PLoS ONE: opregulering af 91H Fremmer tumormetastaser og forudser dårlig prognose for patienter med kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Lang kodende RNA (lncRNAs) spiller udbredte roller i genregulering og cellulære processer. Imidlertid er de funktionelle roller lncRNAs i kolorektal cancer (CRC) endnu ikke godt belyst. Formålet med denne undersøgelse var at måle niveauerne af lncRNA 91H udtryk i CRC og vurdere dens kliniske betydning og biologiske roller i udviklingen og progressionen af ​​CRC.

Metoder

91H udtryk og kopi nummer variation (CNV) blev målt i 72 CRC tumorvæv og tilstødende normale væv ved real-time PCR. De biologiske roller 91H blev evalueret af MTT, scratch sår assay, migration og invasion analyser, og flowcytometri.

Resultater

91H var signifikant overudtrykt i kræft væv og CRC cellelinjer sammenlignet med tilstødende normalt væv og en normal human intestinal epitelcellelinje. Endvidere blev 91H overekspression tæt forbundet med fjernmetastaser og dårlig prognose hos patienter med CRC, undtagen for CNV af 91H. Multivariat analyse indikerede, at 91H ekspression var en uafhængig prognostisk indikator, samt fjernmetastase. Vores in vitro-data viste, at knockdown af 91H hæmmede proliferation, migration, og invasivitet af CRC celler.

Konklusioner

91H spillede en vigtig rolle i den molekylære ætiologi CRC og kan betragtes som en roman prognose indikator i patienter med CRC

Henvisning:. Deng Q, han B, Gao T, Pan Y, Sun H, Xu Y, et al. (2014) opregulering af 91H Fremmer tumormetastaser og forudser dårlig prognose for patienter med tyktarmskræft. PLoS ONE 9 (7): e103022. doi: 10,1371 /journal.pone.0103022

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA

Modtaget: April 15, 2014 Accepteret: 23 juni 2014; Udgivet: 24 Juli 2014

Copyright: © 2014 Deng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette projekt blev støttet af tilskud fra The National Nature Science Foundation of China, Nanjing Videnskab og Teknologi Udvalg Project ((nr 81.172.141, 81.200.401.) no.201108025), Nanjing Medical Technology Development Project (nr. ZKX11025), Nanjing Sundhed Young Talent Project, Jiangsu Provincial Key Medicinske Talents til SKW, Nanjing Medical Science og Teknik Development Foundation til YQP (Nr. QRX11255) og B.S.H. (Nr. QRX11254). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en almindelig årsag til kræft dødsfald i verden på grund af forsinket tumor præsentation og hurtig progression, med omkring 14,1 mio nye kræfttilfælde og 8,2 million kræftdødsfald i 2012 på verdensplan [1]. I økonomisk udviklingslandene, er CRC bliver mere udbredt, især i Kina [2]. Trods betydelige fremskridt i diagnosticering og behandling for CRC i de seneste år, den samlede 5-års overlevelse fortsat utilfredsstillende på grund af metastaser, der fører til dårlige resultater [3]. . Derfor, for at søge nye molekylære markører eller faktorer er nødvendigt og presserende for tidlig påvisning, før fjernmetastaser vises, og forudsige prognosen hos patienter med CRC

Nylige undersøgelser har afsløret, at lncRNAs, 200 nukleotider lange, leg en kritisk rolle ved cancerudvikling og progression. Trods mindre godt forståelse af lncRNAs sammenlignet med microRNA [3], [4], [5], akkumulerende beviser tyder på, at lncRNAs-medieret biologi kan inddrages i reguleringen af ​​forskellige cellulære processer, såsom cellevækst og apoptose, stamceller pluripotens og udvikling, meiotisk indrejse og telomer længde [6], [7], [8], [9], [10], [11]. Imidlertid ligner proteinkodende gener og micorRNAs, kan lncRNAs fungere som onkogener eller tumor suppression, og afvigende ekspression af dem var forbundet med carcinogenese. Høj udtryk for PVT-1-ekspression i ondartede væv blev betragtet som en selvstændig risikofaktor for samlet overlevelse af CRC patienter [12], og hotair, fungerer som et onkogen eller en tumor suppressor, blev impliceret i epigenetisk regulering for kræft [7], [13], der blev betragtet som en stærk prognose maker, der bidrog til at forudsige metastaser og patienternes overlevelse i primær brystcancer [7].

