PLoS ONE: patobiologiske Konsekvenser af ekspressionen af ​​EGFR, Pakt, NF-KB og MIC-1 i prostatakræft Stamceller og deres afkom

Abstrakt

progression af prostatakræft (pc’er) til lokalt invasive, androgen-uafhængige og metastatiske sygdomstilstande er generelt forbundet med behandling modstand og sygdom tilbagefald. Den foreliggende undersøgelse blev foretaget for at fastslå muligheden for at anvende en kombination af specifikke oncogene produkter, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), Pakt, nuklear faktor-kappaB (NF-KB) og makrofag-inhibitorisk cytokin-1 (MIC-1) som biomarkører og terapeutiske mål for at optimere behandlingen af ​​patienter med lokaliseret PC på tidligere stadier sygdom. De immunohistokemiske og immunofluorescens data har vist, at ekspressionsniveauerne af EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 og MIC-1-proteiner blev signifikant forøget i den samme delmængde af 76 tilfælde af prostataadenocarcinom prøver under deres sygdom og disse biomarkører blev udtrykt i en lille subpopulation af CD133

+ PC celler og hovedparten tumor masse af CD133

– PC celler. Vigtigere, blev alle disse biomarkører også overudtrykt i 80-100% af 30 PC metastase knogle vævsprøver. Desuden har resultaterne vist, at EGF-EGFR-signalvejen kan give kritiske funktioner for selvstændige fornyelse af side befolkning (SP) celler udstyret med stamceller celle-lignende funktioner fra meget invasive WPE1-NB26 celler. Af terapeutisk interesse, målretningen af ​​EGFR, Pakt, NF-KB eller MIC-1 var også effektiv til at undertrykke den basale og EGF-fremmet prostasphere dannelse af SP WPE1-NB26 celler, overtalelse opløsningen af ​​SP celle-afledt prostaspheres og faldende levedygtighed af SP og ikke-SP WPE1-NB26 cellefraktioner. Også målretningen af ​​disse onkogene produkter inducerede caspase-afhængig apoptose i kemoresistent SP WPE1-NB26-celler og forøget deres sensibilitet over for de cytotoksiske virkninger induceret af docetaxel. Disse resultater tyder på, at den kombinerede anvendelse af EGFR, Pakt, NF-KB og /eller MIC-1 kan repræsentere lovende strategier til at forbedre nøjagtigheden af ​​de nuværende diagnostiske og prognostiske metoder og effekten af ​​behandlinger af pc-patienter overvejer sygdommen heterogenitet, hvilket forhindrer PC progression til metastatiske og dødbringende sygdomstilstande

Henvisning:. Mimeault M, Johansson SL, Batra SK (2012) patobiologiske Konsekvenser af ekspressionen af ​​EGFR, Pakt, NF-KB og MIC-1 i prostatakræft Stamceller og deres descendenter. PLoS ONE 7 (2): e31919. doi: 10,1371 /journal.pone.0031919

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: December 24, 2011; Accepteret: 20 januar 2012; Publiceret: 23 feb 2012

Copyright: © 2012 Mimeault et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne af dette arbejde understøttes af National Institutes of Health tilskud (R01CA138791) for prostatakræft forskning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PC) er fortsat blandt de hyppigst diagnosticerede solide tumorer hos mænd og metastatiske PC former udgør stadig den næststørste årsag til kræft dødsfald [1] – [5]. Vigtige fremskridt i de senere år har ført til en tidligere diagnose og effektiv terapeutisk intervention ved radikal prostatektomi og /eller strålebehandling for patienter med lav kvalitet og orgel-begrænset pc’er [1], [4], [6], [7 ]. Sygdomsprogression til lokalt fremskreden, metastatisk og kastrationsresistent prostatakræft (CRPCs) er forbundet med behandling modstand og sygdom tilbagefald [1], [4], [6]. Selvom de nuværende anti-hormonelle og kemoterapeutiske regimer for meget invasive og metastatiske pc’er generelt har forbedret livskvaliteten, disse behandlinger er kun palliative og kulminerer i død fleste patienter efter ca. 12-19 måneder efter diagnosen [1], [4] [6].

