PLoS ONE: Cykliske AMP-responselementet reguleret Cell Cycle Arrestationer i kræftceller

abstrakt

Vi har for nylig påvist, at trichosanthin (TCS), et lovende middel til behandling af cervikal adenokarcinom, inhiberede HeLa celleproliferation gennem PKC /MAPK /CREB signalvej. Endvidere TCS nedreguleres Bcl-2-ekspression blev ophævet af en attrap oligonukleotid (OGN) til cyklisk AMP-responsive element (CRE). Attrap OGN blokerede bindingen af ​​CRE-bindende protein (CREB) til Bcl-2. Disse resultater antydede, at CRE-medieret gen ekspression kan spille en central rolle i HeLa-celleproliferation. Men lidt er kendt om effekten af ​​FKS på cellecyklus anholdelser, især, om de er involveret i cellecyklus gener reguleres af CRE. Vores nuværende undersøgelse viser, at anholdelsen af ​​S, G1 og G2 /M-faser blev ledsaget af den betydelige nedregulering af cyklin A, D1 og CDK 2, 4 i HeLa-celler, cyklin D1, E og CDK 2, 4 i Caski og C33A celler og cyclin A, B1, E og CDK 2 i SW1990 celler. Imidlertid blev cellecyklus anholdelser vendt via den betydelige opregulering af cyklin A og D1, af den kombinerede behandling af FKS og CRE. Som konklusion viser disse data for første gang, at specifikke cellecyklus anholdelser i cancerceller kan induceres af FKS ved at hæmme bindingen af ​​CREB til CRE om gener relateret til celleproliferation

Henvisning:. Wang P, Huang S, Wang F, Ren Y, Hehir M, Wang X, et al. (2013) Cyklisk AMP-respons Element regulerede cellecyklus Arrestationer i kræftceller. PLoS ONE 8 (6): e65661. doi: 10,1371 /journal.pone.0065661

Redaktør: Hong Wanjin, Institut for Molekylær og Cell Biology, Biopolis, USA

Modtaget: November 18, 2012; Accepteret dateret 25. april 2013; Udgivet: 28 juni 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (81071653), Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen (Y2111136), Advanced Key videnskabelige og teknologiske programmer af Ningbo (2011C51005), Natural Science Foundation of Ningbo (2011A610050) og KC Wong Magna fonden i Ningbo University. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Trichosanthin (TCS), en aktiv komponent isoleret fra de dybereliggende knolde af den kinesiske lægeurt

Trichosanthes kirilowii

[1], er et lovende middel til behandling af kræft [2]. Vores tidligere rapporter viste, at FKS inhiberede cervikal adenokarcinom HeLa-celleproliferation [3] gennem PKC /MAPK /CREB signalvej [4]. Endvidere TCS nedreguleres Bcl-2-ekspression [5], som blev ophævet af en cyklisk AMP-responsive element (CRE, TGACGTCA) decoy oligonukleotid (OGN), blokerer CRE-bindende protein (CREB) bindingsstedet på Bcl-2 [6]. Disse resultater antyder, CRE-medieret gen ekspression kan spille en central rolle i HeLa-celleproliferation.

Men kun lidt om virkningen af ​​FKS på standsning af cellecyklus af HeLa celle, cervikalt skæl carcinom (Caski og C33A celle), og human pancreas carcinom (SW1990 celle), især om gener relateret til cellecyklus blev reguleret af CRE lokkedue OGN.

i den foreliggende undersøgelse, vi nærmere virkningerne af FKS om spredning af kræftceller, celle cyklus anholdelser i forløbet af celledeling og den rolle, CRE i celle cyklus regulering.

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge virkningerne af FKS om kræft celledeling og virkningen af ​​CRE om TCS-induceret cellecyklus anholdelser. Et vigtigt spørgsmål var, om CRE-kombineret cycliner spillet en afgørende rolle i reguleringen af ​​cellecyklus arrest i disse cancerceller.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur

cervikale celler (HeLa, Caski, C33A) og SW1990 celler blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, USA). HeLa, Caski, C33A [7] og SW1990 celle [8] blev dyrket i monolag i RPMI 1640-medium (Gibco, NY, USA) og Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (BioWhittaker, Inc., Walkersville, MD, USA), i en CO

2 inkubator (Forma Scientific, USA). Mediet blev udskiftet to gange om ugen, og celler blev passeret hver 4-5 dage i et forhold på 1:03. Salg

Cell behandling

Celler blev udpladet ved 2 x 10

6 celler /skål i 100 mm skåle i det basale medium. Ved sammenløb, blev de vasket kortvarigt med PBS og derefter behandlet med TCS (Jinshan apotek selskab, Shanghai, Kina). Kontrolceller blev inkuberet i TCS-medium.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev vurderet med Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) under anvendelse af de tidligere beskrevne fremgangsmåder [3 ], [4], [9].

