PLoS ONE: Identifikation af MicroRNA-21 som biomarkør for kemoresistens og Klinisk Outcome Efter adjuverende behandling i resektable Bugspytkirtelkræft Cancer

Abstrakt

Baggrund

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) har en dystre prognose . Den høje risiko for tilbagefald efter kirurgisk resektion giver rationalet for adjuverende behandling. Men kun en delmængde af patienter gavn af adjuverende behandling. Identifikation af molekylære markører til at forudsige behandlingsresultater derfor berettiget. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om udtryk for nye kandidat biomarkører, herunder microRNA, kan forudsige klinisk resultat i PDAC patienter behandlet med adjuverende behandling.

Metode /vigtigste resultater

formalin-fikseret paraffin indlejrede prøver fra en kohorte af 82 reseceret koreanske PDAC sager blev analyseret for protein ekspression ved immunohistokemi og for microRNA ekspression under anvendelse af kvantitativ realtids-PCR. Cox proportionel risiko modelanalyse i undergruppen af ​​patienter behandlet med adjuverende behandling (N = 52) viste, at mindre end median miR-21-ekspression var forbundet med en signifikant lavere hazard ratio (HR) for død (HR = 0,316; 95% CI = 0,166-0,600; P = 0,0004) og tilbagefald (HR = 0,521; 95% CI = 0,280-0,967; P = 0,04). MIR-21 udtryk status opstået som den mest prædiktive biomarkør for behandlingsresultatet blandt alle 27 biologiske og 9 klinisk-patologiske faktorer evalueret. Ikke signifikant sammenhæng blev påvist i patienter, der ikke er behandlet med adjuverende behandling. I en uafhængig validering kohorte af 45 frosne PDAC væv fra italienske sager, alle behandlet med adjuverende behandling, lavere end median miR-21-ekspression blev bekræftet at være korreleret med længere samlet samt sygdomsfri overlevelse. Desuden transfektion med anti-miR-21 forbedret kemosensitivitet af PDAC celler.

Konklusioner Betydningen

Lav miR-21-ekspression var forbundet med gavn af adjuverende behandling i to uafhængige grupper af PDAC sager, og anti-miR-21 øget anticancer narkotika aktivitet

in vitro

. Disse data giver belæg for, at miR-21 kan tillade lagdeling for adjuverende behandling, og repræsenterer en ny potentielt mål for terapi i PDAC

Henvisning:. Hwang JH, Voortman J, Giovannetti E, Steinberg SM, Leon LG, Kim YT et al. (2010) Identifikation af MicroRNA-21 som biomarkør for kemoresistens og Klinisk Outcome Efter adjuverende behandling i resektable kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 5 (5): e10630. doi: 10,1371 /journal.pone.0010630

Redaktør: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Tyskland

Modtaget: Januar 23, 2010; Accepteret: 20. april 2010. I Udgivet: 14 maj, 2010

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. I del finansieret af National Institutes of Health, National Cancer Institute intramuralt program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft dødsfald og over de seneste årtier er blevet observeret en lille forbedring i overlevelse på trods af en omfattende forskningsindsats [1]. Omkring 95% af eksokrine pancreascancer er pancreas ductusceller adenocarcinomer (PDAC), hvoraf forekomsten er steget støt gennem de seneste årtier [1], [2]. Kirurgi er muligt i 15-20% af patienterne, men selv efter fuldstændig resektion, prognose stadig dystre, med en 5-års overlevelse halter på 10-20% [3].

Kræft i bugspytkirtlen er notorisk resistent over for kemoterapi og strålebehandling. Adjuverende behandling er beskedent effektiv og kan have betydelige toksiciteter. Derfor er stadig uklart, hvilken rolle adjuverende behandling i resektable bugspytkirtelkræft, selvom generelt menes at gavne en undergruppe af patienter [4], [5]. At være i stand til at identificere denne delmængde ville være et stort fremskridt i forvaltningen af ​​denne sygdom, da det ville tillade patienten lagdeling til adjuverende behandling [6]. Derfor er et presserende behov prædiktive markører for følsomhed over for adjuverende behandling samt nye terapeutiske mål i denne sygdom [7], [8].