der er udført talrige undersøgelser for at fastslå etiopathological årsager til pc’er. De ydre og indre faktorer før bortskaffelse til PC udvikling omfatter intens oxidativ stress, inflammatoriske atrofi og fibrose forbundet med alvorlige vævsskader, hormonelle deregulering og især med alderen [8] – [13]. Initiering og progression af PC er generelt kendetegnet ved en nedregulering af forskelligartede tumorsuppressorgen produkter, herunder phosphatase tensin homolog slettet på kromosom 10 (PTEN) og p53, kombineret med en opregulering af ekspressionen og /eller aktiviteten af ​​talrige onkogen signalering elementer i PC celler [4], [13], [14]. Samspillet af komplekse signalsystemer netværk af distinkte tumorigene veje initieret af hormoner, vækstfaktorer, cytokiner og kemokiner gennem deres beslægtede receptorer er typisk involveret i PC progression til lokal avanceret og metastatisk sygdom [4], [10], [11], [ ,,,0],13], [15]. Blandt de hyppige deregulerede genprodukter, kan den forstærkede ekspression og aktivering af forskellige receptortyrosinkinaser, herunder epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), i løbet af epitel-mesenkymale overgang proces føre til vedvarende aktivering af mitogenaktiverede proteinkinaser, phosphatidylinositol 3 ‘ -kinase (PI3K) /Akt, nuklear faktor kappa-B (NF-KB) og makrofag hæmmende cytokin-1 (MIC-1) [4], [13], [14], [16] – [32]. Disse onkogene produkter kan samarbejde for at fremme den vedvarende vækst, overlevelse, invasion og metastase af PC celler samt for deres køb af androgen-uafhængig (AI) og kemoterapi fænotyper, behandling modstand og recidiv [4], [13] – [ ,,,0],16], [18] – [21], [23], [25] – [27], [30] -. [39]

desuden seneste akkumulerende linjer af eksperimentelle beviser har også afsløret, at PC stamceller /progenitorceller, også betegnet som PC- og metastase-initierende celler, der udtrykker stamcellelignende markører, såsom CD133, CD44

høj, aldehyd dehydrogense “ALDH

høj” og /eller CXC kemokinreceptor 4 kan give kritiske funktioner i prostata carcinogenese, metastaser på fjerne steder og tumor genvækst og tilbagefald efter behandlingsstart [4], [10], [13], [14], [40] – [58]. Det er blevet vist, at meget tumorgene PC spindel /progenitorceller kunne give anledning

in vitro

in vivo

til hovedparten masse af differentierede PC celler udtrykker sekretoriske luminale fænotyper, herunder androgenreceptor og prostata-sur phosphatase og rekonstituere tumorerne

in vivo

med en histologisk arkitektur en Gleason grad sammenlignes med patientens oprindelige tumorer [13], [40] – [45], [47], [48] , [53]. Det er også blevet observeret, at PC stamceller /progenitorceller, herunder side befolkning (SP) isoleret fra PC celler ved hjælp Hoechst farvestof efflux teknik, som besidder en AI fænotype og udtrykker høje niveauer af ATP-bindende kassette (ABC) multidrug transportører sådanne som ABCG2, var også mere resistente end deres differentierede afkom og ikke-SP celler til de anti-hormonelle og kemoterapeutiske behandlinger [13], [14], [50] – [52], [59]. På trods af disse fremskridt er yderligere undersøgelser nødvendige for at validere distinkte molekylære biomarkører og terapeutiske mål i PC stamceller /stamceller og deres afkom, der kunne bruges i kombination for at optimere den terapeutiske styring af pc patienter på tidligere stadier sygdom.

denne undersøgelse blev foretaget for at bestemme den kliniske relevans af at bruge en kombination af flere deregulerede onkogene produkter, herunder EGFR, den phosphorylerede form af Akt, NF-