91H, H19 antisense-RNA, var en roman lncRNA, der var placeret på position H19 /IGF2 locus (tiltrædelse nummer NC_000011.9) med 119.329 kbs i længden. Den udskrift af 91H blev overudtrykt i human brystcancer, som var involveret i reguleringen af ​​IGF2 udtryk i trans [14]. Imidlertid har få studier undersøgt funktioner 91H i andre former for kræft hos mennesker, herunder CRC. At udforske de potentielle biologiske funktioner 91H i udviklingen og progressionen af ​​CRC, blev den aktuelle undersøgelse ved at undersøge udtryk mønster af 91H i CRC tumorvæv og tilstødende normale væv og undersøge de biologiske funktioner ved vurdering af invasiv, migration, og apoptose af CRC celler med 91H knockdown in vitro.

Materialer og metoder

Kliniske prøver og cellelinier

72 tumorvæv og matchede tilstødende normale væv blev opnået fra indskrevet CRC patienter, som gennemgik kirurgi på Nanjing First Hospital Affiliated til Nanjing Medical University, mellem 2011 og 2014. især tilstødende normale væv blev taget 5-10 cm væk fra tumorvæv. Alle prøver blev omgående frosset i flydende nitrogen efter kirurgi og opbevaret ved -80 ° C indtil DNA og RNA-ekstraktion. Ingen patienter fik kemoterapi eller strålebehandling med forudbestemte operation. Klinisk information af disse patienter blev opsamlet herunder alder, køn, tumor placering, TNM stadie, tumor kvalitet og microstellite ustabilitet (MSI) status som tidligere undersøgelse [15] rapporteret. De opfølgende perioder varierede fra 2 måneder til 3 år, med et gennemsnit på 26,6 måneder. Alle prøver blev opnået med patienternes skriftligt informeret samtykke og blev histologisk bekræftet. Den medicinske etiske udvalg af Nanjing First Hospital Affiliated til Nanjing Medical University godkendt undersøgelsen.

Cellelinjer HCT8, HT29, HCT116, SW620 (human tyktarmskræft cellelinjer) og FHC (normal human tarm epitel celle linje) blev opnået fra Shanghai Cell Collection, Chinese Academy of Sciences. Alle ovennævnte cellelinier blev opretholdt i DMEM (Hyclone, USA) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS; Hyclone) og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2

Extraction. totalt RNA og genomisk DNA, cDNA-syntese, og QRT-PCR

Total RNA og genomisk DNA (gDNA) blev ekstraheret fra væv og cellelinjer under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, CA) og EZNA Tissue DNA Kit (Omega, USA) efter fabrikanternes protokol separat. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af PrimeScript RT reagens kit med gDNA viskelæder (Takara, Kina) og blev anvendt til 91H ekspressionsniveauet analyse ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) med følgende primere: fremadrettet, 5′-GCTTGTCAGTAGAGTGCGCC-3; og omvendt, 5-CATCCAGTTGACCGAGCTTG-3. β-actin blev anvendt som en intern kontrol med de følgende sekvenser: forward, 5-CAAGATCATTGCTCCTCCTGA-3; omvendt: 5-AGTCCGCCTAGAAGCATTTG-3. De 2

-ΔΔCt metode blev udført for at beregne den relative mængde 91H sammenlignet med β-actin-ekspression. QRT-PCR blev udført ved hjælp af SYBR Premix Ex TagTM II (Takara, Kina) og ABI 7500 System (Applied Biosystems, USA).

Kopier nummer variation identifikation af 91H

Analyse af CNV for gDNA blev også udført ved QRT-PCR, som beskrevet ovenfor fremgangsmåde. RNase P blev anvendt som en reference-gen. Kopiantallet af 91H blev talt efter ligning 2 × 2

-ΔΔCT.