Altered udtryk af flere faktorer har været forbundet med PDAC aggressiv adfærd og prognose. For eksempel, blandt alle kræftformer, PDAC har den højeste hyppighed af

K-Ras

mutationer, hvilket har ført til spekulationer om dens anvendelse som et diagnostisk samt en prognostisk markør [7]. Proteinproduktet af

K-Ras

er et GTP-bindende protein medierer en række kritiske cellulære funktioner, herunder proliferation, celleoverlevelse og motilitet. Men de fleste af beviser hidtil antyder, at

K-ras

mutationer er ikke signifikant associeret med overlevelse i bugspytkirtlen kræftpatienter [9], [10]. Andre undersøgelser antydet den prognostiske betydning af ændret ekspression af proteiner involveret i Ras-signalvejen, såsom Akt. Ikke desto mindre blev phosphorylerede Akt ekspressionsniveauerne forbundet med både kortere og længere overlevelse i resektable PDAC patienter [11], [12]. Andre markører rapporteret som uafhængige prædiktorer for PDAC prognose indbefatter p16, matrixmetalloproteinase 7 (MMP-7) og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) ekspression [13]. Alligevel er mange biologiske aspekter vedrørende denne sygdom stadig dårligt forstået, og ingen enkelt markør har vist sig at præcist at forudsige det kliniske resultat.

I de seneste år er det blevet klart, at proteinekspression også kan reguleres ved microRNA (miRNA ) [14]. MikroRNA’er er en klasse af små ikke-kodende RNA’er der interagerer med mRNA’erne af kodende gener til at rette deres posttranskriptionel undertrykkelse [15]. MicroRNA er blevet vist at være involveret i onkogenese og tumorvækst, og også at spille en vigtig rolle i kemoresistens [16] – [19]

Endvidere ekspressionen af ​​microRNA er vævsspecifik, og visse cancerformer histotypes. kan klassificeres på grundlag af microRNA udtryk profiler [20], [21]. I kræft i bugspytkirtlen, er der rapporteret flere miRNA skal udtrykkes afvigende, herunder microRNA med centrale roller i kræft, såsom “kræftpsykologisk (fremkaldende) -miRs”, MIR-21 og MIR-155, og “tumor suppressor Mirs”, miR- 29b og miR-34 og lad-7 familier [22] – [29]. Prækliniske studier i PDAC celler viste, at exogent MIR-34 overekspression var forbundet med rekonstitution af p53-afhængig tumorsuppressorfunktion i p53-deficiente celler såvel som inhibering af pancreascancer stamcelle selvfornyelse [30]. Opregulering af Let-7 er forbundet med tilbageførsel af epitelial til mesenkymale overgang (EMT) i gemcitabin resistente celler [31]. MicroRNA-29b kan målrette de novo DNA methyltransferase 3A og 3B (DNMT3A og DNMT3B) og føre til global hypometylering og overekspression af forskellige tumorsuppressorgener, herunder p16 [32]. MicroRNA-21 ekspression er forbundet med øget proliferation, invasive egenskaber og gemcitabin kemoresistens og en tidligere undersøgelse viste, at høj MIR-21-ekspression som bestemt ved in situ hybridisering var prædiktiv for kortere overlevelse i PDAC node-negative patienter [28], [33]. MicroRNA-155 er involveret i undertrykkelsen af ​​

Tumor protein 53-induceret kerneprotein 1

, som er et pro-apoptotisk stress-induceret p53 målgen og en negativ prognostisk effekt af høj MIR-155 ekspression blev observeret i en kohorte af PDAC sager, herunder patienter med fremskreden sygdom og /eller lokale R2-resektion [34], [35].