κ

B p65 og MIC-1 som molekylære biomarkører til forudsige risikoen for PC progression til fremskreden tumor og terapeutiske mål at udrydde den samlede PC cellemassen. Derfor den immunhistokemiske analyser af ekspressionsniveauerne og co-lokalisering mønstre af disse proteiner blev foretaget på det samme panel af pc væv og sammenlignet med ikke-maligne tilstødende væv og normale prostata vævsprøver. Endvidere blev prostasphere-dannende og -disintegration assays og levedygtighed tests med SP celler udstyret med stamceller celle-lignende egenskaber og den ikke-SP celle fraktion fra den meget tumorgene og invasive WPE1-NB26 cellelinje udføres med eller uden exogen EGF i fravær eller nærvær af de specifikke inhiberende midler ifølge disse onkogene produkter. Samlet set har resultaterne støttet fordelene ved at kombinere disse onkogene produkter som molekylære biomarkører og terapeutiske mål for at forbedre nøjagtigheden af ​​diagnostiske og prognostiske metoder og effekten af ​​behandlinger af PC patienter på tidligere stadier sygdom.

Materialer og metoder

Materialer

Den menneskelige WPE1-NB26 cellelinje blev oprindeligt opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). De parentale WPE1-NB26-celler blev rutinemæssigt opretholdt i keratinocyt serumfrit medium (SFM) suppleret med antibiotika (100 UI /ml penicillin-100 pg /ml streptomycin), L-glutamin, ekstrakt fra bovin hypofyse og epidermal vækstfaktor (EGF) ifølge til producentens anvisninger i en 37 ° C inkubator leveres med 5% CO

2. Keratinocyt-SFM, MitoTracker Red CMXRos farvestof og alle andre kultur materialer var fra Life Technologies (Carlsbad, CA). Docetaxel, partenolide, Akt inhibitor VIII, og 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), LY294002 fra Calbiochem Corp (San Diego, CA) og gefitinib kom fra LC laboratorium (Woburn, MA). Kanin polyklonalt anti-CD133-antistof (H-284), monoklonalt muse-anti-CD44 (HCAM, F-4) antistof, kanin-polyklonalt anti-ABCG2 antistof (B-25), kanin polyklonalt anti-EGFR-antistof (1005), ged polyklonalt anti-Tyr

1173-phospho-EGFR-antistof (1173) anerkendelse EGFR formular phosphoryleret ved tyrosin 1173 og kanin polyklonalt anti-NF-KB p65 protein-underenhed (C-20) blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Musen monoklonalt anti-β-actin-antistof (klon AC-15) blev leveret af Sigma-Aldrich (St.-Louis, MO, USA) og kanin monoklonale anti-Ser

473-Pakt antistof (D9E) fra Cell Signaling Technology, Inc. kaninen polyklonale antistof rettet mod den spaltede caspase-9-fragment blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) og muse monoklonale anti-cytochrom

c

(6H2) antistof fra Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA). Kanin polyklonalt anti-MIC-1-antistof blev genereret i vores laboratorium mod det C-terminale aminosyre region af det modne MIC-1-proteinet som beskrevet tidligere [27], [29]. Den phycoerythrin-konjugeret monoklonalt anti-CD133 /2-antistof (293C3) blev indkøbt fra Miltenyi Biotec. Inc. og anvendes ifølge producentens anvisninger. Den Vectastain avidin-biotin kompleks “ABC” metode peroxidase kit og 3,3′-diaminobenzidin “DAB” substrat kit til immunhistokemisk farvning blev indkøbt fra Vector Laboratories (Burlingame, CA).

