort set upåvirket af JQ1 (fig. 1C, venstre og midterste paneler). Den store forskel i niveauet af sense og antisense transkripter observeret blandt forskellige cellelinier er for tiden uforklarlig men kan afspejle en kombination af transkriptionelle og post-transkriptionelle virkninger. Uanset, ligesom fornuft transskription, antisense transskription stammer fra

MYC

locus i Raji celler blev hæmmet af JQ1 (Fig. 1C, højre panel). Så selv om flere antisense transskription blev bemærket i Raji celler, forskellen i JQ1 følsomhed var ikke sandsynligvis på grund af forskelle i antisense udskrifter.

JQ1 fører til nedsat Brd4 Belægning i Resistant og sensitive celler

vi observerede, Brd4 rekruttering blev reduceret med JQ1 i begge celletyper-derfor, at forskellen i JQ1 følsomhed mellem forskellige celler, ikke skyldtes permeabilitet. Vi bemærkede også, at Brd4 rekruttering til transkriptionsstartsitet (TSS) var omtrent 2,5 gange mere i Raji (+11) celler sammenlignet med Bal17 (17) (fig. 2A). HeLa udstillet Brd4 rekruttering og JQ1 følsomhed ligner Bal17 (data ikke vist). Desuden var der en signifikant mængde Brd4 belægning noteret på tværs af kroppen af ​​

MYC

i alle cellerne testet, om der var en højere grad af kodende region belægning i Bal17-celler. Selvom ofte forbundet med 5′-end forstærkere og initiativtagere har Brd4 vist sig at besætte den kodende region af prg som c-

fos

og

MYC

[26].

Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM JQ1 i 2 timer. (A) kromatin Immunfældning (chip) på tværs

MYC

med anti-C-terminale Brd4 antistof. Hvert forsøg blev udført to gange, analyseret i tre eksemplarer via real-time PCR og rapporteres som middelværdien og standardafvigelsen for de to eksperimenter. En repræsentation af promotor-området af

MYC

er fastsat til orientering. (B) Western blotting for at opdage (længst til venstre) Brd4 (~180 KD) og (midten) Brd4-S484 /488-phos (P-Brd4, ~220 KD) blev udført tre gange. En ikke-specifikt bånd detekteret med phopsho-Brd4 antistof er betegnet med en stjerne. Typiske resultater er vist med densitometrianalyse forhold til CREB udtryk, der bruges som en normalisering kontrol (yderst til højre).

Promotor rekruttering af Brd4 kræver fosforylering på S484 og S488 og sletning af denne region resulterer i faldt CycT og Pol II belægning og transskription [26]. Overensstemmelse med chippen assay Western blotting viste en højere grad af total Brd4 i Raji kerneekstrakter sammenlignet med HeLa og Bal17, selvom Brd4-S484P /S488P i Raji celler var lidt mindre i forhold til Bal17 og HeLa (fig. 2B). Interessant, P-BRD4 bånd i HeLa-celler migrerede hurtigere end både Raji eller Bal17 P-Brd4 band, hvilket måske afspejler en lille forskel i omfanget eller stedet for fosforylering. Dog kan forskellen i phosphoryleret Brd4 (den aktive form) mellem forskellige celler ikke forklare forskellene i JQ1 følsomhed.

Brd4 interagerer med faktorer, som enten rekruttere Pol II til stedet for transskription eller drive transkriptionelle kompleks fra pause til forlængelse mode (revideret i [10]). Desuden blev en reduktion af funktionel Brd4 resulterer i stærkt reduceret Pol II belægning vist sig at indebære et tab af P-TEFb [26]. Selv om niveauet for samt strukturen P-TEFb belægning i både ubehandlet JQ1 følsomme og resistente celletyper var ens, JQ1 behandling /Brd4 hæmning faldt P-TEFb belægning kun i Raji celler (Fig. 3). Disse resultater indikerede niveauer af BRD4 afhængighed for opretholdelse af P-TEFb belægning varierer i forskellige cellelinier (fig. 3).

Bal17 og Raji-celler var enten ubehandlede eller behandlet med 1 uM af JQ1 i 2 timer. Rekruttering af P-TEFb blev detekteret ved chip assays. Hvert forsøg blev analyseret i tre eksemplarer via real-time PCR, udført to gange, og rapporteres som middelværdien og standardafvigelsen af ​​de to eksperimenter.