Transfektion af siRNA

RNA-interferens blev udført ved anvendelse af syntetiske siRNA-duplexer, som beskrevet af tidligere undersøgelser [ ,,,0],16], [17]. To syntetiske siRNA-duplexer (SI-91H: si91H1, 5′-GGCGUCAUUCUGAUGGGACTT-3 ‘og si91H2, 5’UUCAGGAGCUUAAGAUGCUTT-3′) svarende til 91H RNA-sekvenser og en negativ kontrol (si-NC, 5’-CGUGGGUGGAUGCAUGGAUTT-3 ‘) blev transficeret ind i HCT-116-celler med 400 pmol ved anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, CA) i 6-brønds plade. Efter 48 timer blev 91H ekspressionsniveauer undersøgt via QRT-PCR.

Celleproliferationsassay

efter transfektion i 48 timer som beskrevet ovenfor, inficeret HCT-116-celler blev efterfølgende høstet til celleproliferationsassay (MTT-assay) ved at følge fabrikantens protokol. Inficerede celler (1 x 10

4) blev udpladet i fladbundede 96-brønds plader suppleret med 100 pi DMEM per brønd. Efter inkubation i 6, 24, 48, 72 og 96 timer henholdsvis blev 10 pi MTT tilsat til hver brønd, derefter blev mediet fjernet efter 4 timers dyrkning og senere suppleret med 150 pi DMSO per brønd. Kolorimetrisk analyse blev udført på en mikropladelæser ved 490 nm bølgelængde. Hver undergruppe blev gentaget i fem brønde.

Migration og Invasion analyser

For migration assay, inficerede HCT-116-celler (1 x 10

5 i 200 ul serumfrit DMEM) , lige som beskrevet tidligere, blev podet i det øvre kammer af transwell plader i en 24-brønds format med 8 mm diameter (Corning Costar, USA). 600 pi DMEM indeholdende 5% FBS blev tilsat til bundkammeret som kemoattraktant. Efter 24 timers dyrkning blev cellerne fikseret med methanol og blev farvet med krystalviolet. Tilbageværende celler blev fjernet fra toppen af ​​den permeable membran med en vatpind. Derefter celler, som migrerede gennem det øvre kammer blev talt i fem tilfældige felter under et lysmikroskop, og den gennemsnitlige værdi af fem felter blev udtrykt.

I invasion assay blev de øverste kamre belagt med basalmembranen Matrigel (40 mg /ml, Becton-Dickinson, USA) ved 37 ° C i 30 minutter. Inficerede celler (3 x 10

5) med serumfrit DMEM blev tilsat til de øverste kamre, blev de nederste kamre fyldt med DMEM indeholdende 10% FBS. Efter 24 timers inkubation blev de celler, der invaderede bagsiden af ​​top kamre fikseret, farvet, og beregnes ved anvendelse af et lysmikroskop. Hver invasion assay blev udført i tre eller flere gentagelser.

Scratch sår assay

Seks brønde blev overtrukket med inficerede HCT-116-celler. Sår blev skabt i konfluente celler under anvendelse af en 10 pi pipettespids ved 48 timer efter transfektion. Efterfølgende frit flydende celler og debris blev fjernet ved anvendelse af PBS og FBS-frit medium blev tilsat. Derefter observerede vi sårheling ved forskellige tidsperioder og fotograferet repræsentative Skrab linjer ved hjælp af lysmikroskop. Hvert forsøg blev gentaget tre gange.

Apoptose analyse

Cell apoptose blev bestemt ved anvendelse af flowcytometri efter farvning med Annexin V-FITC og propidiumiodid (PI, BD Bioscience, CA). HCT-116-celler blev inficeret med si-91H eller si-NC i plade med 6 brønde. Apoptose blev analyseret efter 48 timer infektion. Alle apoptose analyser blev udført i tre eksemplarer.