Immunohistokemisk og dobbelt-immunohistofluorescence analyser

Immunohistokemiske undersøgelser af ekspressionsniveauerne og cellulære lokalisering af EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 og MIC-1-proteiner i ikke-maligne og maligne prostata væv blev udført på prostatavæv microarrays fremstillet af formalin-fikserede og paraffin-indlejrede væv købt fra Biomax Inc. (Rockville, Maryland, USA) som tidligere beskrevet. De analyserede vævsprøver omfatter PR954 væv microarray slide indeholder dublerede kerner fra 36 tilfælde af patienter med primær prostata adenocarcinom (Gleason scorer: 6-10; iscenesætter T2-T4) og tilsvarende matchede ikke-maligne tilstødende væv fra de samme patienter, og PR483 væv microarray slide indeholdende en kerne fra 40 tilfælde af patienter med primær prostata adenocarcinom (Gleason scorer: 6-10; iscenesætter T2-T4) og 8 normale prostata væv fra obduktion anvendt som kontroller. Endvidere blev ekspressionen af ​​alle biomarkører også analyseret i 30 knoglemetastaser væv fra PC patienter (Gleason scorer: 6-10) (TriStar Technology Group, LLC, USA). Den anvendte teknik til immunohistostaining er tidligere blevet beskrevet [36], [38], [52]. Kort fortalt blev vævssnittene deparaffineret med EZ-afvoksning ™ (Bio Genex, San Ramon, CA) og rehydreret under anvendelse graduerede ethanolopløsninger. Efter vask af objektglassene 3 gange med phosphatbuffer saltvand (PBS) i 5 minutter, blev vævssnit nedsænket i mikrobølgeovn antigen-genvinding opløsning bestående af 0,01 M citratpuffer pH 6,0 og underkastet mikrobølgebestråling 3 gange i 3 min. Den uspecifikke immunfarvning blev blokeret i fortyndet Vectastain normalt hesteserum (Vector “ABC” kittet) i 10 minutter og objektglassene blev derefter inkuberet med primære anti-EGFR, -Ser

473-Pakt, -NF-KB p65-protein-underenhed eller -MIC-1-antistof i et fugtigt kammer natten over ved 4 ° C. Efter vask med PBS blev objektglassene inkuberet med biotinyleret universal sekundært antistof i 30 minutter og vaskes igen med PBS. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved anvendelse af 0,3% hydrogenperoxid i methanol:PBS (01:01) i 10 min. Efter yderligere vask blev objektglassene inkuberet med ABC Vectastain opløsning i 30 minutter. Vævssnittene blev nedsænket i en farvningsopløsning indeholdende 3,3′-diaminobenzidin “DAB” substrat som anført i fabrikantens anvisninger og skyllet 3 gange i vand. En rødbrun farve bundfald observeret på vævssnit indikerer en positiv immunreaktivitet med den testede primære antistof. Objektglassene blev modfarvet med hematoxylin, dehydreret og monteret permanent med vectamount permanent montering medier (Vector Laboratories). Billeder, der blev fanget på et Nikon Eclipse E400 lysmikroskop (Nikon Corporation, Tokyo, Japan) ved forskellige forstørrelser er repræsentative analyserede prøver.

I hvert væv sektion, intensiteten af ​​immunoreaktivitet for EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 eller MIC-1-protein blev semikvantitativt sorteres efter en urologiske patolog (Dr. Johansson) på en 0 til +3 skala (0 = ingen farvning, 1+ = uge farvning, 2+ = moderat farvning, og 3+ = stærk farvning). Procentdelen af ​​PC celler positivt for hver biomarkør analyseres inden et givet væv kerne blev også bedømt på en 1 til 4 skala (1 = 0-25% positive PC celler, 2 = 26-50% positive celler, 3 = 51-75% positive celler, og 4 = 76-100% positive celler). Score af farvningsintensitet og procentdelen af ​​immunoreaktive PC celler blev derefter multipliceret til opnåelse af en sammensat score i området fra 0 til 12. farvningsintensitet forskellige testede proteiner i prostataadenokarcinom prøver blev scoret og sammenlignet med de normale prostatavæv, og værdi blev betragtet større, hvis farvningsintensitet var højere med et eller flere punkter.

Desuden dobbelt-immunohistofluorescence analyser af co-lokalisering af stamcelle-lignende markering, CD133 antigen (prominin-1) med phosphoryleret EGFR eller dens aktiverede Tyr

1173p-EGFR phosphorylerede form, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 eller MIC-1 blev også udført på afparaffinerede og rehydrerede ikke-maligne og maligne humane prostata vævsprøver fra patienter opnået fra UNMC væv bank som tidligere rapporteret [52], [60]. De væv Objektglassene blev blokeret i nærvær af 10% gedeserum i 30 minutter efterfulgt af inkubering med phycoerythrin-konjugeret anti-CD133-antistof plus anti-EGFR, anti-Tyr

1173-pEGFR, anti-Ser

473 -pAkt, anti-NF-

κ

B p65 eller anti-MIC-1-antistof i 2 timer. Objektglassene blev vasket to gange med PBS og behandles til immunfluorescerende detektion som beskrevet nedenfor for det konfokale mikroskopiske analyser af fikserede celler.