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere potentielle biologiske markører til at forudsige udfaldet af adjuverende kemoterapi. Derfor har vi foretaget en integrativ analyse af ekspressionen af ​​MIR-21, MIR-29b, MIR-34a /b /c, MIR-155 og lad-7a-2 i en kohorte af PDAC patienter med kendte patologiske og behandling egenskaber . Derudover har vi undersøgt udtryk på 20 kendte potentielle proteinmarkører og mål for terapi, der er involveret i PDAC progression og prognose (se tabel S1 for en komplet oversigt over de 27 biologiske og 9 klinisk-patologiske faktorer, der anvendes i undersøgelsen) [6], [13 ]. Siden miR-21 udtryk status opstået som den mest prædiktive biomarkør for behandlingsresultater fra alle faktorer, evalueret i adjuvans-behandlede patienter, blev yderligere analyse af miR-21-ekspression udføres i en anden kohorte af 45 patienter, alle behandlet med adjuverende behandling. Denne uafhængige sæt bekræftede signifikant association af miR-21 udtryk status med både overlevelse og sygdomsfri overlevelse. Desuden blev associeringen af ​​lav MIR-21-ekspression med fordel af adjuverende behandling understøttes af

in vitro Salg data, der viser den forøgede kemosensitivitet af PDAC celler efter transfektion med anti-MIR-21.

Metoder

Deltagere, studiecentre, behandling detaljer

To hundrede fem og fyrre patienter, som gennemgik kræft i bugspytkirtlen resektion med den endelige diagnose af kræft i bugspytkirtlen blev retrospektivt revideret ved hjælp af elektroniske patientjournaler i perioden 1999-2007 ved Seoul National University Hospital og Seoul National University Bundang Hospital. Blandt dem, havde firs-to patienter helt resektion (R0) pancreas adenocarcinom og blev inkluderet i undersøgelsen. Patologisk tumor fase blev bestemt ifølge amerikanske Blandede Cancer (AJCC) Kræft Iscenesættelse, 6

th udgave [36]. Kort fortalt i patologiske T1-2 stadier (pT1-2) tumor engagement er begrænset til bugspytkirtlen, tumorstørrelse er mindre eller større end 2 cm for trin PT1 og pT2 hhv. Patologisk T3 (pT3) etape tumorer strække sig ud over bugspytkirtlen, uden inddragelse af cøliaki akse eller øvre mesenteriske arterie, medens pt4 tumorer er karakteriseret ved inddragelse af cøliaki aksen eller øvre mesenteriske arterie. Som for lymfen nodal stadium, patologisk nodal trin 1 (PN1) angiver regional lymfeknude-metastase. Endelig M1 indikerer tilstedeværelse af fjerne metastaser. Sygdom trin I, IIA, IIB, III og IV angiver “pT1-2 PN0 M0”, “pT3 n0 M0”, “pT1-3 PN1 M0”, “pT4 enhver N M0” og “enhver pT enhver pN M1”, henholdsvis . Patienterne fik adjuverende kemoterapi kombineret kemostråleterapi (CCRT) eller begge (n = 52), eller ikke har modtaget behandling (n = 27). Behandling status tre patienter var ukendt. Adjuverende kemoterapi og kemo-strålebehandling bestod af kombinationer af gemcitabin eller 5-fluorouracil (5-FU). FFPE prøver blev revideret for diagnose og tumor indholdet til Seoul National University Hospital, såvel som på National Cancer Institute, NIH, Bethesda, MD. Valideringen kohorte bestod af frosne prøver fra 45 på hinanden følgende pancreas adenocarcinom italienske patienter diagnosticeret i perioden 2001-2004 på regionale Referral Center for bugspytkirtlen sygdom behandling, University Hospital of Pisa, Pisa, Italien [37]. Adjuverende behandling bestod af gemcitabin-baserede kombineret modalitet behandling. Nærmere oplysninger om adjuvans regimer er anført i tabel S2.

Etik

Patient samtykke og studie godkendelse blev opnået fra de lokale Institutional Review Boards i henhold til de lovmæssige bestemmelser i de deltagende lande. Informeret skriftligt samtykke blev opnået fra koreanske patienter, der stadig var i live på tidspunktet for undersøgelsen gennem den menneskelige væv bank. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af Institutional Review Board of Human Clinical Research Center. Med hensyn til de italienske patienter, blev opnået skriftlig tilladelse. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af universitetet i Pisa etiske komité.