Behandling af celler med CRE-OGNs

CRE lokkedue OGN (5′-TGACGTCAGAGAGCGCTCTCTGACGTCA-3 ‘) og kontrol OGN (5’TGACGTCATGACGTCATGACGTCA- 3 ‘) blev konverteret til phosphorthioat OGNs (Invitrogen Carlsbad, CA, USA) som tidligere beskrevet [5], [6], [10].

Udarbejdelse af cytosol og nukleare proteiner

præparater af cytosoliske og nukleare proteiner blev udført som tidligere beskrevet [6], [11], [12]. Kort fortalt, ved afslutningen af ​​hver designeret behandling blev cellerne vasket kortvarigt med kold PBS og lyseret ved skrotning dem i 0,5 ml kold hypotonisk puffer (10 mM HEPES, 40 mM KCI, 3 mM MgCb

2, 1 mM dithiothreitol, 0,2 % NP-40, 1 ug /ml aprotinin, 2 uM leupeptin, 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 40 mM p-nitrophenylphosphat, 1 mM natriumorthovanadat og 50% glycerol). Lysaterne blev opsamlet og inkuberet på is i 5 minutter, derefter centrifugeret ved 15.000 x g i 20 s. Supernatanten blev opsamlet og gemt som de cytosoliske fraktioner. De pellet (dvs. cellekerner) blev resuspenderet i hypertonisk puffer (20 mM HEPES, 420 mM KCI, 1,5 mM MgCl

2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM dithiothreitol, 0,2% NP-40, 1 ug /ml aprotinin, 2 uM leupeptin, 0,5 mM phenylmethylsulfonylfluorid, 40 mM p-nitrophenylphosphat, 1 mM natriumorthovanadat og 25% glycerol). Efter inkubation på is i 60 minutter blev prøverne centrifugeret ved 15.000 x g i 20 minutter og supernatanterne blev opsamlet og gemt som kerneekstrakter. De cytosoliske fraktioner og nukleare ekstrakter blev kogt i 10 minutter og opløst i 8% SDS PAGE.

Cellecyklusanalyse

I flowcytometrianalyse af cellecyklus, 1 × 10

6 celler blev høstet ved centrifugering, vasket med PBS og fikseret med iskold 70% ethanol natten over. Fikserede celler blev behandlet med 25 ug /ml RNase A ved 37 ° C i 30 minutter og derefter farvet med propidiumiodid (PI) (50 ug /ml, Sigma) opløsning i 30 minutter i mørke. Fluorescensintensiteten af ​​individuelle celler blev målt ved et flowcytometer (Beckman Coulter, Miami, FL, USA). Mindst 10.000 celler blev talt [13].

Western blot-analyse

Totale cellelysater blev fremstillet ved lysis af celler med radioimmunudfældning assaypuffer og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af proteinet assaykit (Bio -Rad). Til Western blot-analyse blev 50 ug af hver prøve behandlet som beskrevet [14]. Følgende antistoffer blev anvendt: anti-cyclin A, B1, D1, E, anti-CDK2, 4 og anti-actin (cellesignalering Thehnology, Inc., Beverly, MA). De sekundære antistoffer blev koblet til peberrodsperoxidase og detekteret ved kemiluminescens (Bio-Rad, Hercules, CA). De relative mængder af immunoreaktivt protein i hvert bånd blev bestemt ved scanning densitometrisk analyse af røntgenfilm.

Statistisk analyse

Alle eksperimenter blev gentaget tre gange. Dataene blev udtrykt som middelværdi ± SD. ANOVA blev anvendt til at vurdere forskellene mellem grupperne. Data rapporteret som middelværdi ± SD af tre uafhængige forsøg. Forskelle blev betragtet som signifikante, hvis

s

. 0,05

Resultater

Effekter af FKS på spredning af kræftceller

TCS på 20-100 mg /ml inhiberede proliferationen af ​​celler med 3% til 70% efter behandling i 24 timer (fig. 1). De 50% inhiberende koncentration (IC

50) af FKS på Caski og C33A celler viste sig at være 60 ug /ml, lavere end på HeLa og SW1990 celler (100 pg /ml) (Tabel 1).

TCS inhiberede celleproliferation på en dosis-afhængig måde. Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol).