Isolering af SP og ikke-SP cellefraktioner og CD133

+ PC cellesubpopulation fra human tumorigene og invasive WPE1-NB26 cellelinie ved flowcytometri

parentale WPE1-NB26 celler (1 × 10

6 celler /ml) blev farvet med Hoechst puffer indeholdende en slutkoncentration på 2 ug /ml fluorescerende Hoechst farvestof ved 37 ° C i 2 timer. De små subpopulationer af SP og ikke-SP-celler blev isoleret ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) som tidligere beskrevet [52], [60], [61]. Analyserne og sortering af levedygtige SP og ikke-SP cellefraktioner blev udført under anvendelse af en FACS Aria flowcytometer med en DIVA software (Becton Dickinson Biosciences). SP og ikke-SP cellefraktioner blev opsamlet efter FACS og ekspressionsniveauet af CD133 stamcelle-lignende markør uden tilsyneladende yderligere fænotypiske og differentieringsfaktorer ændringer i disse to dyrket celle subpopulationer blev opnået ved at opretholde cellerne i serumfrit keratinocyt dyrkningsmedium indeholdende eksogent EGF (10 ng /ml), inden de anvendes.

immunoblotanalyser

SP og ikke-SP cellelysater blev fremstillet som tidligere beskrevet [36], [38], [60 ]. Proteinkoncentrationerne blev estimeret ved anvendelse af et detergent-kompatible proteinassaykit fra Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Prøverne svarer til 20 ug proteiner blev opløst ved elektroforese på en 8 eller 10% SDS-polyacrylamidgel under reducerende betingelser. Proteinerne blev overført til en Immobilon-P transfer membran og blokeret i 5% fedtfri tørmælk i PBS i 2 timer og underkastet standard immunpåvisning procedure. Ved slutningen af ​​inkubationen blev blottet vasket i TBST (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCI og 0,05% Tween) og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) i 1 time . Antistof-antigen komplekser blev visualiseret ved hjælp af forøget kemiluminescens (Amersham Biosciences).

Konfokal mikroskopi analyser

SP og ikke-SP celle fraktioner fra WPE1-NB26 cellelinje blev dyrket på et lavt densitet på steriliseret dækglas i 24 timer, vaskes med PBS, og rettet i iskold methanol ved -20 ° C i 2 min [36], [38], [52]. Cellerne blev blokeret i 10% gedeserum i 30 minutter og inkuberet med phycoerythrin-konjugeret monoklonalt anti-CD133 /2-antistof (293C3), monoklonalt muse-anti-CD44 (HCAM, F-4) antistof, kanin-polyklonalt anti-ABCG2 antistof ( B-25), kanin polyklonalt anti-EGFR-antistof (1105), gede polyklonalt anti-Tyr

1173-pEGFR antistof (1173), kanin-monoklonalt anti-Pakt antistof (D9E), kanin polyklonalt anti-NF-KB-antistof ( C-20), kanin polyklonalt anti-MIC-1-antistof eller muse monoklonalt anti-β-actin-antistof (klon AC-15) fortyndet i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre gange vask med PBS blev cellerne derefter inkuberet med fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret gede-anti-muse FITC-konjugeret æsel-anti-ged og /eller Texas red-konjugeret gede-anti-kanin sekundært antistof (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc ., West Grove, PA) i 1 time. Desuden blev SP-celler behandlet med forskellige cytotoksiske midler i 4 dage farvet med MitoTracker Red CMXRos i befugtet kammer ved 37 ° C i mørke i 30 minutter forud for fiksering og farvning af SP-celler med monoklonalt muse-anti-cytochrom c-antistof i 1 time efterfulgt af en inkubation med FITC-konjugeret gede-anti-muse i 1 time. Derefter blev alle PC celler vasket igen med PBS, kerner modfarvet med diamidino-2-phenylindol (DAPI) og monteret på objektglas i anti-fade Vestashield monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Immunofluorescens-farvning blev observeret under et konfokalt laserscanningsmikroskop (LSM 410, Zeiss, Gottingen, Tyskland).