Statistisk analyse

Optimale cut-off niveauer af 91H i kræft /noncancerous blev beregnet ved at anvende receiveren opererer karakteristik analyse (ROC) [18], [19]. Sammenligning af kontinuerlig data blev analyseret under anvendelse af en uafhængig

t

-test, og kategoriske data blev analyseret ved chi-square test. I mellemtiden blev overlevelsesrater beregnet af Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og Log-rank test. En Cox proportionel risiko model univariate og multivariate analyse blev udført for at fastslå virkningen af ​​91H udtryk og clinicopathologic parametre på samlet overlevelse (OS). Nomogram til OS blev etableret ved at anvende R-software. Harrell Concordance indeks (c-indeks) blev anvendt til at estimere den prædiktive nøjagtighed af det. Statistik med

P

-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Alle disse statistiske beregninger blev udført ved hjælp af IBM SPSS 20,0 software (IBM, USA), R 3.0.3 software (Institut for Statistik og matematik, Wien, Østrig), OriginLab 8.5.1 software (OriginLab Corp, Northampton, USA) og GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, USA).

Resultater

Sammenhæng mellem 91H relative udtryk og clinicopathologic faktorer i CRC

91H ekspressionsniveauerne blev bestemt ved QRT-PCR for 72 kræft og tilstødende noncancerous væv fra CRC patienter. 91H niveauer i kræft væv var naturligvis højere end i de noncancerous væv (

P

0,001; figur 1). ROC-kurve analyse viste, at de optimale afskæringsværdier for indholdet 91H ekspression var 2,86 gange til OS i kræft /noncancerous (figur 2). Så de 72 patienter med CRC blev opdelt i en høj 91H ekspression gruppe (n = 42), 91H ekspression forholdet ≥2.86 og en lav 91H ekspression gruppe (n = 30), 91H ekspression forholdet 2,86 (figur 3), ifølge afskæringen niveau. Clinicopathologic faktorer blev sammenlignet mellem to 91H udtryk grupper (tabel 1). 91H udtryk var signifikant korreleret med fjernmetastaser (

P

= 0,027). Imidlertid blev 91H udtryk næppe korreleret med patienternes køn, alder, tumor placering, TNM stadie, N scenen eller klasse. For yderligere at estimere sammenhængen mellem 91H ekspression og prognose af patienter med CRC, blev Kaplan-Meier overlevelsesanalyse og log-rank tests udført ved anvendelse af patienternes postoperative overlevelsestid. Resultaterne viste, at patienter med højt 91H udtryk havde en tydeligvis dårligere prognose end dem med lav 91H udtryk (

P

0,001, figur 4). Vejviser

Unvariate analyse af den samlede analyse afslørede, at 91H relative ekspression, TNM stadie, fjernt metastase eller grad var prognostiske indikatorer (tabel 2). Desuden 91H relative udtryk og fjernmetastaser var uafhængige prognostiske indikatorer for den samlede overlevelsesraten for patienter med CRC (HR: 3,66,

P

= 0,001; HR: 8,97,

P

0,001 ) henholdsvis multivariat analyse (tabel 2). Desuden blev prognostisk nomogram med clinicopathologic faktorer og 91H ekspression etableret for at forudsige sandsynligheden for, at patienter med CRC ville dø inden for 3 år af sin oprindelige kirurgi, antager patienter døde ikke af andre årsager først (figur 5). I mellemtiden blev nomogram er prædiktive nøjagtighed målt via en konkordans indeks (c-indeks). For CRC, nomogram indeholder 91H havde mere forudsigelig nøjagtighed end at uden 91H (c-indeks: 0,90 versus 0,85 henholdsvis)

DNA-kopi nummer variation (CNV) var ikke involveret i up-. regulering af 91H ekspression

for at bestemme om 91H ekspressionsniveau i CRC var forbundet med CNV, ekspressionsmønsteret for 91H blev målt ved QRT-PCR, og længere anslået overensstemmelsen mellem 91H DNA kopital og 91H relative ekspressionsniveau . Kun 2,8% (2/72) af parrede normale og tumorvæv med CNV viste overekspression af 91H. Men den afvigende ekspression af 91H blev registreret, i 95,8% (69/72) af parrede normale og tumorvæv uden kopi nummer ændring (figur 6).