Effekter af FKS på cellecyklus fremskridt og cellecyklus regulerende proteiner Salg

TCS-behandlede cancerceller blev analyseret ved flowcytometri. En dosisafhængig celle antallet stiger af S, G1, G2 /M fase blev vist i HeLa, Caski, og SW1990 celler henholdsvis efter de blev behandlet i 24 timer, (tabel 2). Niveauerne af cellecyklus relaterede proteiner blev bestemt ved Western blot-assay. TCS faldt overflod af cyclin A, D1 og CDK 2, 4, mens det ikke havde nogen markant virkning på ekspressionen af ​​cyclin B1 og E i HeLa celle (fig. 2). I Caski celle, cyclin D1, E og CDK 2 blev 4 faldt betydeligt, hvorimod ingen markante ændringer blev vist i ekspressionen af ​​cyclin A og B1 (fig. 3). Lignende resultater blev fundet i C33A celler (data ikke vist). I SW1990 celle, cyclin A, B1, E og CDK 2 var signifikant nedreguleret, blev der ikke forskellige virkninger observeret i ekspressionen af ​​cyclin D1 og CDK4 (fig. 4).

HeLa-celler blev behandlet med angivet doser af FKS i 24 timer. Celle antal S-fasen steget betydeligt (A) og udtryk for cyclin A, D1 og CDK2, 4 faldt betydeligt (B). Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol)

Caski celler blev behandlet med angivne doser af FKS for 24 timer.. Celleantal på G1-fasen steget betydeligt (A) og udtryk for cyclin D1, E og CDK2, 4 faldt betydeligt (B). Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol).

SW1990 celler blev behandlet med angivne doser af FKS for 24 timer. Celletal på G2 /M-fase steget betydeligt (A), udtrykkene for cyclin A, B1, E og CDK2 faldt betydeligt (B). Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol).

Virkninger af CRE-lokkedue om de fremskridt cellecyklus og lovgivningsmæssige proteiner

de anholdelser af S, G1 og G2 /M faser induceret af TCS i HeLa (fig. 5), Caski (fig. 6) og SW1990 (fig. 7) celler, blev betydeligt svækket ved den kombinerede behandling af FKS og CRE (A, B). Det blev konstateret, at TCS-inducerede fald i cyclin A og D1 markant blev vendt ved tilsætning af CRE, i HeLa-celler (fig. 5, c, d), Caski-celler (fig. 6 C, D) og SW1990 celler ( fig. 7 C, D).

TCS-inducerede stigning af celleantal i S-fase blev signifikant svækket ved den kombinerede behandling af TCS + CRE (A, B). Den nedreguleret udtryk for cyklin A og D1 blev vendt af TCS + CRE. Ingen effekt blev observeret på andre proteiner (C, D). Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol,

#

s

0,05 sammenlignet med TCS).

TCS-inducerede stigning af celleantal i G1-fasen blev signifikant svækket ved TCS + CRE (A, B). Den nedreguleret udtryk for cyklin D1 blev vendt ved behandlingen af ​​TCS + CRE. Ingen effekt blev observeret på andre proteiner (C, D). Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol,

#

s

0,05 sammenlignet med TCS).

TCS-inducerede stigning af celleantal i G2 /M fase blev signifikant svækket ved behandling af TCS + CRE (A, B). Nedreguleret ekspression af cyclin A blev vendt ved behandlingen af ​​TCS + CRE. Der var ingen effekt på andre proteiner (C, D). Dataene repræsenterer midler ± SD af tre uafhængige forsøg (*

s

0,05 sammenlignet med kontrol,

#

s

0,05 sammenlignet med TCS).

diskussion

Denne undersøgelse viste for første gang, at FKS udøvede cytotoksiske virkninger på cancer cellelevedygtighed på en dosis-afhængig måde (fig. 1). Caski og C33A celler blev følsomme for den hæmmende virkning på celleproliferation (tabel 1). Resultaterne af det anticancer mekanismer viser klart, at stigningen i S-fasen i HeLa-celler ledsaget faldet i G

1 fase celler, mens antallet af G

2-fase celler ændrede sig ikke. I Caski og C33A celler, signifikant stigning i G

1 fase og fald i S og G

2 fase celler blev observeret. I SW1990 celler, en stigning på G

2 /M fase celler blev ledsaget af et fald på G fase celler

1, med ingen ændring findes i antallet af S-fase celler (tabel 2).

Undersøgelse ændringerne i multiple regulatoriske molekyler involveret i cellecyklus viste, at udtrykkene for cyclin A, D1 og CDK 2, 4 i HeLa-celler (fig. 2), cyclin D1, E og CDK 2, 4 i Caski og C33A celler (fig. 3), cyclin A, B1, E og CDK 2 i SW1990-celler (fig. 4) var betydeligt nedreguleret. Blokering bindingsstedet for cellecyklus gener til CREB ved OGN, en CRE attrap, forhindrede TCS-standset S, G1 og G2 /M cellecyklus i HeLa (fig. 5 A, B), Caski (fig. 6 A, B ) og SW1990 (fig. 7 A, B) celler. TCS medieret nedregulering af cyclin A, D1 i HeLa-celler (fig. 5 C, D), cyclin D1 i Caski-celler (fig. 6 C, D) og cyclin A i SW1990-celler (fig. 7 C, D) blev vendt ved en kombination af CRE og TCS.