Prostasphere-dannende og disintegration assays Salg

SP og ikke-SP cellefraktioner isoleret fra stærkt tumorigene og invasive WPE1-NB26 cellemasse blev holdt i serumfrit keratinocyt dyrkningsmedium. Selvfornyelse kapacitet af SP-celler

versus

den ikke-SP cellefraktion isoleret fra stærkt tumorigene og invasive WPE1-NB26 cellelinien blev estimeret ved deres evne til at danne de ikke-adhærente aggregater udpeget som prostaspheres i serum -fri dyrkningsbetingelser under ultralav vedhæftet plade (Corning, Invitrogen). For prostasphere-dannende assays, opnået 500 levedygtige SP eller ikke-SP-celler efter celle sortering blev suspenderet i serumfrit-keratinocyt medium uden eller med eksogent EGF (10 ng /ml) på en 6-brønds ultralav fastgørelsesplade i fravær eller nærvær af forskellige lægemidler. De afprøvede lægemidler omfatter en specifik hæmmende middel af EGFR (gefitinib), PI3K (LY294002), Pakt (Pakt hæmmer VIII), NF-KB (partenolide) og MIC-1 (anti-MIC-1 antistof) samt den nuværende kemoterapeutiske drug docetaxel. Alle prøver blev udpladet i tre eksemplarer. Efter 7 dages inkubation blev antallet af prostaspheres dannede blev talt og de repræsentative billeder af SP WPE1-NB26 celle-afledte prostaspheres fotograferet ved hjælp af Accu-scope fasekontrastmikroskop ved en forstørrelse på 200 ×.

Desuden desintegrationen assays, blev 500 levedygtige SP WPE1-NB26-celler dyrket i serumfrie dyrkningsbetingelser under en ultralav fastgørelsesplade i 7 dage til dannelse af prostaspheres og derefter de testede lægemidler blev tilsat til dyrkningsmedium og inkuberes 4 ekstra dage. På dag 11 blev de repræsentative billeder af sønderdelte prostaspheres fotograferet ved hjælp af Accu-scope fasekontrastmikroskop ved en forstørrelse på 200 ×.

TUNEL assay

Terminalen deoxynucleotidedyl transferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) assay blev udført for at påvise DNA-fragmentering indikerer apoptotisk celledød induceret af testede cytotoksiske midler på SP WPE1-NB26 cellesubpopulation. Efter vaskning af faste SP WPE1-NB26 celler med PBS blev cellerne inkuberet i reaktionsblandingen TdT bestående af nukleotid-mærkning mix (TUNEL Label) indeholder fluorescein-dUTP og -dNTPs plus TdT enzym (Roche Diagnostics, IN) i fugtigt kammer ved 37 ° C i mørke i 1 time. SP-celler blev vasket tre gange i PBS og inkuberet med et primært antistof rettet mod det spaltede capsase-9-fragment i 1 time ved stuetemperatur, efterfulgt af en inkubation med FTIC-konjugat sekundært antistof i 1 time. Efter tre skylninger med PBS blev cellerne kontrastfarvet med DAPI for nuklear pletten og visualiseres ved konfokal fluorescens mikroskopi som ovenfor nævnt.