A, The 91H relative udtryk i matchede ondartede og noncancerous væv blev målt ved QRT-PCR. β-actin blev betragtet som den interne kontrol. B, Kopiantallet variation af 91H i cancerøse og noncancerous væv blev også målt ved QRT-PCR. RNase P blev anvendt som reference gen.

91H forfremmet proliferation, invasion og migration af CRC celler in vitro

For at evaluere de biologiske funktioner af 91H, 91H ekspressionsniveauerne blev målt i en række forskellige cellelinjer (FHC, HCT-8, HT-29, HCT-116, og SW-620) ved QRT-PCR. Som vist i figur 7, blev 91H ekspression detekteret de højere niveauer i HCT-8, HT-29 og HCT-116 sammenlignet med FHC, bortset SW-620. Bagefter blev HCT-116-celler transficeret med si-91H eller si-NC. Efter transfektion i 48 timer blev 91H effektivt stumme i HCT-116-celler (figur 8).

Dernæst har forsøgt at bestemme, om 91H knockdown påvirket celleproliferation ved MTT-assayet. De data, sammenlignet med HCT-116 celler inficeret med si-NC, viste, at udbredelsen af ​​HCT-116 celler med si-91H var beboet til 36,7% (

P

0,05), 45,4% (

P

0,05), 43,2% (

P

0,05), 65,6% (

P

0,01) og 65,3% (

P

0,01) ved 6, 24, 48, 72 og 96 timer, henholdsvis (figur 9). Desuden blev induktionen af ​​apoptose efter 48 timers behandling med si-91H eller si-NC målt ved anvendelse af flowcytometri. HCT-116 celler med 91H knockdown ikke åbenbart vise apoptose sammenlignet med dem i kontrol (figur 10).

Efterfølgende at få adgang til effekterne af 91H undertrykkelse på HCT-116 celler motilitet, en ridse sår assay blev udført for at vurdere indvirkningen 91H knockdown på cellemotilitet. 91H undertrykkelse resulterede i svækkelse motilitet af HCT-116-celler. Især sammenlignet med inficerede celler med si-NC, såret restitution blev betydeligt forsinket i siRNA-inficerede celler (figur 11). Desuden blev migration og invasion analyser bruges til yderligere at få adgang til denne effekt 91H knockdown om migration og invasivitet af CRC celler. Resultaterne viste, at migration og invasionsevne blev hæmmet betydeligt i inficerede celler med si-91H, sammenlignet med si-NC-inficerede celler (figur 12). Desuden var HCT-116 cellemigration og invasion faldt med 49,4% (P 0,05) og 43,9% (P 0,05) henholdsvis efter 91H suppression (figur 13). Disse resultater viste, at 91H hæmning kan være tæt korreleret med proliferation, migration og invasion af CRC-cellelinjer.

Antallet af invasive eller vandrede celler for hver forsøgsgruppe blev regnet som gennemsnittet af 5 fem synsfelter under et mikroskop (*

P

0,05)

diskussion

Som en roman molekylær stjerne for lncRNA, akkumulerende undersøgelser har. fokuseret på virkningen af ​​lncRNA på kræft patogenese, og kunne give ny indsigt i biologi disse kræftformer [20], [21], [22]. Trods betydelige fremskridt i lncRNAs i kræft patogenese, biologiske roller lncRNAs er ikke klare i CRC. At udforske biologi lncRNA i CRC, blev denne undersøgelse udført for at først at undersøge de biologiske roller 91H i CRC progression og vurdere effekten af ​​91H på klinisk-patologiske karakteristika og prognose.