Disse resultater bekræftet og udvidet vores tidligere rapporter, som viser, at TCS har en cytotoksisk virkning på cancerceller [3], [4], afsløret, og dels mekanismerne bag aktiveringen af CREB protein [5], [6]. Men det er ikke tidligere blevet rapporteret om TCS-medieret cellecyklusstandsning sker gennem en kombination af CRE og målgener. Nærværende undersøgelse viser, at CRE lokkedue OGN svækket faldet i udtrykkene for cyclin A og D1 følge af TCS behandling, og vendes cellecyklus anholdelser.

cellecyklus er tæt medieret gennem et komplekst netværk af positive og negativ celle-cyklus regulatoriske molekyler såsom CDK’er, CKIs og cycliner [15], [16]. Det er blevet rapporteret, at dannelsen af ​​aktivt cyclin D /CDK4 og cyklin E /CDK2-komplekser styrer progression gennem G1 fase (G1 /S overgang). Endvidere cyclin A binder til og aktiverer CDK2, fremme G1 /S og G2 /M cellecyklus overgange. I slutningen af ​​G2, cyklin B /CDK2 aktiveres, så træder i mitose [17]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at de faldt udtryk for cyclin A, D1 og CDK2, blev 4 forbandt S fasen i HeLa-celler (fig. 2). De dalende-udtryk for cyclin D, E og CDK2, 4 var relateret til G1-fasen i Caski og C33A celler (Fig. 3). De udtryk for cyklin A, B1 og CDK2 var signifikant nedreguleret i SW1990 celler, arresteret i G2 /M fase (fig. 4). Vi fandt også, at CDK2 blev signifikant reduceret i cellelinier. Dette resultat er i overensstemmelse med forestillingen om, at CDK2 har en distinkt og væsentlige funktion i pattedyrs cellecyklus-, og dets mutation eller inhibering forårsager en G1-fasen blok [18].

Aktiveringen af ​​gener, der bærer CRE rapporteres at forekomme ved phosphorylering CREB ved Ser 133 og binding til CRE konsensussekvenser i promotorregionen af ​​gener [19], [20]. CREB phosphorylering toppe i løbet af G1-S overgang og derefter gradvist aftager fra S-fasen til M fase [21]. Kombineret med vores tidligere rapporterede resultater [4] – [6], [9], er det logisk at hypotesen, at celleproliferation gener, der bærer CRE site, binder sig til CREB og påvirke dens fosforylering niveau og dermed forstyrre celledeling

CRE lokaliserer opstrøms af mRNA’et starter sites. Det har en central rolle i cyklin A [22], [23] og D1 [24], [25] udtryk via CREB aktivering [26] – [28]. En tidligere undersøgelse viste, at sammenslutningen af ​​CREB med vaccinia-relateret kinase 1 (VRK1) forekom i en celle-cyklus-afhængig måde fra slutningen af ​​G1 til S-fasen. Desuden VRK1 specifikt forbedret aktivitet CRE i cyklin D1 promotor ved at lette rekrutteringen af ​​phosphoryleret CREB til dette locus [29]. Giampuzzi et al fandt også, at en væsentlig forringelse af CREB protein binding til cyclin D1-promotoren førte til en dramatisk inhibering af cyclin D1 proteinekspression i lysyloxidase (LOX)-up-regulerede celler [30]. Dette fænomen blev også bekræftet i fibroblastceller [31], endometrie celler [32], INS celle [33], hepatocyt celle [34] og andre cellelinjer [21], [35], [36]. Derudover en række observationer foreslog cyclin A spiller en central rolle på S og G2 /M overgang i pattedyrsceller og denne rolle er i overensstemmelse med dens præferentielle associering med CDK2, i stedet af Cdc2, under S-fase [37], [38] . CRE blev bekræftet at være nødvendig for effektiv aktivering af cyclin A-promotoren i aorta glatte muskelceller [39], fibroblastceller [40] og humane embryonale carcinomceller [22]. Den foreliggende undersøgelse viser klart, at kombineret behandling af FKS og CRE svækkede aftager af cyklin A og D1 udtryk, og derved vende effekten af ​​FKS på cellecyklusstop. Derfor foreslår vi, at transskription faktor CREB er en af ​​de opstrøms regulatorer af FKS-induceret cellecyklusstop i kræftceller.

Konklusion

Vores resultater viser, for første gang, at TCS inducerer specifikke cellecyklus anholdelser i cancerceller ved at hæmme bindingen af ​​CREB til CRE om gener relateret til celleproliferation. Salg