RNA Pol II Rekruttering

Vi næste bestemmes, hvis forskellen i JQ1 selektivitet skyldes en forskel i almindelighed transskription apparat rekruttering ved RNA-polymerase II (Pol II). Mens alt Pol II blev stærkt nedsat på tværs af kroppen af ​​

MYC

i Raji celler efter JQ1 behandling, blev det ikke ændret i JQ1 resistente Bal17 linie (fig. 4A). Begge celletyper viste Pol II belægning på P

0 promotor, som er blevet vist at korrelere med et meget højt niveau af transkription [34]. Mange aktivt transskriberede gener (herunder

MYC

) udviser standsede Pol II på deres proksimale initiativtagere [35]. I overensstemmelse med dette begreb, observerede vi en høj grad af promotor-associeret Pol II i begge celletyper, selv om to gange mere Pol II blev bemærket ved den proximale promotor (omtrent svarende til P

0 promotorregion) i Bal17 ( -354) sammenlignet med Raji (-279). Interessant, som noterede sig med Brd4 og P-TEFb (fig. 3 og 4), i alt Pol II blev reduceret på et sted umiddelbart nedstrøms (0,6 kb) i TSS og skarpt steget bagefter (fig. 4A).

Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM JQ1 i 2 timer. (A) Pol II blev påvist ved antistof mod N-terminalen af ​​Pol II (B) Pol II serin 5-P (C) Pol II serin 2-P. Chromatin chip assays blev udført in duplo. Hvert eksperiment blev analyseret i tre eksemplarer via real-time PCR, udført to gange, og rapporteres som middelværdien og standardafvigelsen for to forsøg.

Fordi phosphorylering af det carboxyterminale domæne (CTD) af RNA Pol II er forbundet med regulering af transskription initiering og forlængelse på mange initiativtagere [36], [37], analyserede vi disse begivenheder i de to celletyper i fravær og tilstedeværelse af JQ1. Mens RNA Pol II phospho-Ser5 (Pol II S5P) niveauer i Bal17 celler forblev stabil efter JQ1 behandling, Pol II S5P niveauer i Raji-celler var følsom for JQ1 (fig. 4B). Men overraskende, Pol II S5P niveauer var refraktære ved P

0 og TSS sites (fig. 4B, højre panel), men følsom i den sidste halvdel af genet med en lille ændring startende nedstrøms for

MYC

P3-promotoren (2244) og bliver stadig mere følsom længere nede på kroppen af ​​genet. Hvorvidt væsentlig mængde Pol II-Ser5P 3’belægning vist her er direkte skyldes 3’Brd4 belægning eller en overflod af transkriptionskomplekser “sikkerhedskopiere” resulterer i reduceret forlængelse og efterfølgende pauser ved 3′-terminalen er ukendt.

Mens Ser5 phosphorylering er forbundet med en kompetent men midlertidigt afbrudt Pol II, Ser2 phosphorylering af Pol II CTD (Pol II S2P) repræsenterer forlængende Pol II [37]. I fravær af JQ1, Pol II S2P belægning i begge celletyper opstod på tværs af kroppen af ​​genet med toppe ved promotorregionerne, og 3′-enden. Overraskende, mens promotor og TSS-associerede Pol II S2P niveauer i Raji-celler var følsom for JQ1, nedenstrøms forbi P

3 udviste ingen JQ1 følsomhed indtil forbi 3’UTR (5472) (fig. 4C), hvilket tyder at størstedelen af ​​fuldt forlængende RNA-polymerase II i disse JQ1 sensitive celler var refraktære over for JQ1. Vi observerede også en JQ1-afhængig stigning i Pol II-Ser2P i Bal17 linje og mens denne stigning var svag på promotoren og TSS regioner, var det meget tydeligt ved 3′-terminalen.

Forskelle i H3K36me3

en mulig måde at afgrænse mellem opstrøms og nedstrøms virkninger på Pol II-Ser2 belægning er at bestemme mønstret for tri-methylering af histon 3 rest lysin 36, H3K36me3, hvilket er tegn på en nylig passerer forlængende transkriptionskomplekset [37]. I Bal17 celler, JQ1 behandling forbedret de H3K36me3 signaler over genet (fig. 5). Men i Raji celler, JQ1 behandling faldt H3K36me3 fra P

0 gennem TSS indtil P

3 region. Men ud over P3, den H3K36me3 blev, resistente over for JQ1 (fig. 5), som observeret med Pol II S2P (fig. 4C), hvilket tyder på, at når RNA Pol II var i forlængelse tilstand, det var ufølsom over for JQ1. Sammen viste vores data, at

MYC

nærede transskription komplekser med variabel Brd4 afhængighed i forskellige celletyper, og at Brd4 hæmning resulterede i en differentieret respons på niveau med overgangen fra pause til forlængelse.

Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM JQ1 i 2 timer. Chip assays blev udført in duplo. Hvert forsøg blev analyseret i tre eksemplarer via real-time PCR, udført to gange, og rapporteres som middelværdien og standardafvigelsen af ​​de to eksperimenter.

Tilbehør Transskription forlængelsesfaktorer

P- TEFb ofte fungerer som en underenhed af Super Forlængelse komplekser (SEC), der består af P-TEFb og en blanding af en af ​​tre ell familiemedlemmer, en af ​​to EAF familiemedlemmer, en af ​​to AF4 familiemedlemmer (AFF1 og AFF4), og enten ENL eller AF9 [29], [38]. Som SEC familie af Pol II forlængelsesfaktorer er rapporteret at indeholde de mest katalytisk aktive versioner af P-TEFb aktive i højt niveau transkription og regulere et checkpoint fase af transkription forbundet med forlængelse [29], [39], [40] , vi kiggede på SEC rekruttering på

MYC

i forskellige celletyper. AFF4 er rapporteret at fungere som et centralt bindende platform for forlængelsesfaktorer i mange SEC formationer og målrette

MYC

og regulere sit udtryk i cancerceller [39]. Niveauet af AFF4 belægning i Bal17-celler var lav og refraktære JQ1 (fig. 6A, toppanel), men steg i nærværelse af JQ1. I modsætning hertil AFF4 rekruttering i Raji celler var meget større og følsom over JQ1. Selvom AFF4 promotor belægning i Raji celler, især omkring 2244 site, var variabel i fravær af JQ1 blev det faldt betydeligt i overværelse af JQ1. Øvrigt i overensstemmelse med de Pol II S2P og H3K36me3 resultater blev JQ1 følsomhed tabt forbi P

3 promotorregionen (2244), en gang igen antyder, at den forlængede transkription komplekset var refraktære over for JQ1 (fig. 6A, bundpanel) .

Celler var enten ubehandlet eller behandlet med 1 uM JQ1 i 2 timer. (A) AFF4 blev detekteret af Chip tværs af længden af ​​

MYC

gen i både Bal17 og Raji-celler. (B) Påvisning af AFF4, ELL2 og MED26 i promotorregionerne af ubehandlet humane HeLa og Raji-celler. Chip assays blev udført in duplo. Hvert forsøg blev analyseret i tre eksemplarer via real-time PCR, udført to gange, og rapporteres som middelværdien og standardafvigelsen af ​​de to eksperimenter.

Vi kiggede efterfølgende til belægning af en anden SEC komponent, ELL2, som er blevet rapporteret at spille en rolle i overgangen fra midlertidigt standset Pol II mod forlængelse [40]. Vi testede også belægning af Mediator komponent (MED26) samt Gdown1. Selvom først knyttet til indvielse, en rolle for Mediator i rekruttering Pol II transskription forlængelsesfaktorer og fosforylering af Pol II CTD regulerer Pol II pause og forlængelse er opstået [41]. Mediator-komplekset mest stærkt forbundet med Pol II omfatter MED26, som har vist sig at forøge aktivering af transkription in vitro i en større grad end andre former for Mediator kompleks og spiller en central rolle i SEC rekruttering og MYC transkription [41]. Gdown1 er en Pol II-bindende protein vist sig at være nødvendigt for en Mediator-afhængig reaktion på aktivering af transkription [42]. Mere hensigtsmæssigt at denne undersøgelse har Gdown1 nylig vist sig at øge stabiliteten af ​​standsede Pol II og regulere P-TEFb aktivitet [28].

Da de tilgængelige antistoffer mod ELL2, Med26 og Gdown1 var arter (menneske) specifikke, anvendte vi HeLa og Raji-celler til disse eksperimenter. På grund af forskellene fokuseret omkring P3-regionen, vi fokuseret på den generelle promotor-regionen (P

0, TSS, og P

3) at teste forskellene mellem disse cellelinjer. Som observeret for Bal17 celler, HeLa-celler udviste lav AFF4 rekruttering på dette område i sammenligning med Raji celler (Fig. 6B). I overensstemmelse med AFF4 rekruttering resultater, øget ELL2 belægningsprocent nær P

3 blev set i Raji celler sammenlignet med HeLa-celler. MED26 belægning viste et mønster, der svarer til den for andre SEC komponenter med en stigning, men mere beskedent, nær P

3 promotor i Raji celler (Fig. 6B). Endelig observerede vi, at Gdown1 fulgte et mønster, der svarer til SEC og Mediator med en stigning omkring P

3 promotor i Raji celler (Fig. 6B).