Cell levedygtighed analyser

For cellelevedygtighedsassays, SP og ikke-SP cellefraktioner isoleret fra WPE1-NB26 cellelinje blev podet på plader med 96 brønde ved en densitet på 3 × 10

4 celler per brønd i et samlet volumen på 200 pi frit serum keratinocytkultur medium som tidligere nævnt [36] , [38], [52]. Efter 3 dage, SP og ikke-SP WPE1-NB26 celler blev ubehandlet eller behandlet med forskellige koncentrationer af testede lægemidler, herunder gefitinib, LY294002, Pakt inhibitor VIII, partenolide, anti-MIC-1-antistof eller docetaxel, alene eller i kombination. Efter 72 timers inkubation blev cellelevedygtigheden estimeret ved en MTT kolorimetrisk test.

flowcytofluorimetrisk analyser

SP WPE1-NB26-celler blev dyrket ved en densitet på 5 x 10

5 celler på 25 cm

2 retter, som tidligere beskrevet. SP-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af testede lægemidler, alene eller i kombination med 5 nM docetaxel i fire dage. Den apoptotiske virkning induceret af testede agenter på SP WPE1-NB26-celler blev estimeret efter DNA-farvning af hver prøve med propidiumiodid ved FACS analyser som beskrevet tidligere [36], [38], [52].

statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student s

t

-test til at sammenligne resultaterne med

P

værdier 0,05 angiver statistisk signifikante forskelle. Mere specifikt blev immunohistokemiske data analyseres ved hjælp af Windows-version 9.6.4.0. software. De sammensatte snesevis af biomarkør udtryk blev betragtet som kontinuerlig variable og sammenlignet ved hjælp af Students tosidet t-test antager ulige varians for uafhængige stikprøver.

Resultater

immunhistokemisk analyser af ekspressionsniveauer af EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB-p65 og MIC-1 signalering elementer i ikke-maligne og maligne prostata vævsprøver

resultaterne fra immunhistokemiske analyser har indikeret en meget svag til målbart immunfarvning for EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 og MIC-1 i normale prostatavæv af biopsi og tilstødende ikke-maligne prostatavæv fra PC patienter (figur 1). I modsætning hertil blev en forbedret udtryk for alle disse biomarkører påvist i 66-75% af de 76 tilfælde af prostata adenokarcinomer (Gleason score = 6-10) analyseret

versus

normale prostata væv og associeret med etaperne ( T2-T4) af sygdomsprogression (tabel 1). Nærmere bestemt blev en svag cytoplasmatisk og membran immunfarvning for EGFR protein påvist kun i et lille antal basal og luminale prostataepitelceller i ikke-maligne prostatavæv mens dets ekspression varierede fra moderat til stærk i cytoplasmaet og på membranen henholdsvis i de maligne epitelceller lokaliseret i de mellemliggende og luminale rum i en undergruppe af primære prostataadenocarcinom prøver (figur 1A). Farvningsintensiteten forbundet med EGFR-protein-ekspression blev forøget i 68% af 76 tilfælde af primære prostataadenocarcinom prøver analyseres, i forhold til den normale prostatavæv fra biopsi (tabel 1). Desuden sammensat score opnået for EGFR i PC prøver (3,4 ± 0,4) var signifikant bedre end værdien for normale prostatavæv (0,4 ± 0,2); * P 0,0001) (figur 2a). Som vist i figur 1 b og c, den aktiverede Ser

473-Pakt phosphorylerede form blev også overudtrykt i 66% af 76 tilfælde af den prostatiske adenocarcinomer analyseres og påvises i cytoplasmaet i PC epitelceller hvorimod en forøget ekspression af p65-underenhed NF-KB-transkriptionsfaktoren forekom hos 75% af 76 tilfælde af prostata adenocarcinomer og er hovedsagelig påvist i cytoplasma og kerner af PC epitelceller. De sammensatte score opnået for Ser

473-Pakt og NF-kB p65-ekspression i PC prøver (3,3 ± 0,4 og 2,7 ± 0,3) var signifikant forbedret i forhold til den værdi for normale prostata væv (0,3 ± 0,1 og 0,3 ± 0,2; p 0,0001), henholdsvis (figur 2b og c). Derudover blev en stærkere positiv immunfarvning også ses for MIC-1-protein i cytoplasmaet og nær membranen i PC epitelceller samt for secerneret MIC-1 i tumor stroma i 71% af 76 tilfælde af prostata adenocarcinomer sammenlignet med normale og tilstødende ikke-maligne prostata væv analyseret (figur 1d). Det sammensatte score opnået for MIC-1-ekspression i PC prøver (. 3.7 ± 0,4) blev signifikant forøget i forhold til værdien for normale prostatavæv (0,4 ± 0,3; * p 0,0001) (figur 2D). Vigtigere, har resultaterne også vist, at Ser