I denne undersøgelse data viste, at 91H ekspressionsniveauerne i CRC væv var væsentligt højere end i tilsvarende noncancerous væv. Resultatet blev identificeret in vitro med CRC cellelinjer og normalt humant intestinal epithelial cellelinie (figur 7). Desuden blev overekspression af 91H forbundet med fjernmetastaser af clinicopathologic faktorer (

P

0,05). 91H blev påvist at være stabil ekspression i brystcancercellelinier, og det blev observeret at være opreguleret hos patienter med primær brystcancer [14]. Mere vigtigt, i muse myoblaster, 91H var fast besluttet på at være impliceret i samregulering af gener ved H19 /IGF2 locus bidrager til carcinogenese og kræft progression [16]. Imidlertid blev 91H-ekspression ikke forbundet med fjernmetastaser af clinicopathologic faktorer i esophageal pladecellecarcinom (ESCC) [23]. De inkonsekvente konklusioner at knytte 91H udtryk med klinisk-patologiske faktorer kan skyldes forskellige histopatologiske typer. Desuden anvendelse af in vitro-data, viste vi, at 91H knockdown inhiberede cellemotilitet, migrering og invasivitet af CRC-celler. Disse resultater indikerede, at 91H kan spille en potentiel rolle for at fremme metastase af CRC.

Endvidere har vi beskrevet for det første bevis for, at høje 91H ekspressionsniveauer i tumorvæv var relateret med dårlig prognose, og 91H relative ekspressionsniveauer var intimt indbyrdes med dårlig klinisk resultat af patienter, hvilket indikerer ekspression af 91H kunne blive serveret som en værdifuld uafhængig prognostisk biomarkør uafhængig på større klinisk-patologiske karakteristika, med undtagelse af metastaser status. Faktisk tidligere undersøgelser indikerede, at lncRNAs også blev betragtet som molekylære biomarkører i cancere. PVT-1, genererer antiapoptotisk aktivitet i CRC, blev identificeret som en ny prognostisk indikator for CRC patienter [12], [24]. I mellemtiden var hotair involveret i tumor progression og blev betragtet som en ny epigenetisk molekylær biomarkør hos patienter med ESCC eller CRC [18], [25], [26]. Derfor mener vi, at 91H kan være en roman potentiel prognostisk indikator i patienter med CRC.

Generelt nomogrammer er udviklet i de fleste af cancertyper [27], [28], [29], som skaber en simpel grafisk repræsentation af en statistisk prædiktiv model, der genererer et numerisk sandsynlighed for en klinisk hændelse [30]. Endvidere evne nomogrammer at producere individualiserede forudsigelser muliggør deres anvendelse til identifikation og klassificering af patienter til deltagelse i kliniske forsøg [30]. I denne undersøgelse baseret på 91H relative ekspression i tumor og klinisk-patologiske faktorer, blev en prædiktiv nomogram udføres for at forudsige sandsynligheden for, at postoperative patienter ville dø af CRC inden 3 år, undtagen for at dø af en anden årsag først. I mellemtiden nomogram indeholder 91H havde mere forudsigelig nøjagtighed end at uden 91H (c-indeks: 0,90 versus 0,85 henholdsvis), hvilket indikerer, at 91H udtryk i tumor tydeligvis påvirket nomogram prædiktiv nøjagtighed. Vigtigere, kunne nomogram anvendes af læger til at identificere patienter ved at beregne deres sandsynlighed for postoperative patienter med CRC, og tilbyde relevant behandling og optimale strategi. Derfor bør patienter med overekspression af 91H nøje overvåges og modtaget passende adjuverende behandlinger efter CRC resektion.

overekspression af 91H var involveret i kræft progression [14], [23]. Men grunden 91H blev dysreguleret i tumor forblev ukendt. Kopiér nummer variation var en vigtig form for genomisk struktur ændring, der bidrager til visse genetiske og udviklingsmæssige sygdomme, herunder kræft i æggestokkene og brystkræft [31], [32]. H19 /IGF2 med kopi nummer variationer, som ligger på 11p15 påtrykt region, blev rapporteret i Beckwith-Wiedemann og Silver-Russell syndromer [33], [34]. I mellemtiden, 91H-gen, H19 antisense-RNA, blev også placeret i kromosomet 11p15.5 [14]. Derfor kunne det spekuleret, at overekspression af 91H i CRC kan være forbundet med CNV. I den foreliggende undersøgelse blev CNV af 91H observeret i to patienter med forhøjet 91H ekspression og kopiantal deletion af 91H blev forekom hos én patient med CRC (figur 2). Selv om resultatet ikke viste statistisk signifikant, det gav en potentiel ny strategi i efterforskningen 91H-medieret genregulering på kræft. På grund af den begrænsede størrelse af sager indskrevet i denne undersøgelse blev den yderligere undersøgelse har brug for i fremtiden at illustrere potentielle forhold.