Discussion

Due til betydningen af ​​

MYC

i tilblivelsen af ​​hæmatopoietiske maligniteter, har været rettet intense indsats for de seneste to årtier mod at forstå dens regulering. Men i betragtning af at

MYC

overekspression er forårsaget af en overflod af genetiske læsioner, er et ensartet regelsæt for dens transkriptionel regulering stadig mangler. Nylige fremskridt på dette område omfatter opdagelsen af ​​et lille molekyle-hæmmer, JQ1 der falder

MYC

udtryk og er terapeutisk effektiv i prækliniske dyremodeller for midterlinjen carcinom og i BL celler. Men JQ1 ikke hæmmer

MYC

udtryk i et tilsvarende omfang i alle kræftceller, yderligere understregning at

MYC

transskription er måske under forskellige kontroller i forskellige cancer celletyper. I overensstemmelse med dette begreb, opdagede vi, at JQ1 hæmmer

MYC

udtryk i alle BL-afledte celler testet, men hæmmer ikke

MYC

udtryk i nogle andre cancer cellelinjer, som observeret tidligere (19) . Fordi

MYC

deregulering kan ske via forskellige tilstande, vi hypotese, at i distinkte lymfom fænotyper, højt niveau

MYC

udtryk kan komme under kontrol af forskellige transkriptionelle og epigenetiske reguleringsmekanismer, som kan være følsomme eller resistente over for JQ1 /Brd4 inhibering. I denne undersøgelse, vi udforskede disse mekanismer til at etablere

MYC

transkriptionelle og epigenetiske signaturer forbundet med bestemte celletyper med håbet om, at disse underskrifter bedre vil definere lymfom undertyper og give nye terapeutiske muligheder for at udforske for klinisk aggressiv B-celle lymfomer .

Selvom BL celler er en heterogen masse med forskelle i længden af ​​Ig /MYC translokation, der efter sigende oversætte til variable niveauer af

MYC

overekspression [43], BL-celler i vores hænder (fig . 1 og figur S1, i File S1), og andre [19], er ensartet modtagelige for hæmning af

MYC

udtryk via Brd4 hæmning af JQ1. Denne inhibering synes at være, uanset om disse er EBV positive eller negative BL linier (vores undersøgelse og ref 19). Brd4 er primært forbundet med 5′-end initiativtagere og forstærkere [44], [45], [46], og mens vi kan se en mere fremtrædende niveau af Brd4 på TSS i Raji celler (Fig. 2), vi også observere Brd4 belægning på tværs af kroppen af ​​

MYC

gen i JQ1 resistente celler (fig. 2). En funktion af Brd4 er P-TEFb rekruttering og P-TEFb belægning gør parallel Brd4-inhibitor følsom

MYC

transskription, til trods for at der er lidt forskel i P-TEFb belægning i ubehandlede celler enten resistente eller følsomme celler. Fremgår det derfor, at i celler resistente til JQ1, en Brd4-uafhængig mekanisme virker til at rekruttere eller fastholde P-TEFb og producere høje niveauer af

MYC

transskription.

Fordi SEC komponenter AFF4 og ELL2 spille en rolle i

MYC

regulering og transkriptionel forlængelse, vi hypotese, at en stigning i disse co-faktorer kan slappe Brd4 krav. Overraskende, deres øgede tilstedeværelse faktisk korreleret med øget krav til Brd4 (Fig. 6). Positionen af ​​øgede SEC komponenter sammen med MED26 og Gdown1 omkring P3-promotoren antyder høj transkriptionel aktivitet eller en regulerende checkpoint i denne region, som ikke er til stede i celler, som er resistente over for JQ1 (opsummeret i figur 7). Det er blevet bemærket, at i BL celler, på grund af

MYC-IG

translokation, den ellers mindre P3-promotoren ofte bliver aktiv og korrelerer med højere MYC-ekspression [43]. Kombineret med den seneste demonstration af, at den translokeres

MYC

locus havne super forstærkere, der er følsomme over for JQ1 [45], hæver det muligheden for, at mekanismen for transkriptionel regulering af

MYC

involverer sin native /ikke-omplantede forstærker er anderledes (fig. 7B, figur S2, i File S1).

(A) Resumé af niveauer af faktor belægning spænder over

MYC

promotor P

0,