473-Pakt, NF-KB-p65 og MIC-1 blev co-udtrykt med EGFR i samme delmængde svarer på omkring 54-62% af pc vævsprøver analyseret tyder på, at disse onkogene signaling elementer kan alle samarbejder om at fremme den maligne transformation af PC epitelceller under sygdomsprogression til en lokalt fremskreden sygdom tilstand (tabel 1).

Microarray sektioner af ikke-maligne og maligne prostata vævsprøver blev probet med et anti -EGFR, -Ser

473-Pakt, -NF-KB p65 eller -MIC-1 antistof efter blokering med serum. Alle snit blev undersøgt under et mikroskop og immunoreaktiviteten blev bedømt ved mørkebrun farvning. Repræsentative billeder af farvede vævsprøver af normal prostata, ikke maligne tilstødende væv af prostata tumor og prostataadenocarcinom opnået for (a) EGFR, (b) Ser

473-Pakt, (c) NF-KB p65 og (d) MIC-1 er vist ved originale forstørrelser af × 100 og × 400. Pilene angiver lokaliseringen af ​​basale celler i normal og ikke-malign prostata epitel og immunfarvning detekteret for disse biomarkører i prostataadenocarcinom vævsprøve. Desuden positive immunfarvning detekteret for secerneret MIC-1-protein i det stromale rum støder op til prostatatumorvæv er også angivet.

Kassegrafer viser ekspressionsniveauerne af (a) EGFR, (b) Ser

473-Pakt, (c) NF-KB-p65 og (d) MIC-1 under PC progression til metastatiske stadier sygdom. *,

P

0,0001, indikerer en betydelig stigning mellem de sammensatte score opnået for prostata-adenocarcinom og PC knoglemetastaser prøver i forhold til sammensatte scoringer opnået for normale prostata væv

Vigtigere, en positiv immunfarvning varierende fra moderat til stærk, inden cytoplasmaet og nær membranen eller i kerner blev også påvist for EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 og MIC-1 i PC celler i 80 -100% af knoglemetastaser analyserede væv fra 30 PC patienter (Gleason scorer = 6-10) (figur 3; tabel 1). Endvidere MIC-1-immunfarvning varierede fra meget svag til moderat intensitet blev set i stroma af pc knoglemetastaser væv (figur 3d). De sammensatte score opnået for ekspression af alle disse biomarkører i knoglemetastaser væv fra PC patienter var også bedre end de observerede for normale prostata væv og prostata adenocarcinom speciments værdier (Figur 2; * p 0,0001)

. microarray sektioner af PC knoglemetastaser vævsprøver blev undersøgt med anti-EGFR, -Ser

473-Pakt, -NF-KB p65 eller -MIC-1 antistof efter blokering med serum. Alle snit blev undersøgt under et mikroskop og immunoreaktiviteten blev bedømt ved mørkebrun farvning. Repræsentative billeder af farvede PC knogle vævsprøver opnået for EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 eller MIC-1 er vist ved originale forstørrelser af × 100 og × 400.

Dobbelt immunohistofluorescence konfokal mikroskopi analyser af ekspressionsniveauet af CD133 stamcelle-lignende markør og dens co-lokalisering med EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 og MIC-1 signalering elementer i ikke-maligne og maligne prostata væv prøver

for at opnå eksperimentel evidens af den potentielle konsekvenser af den forøgede ekspression og /eller aktivering af EGFR, Pakt, NF-KB-p65 og MIC-1 i den maligne transformation af CD133

+ voksen prostata stængel /stamceller til CD133

+ PC stamceller /stamceller, har vi også karakteriseret co-lokalisering af CD133 stamcelle-lignende markør med disse onkogene signalering elementer i ikke-maligne og maligne prostata væv fra patienter (figur 4) .