Nogle begrænsninger af denne undersøgelse bør anerkendes. Det første er antallet af patienter med CRC var ikke store. Yderligere undersøgelser skal udføres for at kontrollere sammenhængen mellem 91H udtryk og CRC, og til at afgøre, om 91H udtryk var forbundet med CNV hos patienter med CRC. For det andet, de opfølgende perioder var ikke nok lang (interval, 2-36 måneder), som ikke præcist forudsige den samlede overlevelse CRC patienter. Yderligere undersøgelser blev foretaget for at validere dette resultat af langvarig opfølgning af patientens kohorte eller en anden kohorte af patienter med CRC. Endelig blev alle in vitro-assays for biologiske funktioner kun udføres i en enkelt cellelinie. På trods af de begrænsninger viste i denne undersøgelse, støttet disse resultater betydningen af ​​den rolle, 91H i forskellige stadier af kræft progression fremme metastase af CRC.

Sammenfattende 91H udtryk var signifikant opreguleret i CRC vævsprøver og cellelinier. Den forhøjede ekspression af 91H var forbundet med dårlig prognose og fjernt metastase. Desuden 91H CNV forklarede kun nogle få procent af observeret overekspression. Kumulativt, disse resultater viste, at 91H spillet en afgørende rolle i udviklingen og progressionen af ​​CRC. Ved at forstå den præcise rolle 91H i patogenesen af ​​CRC, en roman og lovende terapeutisk strategi ville blive udviklet til yderligere CRC behandling, baseret på nedregulering af disse onkogene lncRNAs.

Støtte oplysninger

figur S1 . .

Forholdet mellem eksemplar nummer variation og 91H udtryk i tumorvæv og tilstødende normale væv

doi: 10,1371 /journal.pone.0103022.s001

(TIF)

Figur S2.

91H relative udtryk blev kvantificeret i fire CRC cellelinjer og et normalt menneske tarm epitel cellelinje ved QRT-PCR (gennemsnit ± SEM; **

P

0,01)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s002

(TIF)

Figur S3.

HCT-116 celler blev transficeret med si-NC og si-91H. Efter 48 timer blev 91H udtryk effektivt hæmmet af QRT-PCR sammenlignet med si-NC (gennemsnit ± SEM; **

P

0,01)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022. S003

(TIF)

figur S4.

91H fremmet udbredelsen af ​​HCT-116 celler via MTT assay (gennemsnit ± SEM;

P

0,05)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s004

( TIF)

Figur S5.

Apoptose blev undersøgt ved hjælp af cytometrisk analyse ved 48 timer efter infektion med si-91H eller si-NC

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s005

(TIF)

Figur S6.

ridse sår analysen blev vurderet til celle motilitet. Den knockdown af 91H hæmmede HCT-116-celle motilitet

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s006

(TIF)

Figur S7.

91H fremmet invasion og migration af HCT-116 celler baseret på transwell assay

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s007

(TIF)

Figur S8.

Antallet af celler, som invaderede eller migreret gennem kammeret blev evalueret i 5 felter for hver forsøgsgruppe og gennemsnittet beregnes. Antallet af invasive eller vandrede celler for hver forsøgsgruppe blev regnet som gennemsnittet af 5 fem synsfelter under et mikroskop (*

P

0,05)

doi: 10,1371 /journal.pone.. 0103022.s008

(TIF)

tabel S1.

Patienternes oplysninger

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s009

(DOCX)

tabel S2.

Resultaterne af QRT-PCR for hver prøve

doi:. 10,1371 /journal.pone.0103022.s010

(XLSX)