Immunhistokemi

Udtrykket af 20 proteinmarkører og mål for terapi blev undersøgt ved immunhistokemi (IHC). Som rapporteret i tabel S1 vi evaluerede ekspressionsniveauerne af følgende markører: vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF), matrixmetalloproteinase-2 (MMP2), matrixmetalloproteinase-7 (MMP7), matrixmetalloproteinase-9 (MMP9), tissue inhibitor af metalloproteinase-3 (TIMP3), epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), excision reparation cross-komplementering gruppe 1 (ERCC1), chemokin (CXC-motivet) receptor 3 (CXCR3), chemokin (CXC-motivet) receptor 4 (CXCR4), amphiregulin, epiregulin, hepatocytvækstfaktor (HGF), neuropilin, insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor beta (IGF-1R), Ron β, c-Met, phosphoryleret-c-Met (Pc-Met), thymidylatsyntase (TS), E -cadherin, og ribonukleotidreduktase subunit M1 (RRM1). Tissue microarray (TMA) sektioner blev bygget ved hjælp af core vævsbiopsier (diameter 2 mm) opnået fra individuelle paraffinindlejrede koreanske bugspytkirtelkræft prøver. Biopsier blev inkluderet i nye modtager paraffinblokke ved hjælp af en trepan apparat (Superbiochips Laboratories, Seoul, Republikken Korea). Hvert væv matrix blok indeholdt op til 50 kerner og 2 array-blokke blev fremstillet under undersøgelsen.

TMA snit blev afparaffiniseret under anvendelse xylen, rehydratiseret i alkohol og farvet med specifikke antistoffer som anført i Tabel S3. For ERCC1, H-score angiver farvningsintensitet (0 til 3) ganget med en faktor bestemt af andelen af ​​positive celler: 0 hvis 0% positive celler, 0,1, hvis 1-9%, 0,5, hvis 10-49%, en hvis 50% positive celler. For alle andre faktorer, positiv farvning betød et signal intensitet lig med eller større end 2, og mere end 20% af positive celler.

MicroRNA udtryk

RNA blev isoleret fra FFPE sektioner ved hjælp RECOVERALL Total Nucleic acid Isolation kit (Ambion, Austin, TX) og fra frosne vævssnit som rapporteret tidligere [38]. RNA (10-100 ng) blev anvendt til ekspression analyse af MIR-21 (italiensk kohorte) eller MIR-21, MIR-29, MIR-34a /b /c, lad-7a-2, og MIR-155 (koreansk kohorte ) ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) med TaqMan-miRNA tests og 7900 HT-Fast realtids-PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjælp af små nukleare RNA U66 eller RNU43, som de endogene normalisering styringer til de koreanske og italienske prøver hhv. Alle analyser blev udført i tre eksemplarer og resultater, som ikke opfyldte kriterierne kvalitetskontrol metodiske blev udeladt. Kvantificering af relativ microRNA ekspression blev udført under anvendelse af delta Ct-metoden. Ekspression blev bestemt som høj, når ekspressionsniveauet var lig med eller over medianen af ​​kohorten og lav, når var under medianen af ​​kohorten.

In vitro undersøgelser

menneskelige PDAC cellelinjer BxPc3 , HPAF-II, HPAC, PANC-1 og PL45 blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA), og blev dyrket i RPMI-1640-medier suppleret med 10% FBS og 1% penicillin (50 IU /ml) og streptomycin (50 ug /ml) (Gibco, Gaithersburg, MD). Celler blev holdt ved 37 ° C under en atmosfære af 5% CO

2 i 75 cm

2 vævskulturkolber (Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Tyskland) og høstet med trypsin-EDTA i deres eksponentielt voksende fase. RNA blev ekstraheret under anvendelse af et Trizol-chloroform protokol (Sigma, St. Louis, MO). RNA udbytter og integritet blev kontrolleret ved måling af optisk densitet ved 260/280 nm med en Nanodrop® spektrofotometer.

Det basale ekspression af MIR-21 blev vurderet ved kvantitativ-Real-Time PCR, som beskrevet ovenfor for PDAC væv . Kvantificering af MIR-21 ekspression blev udført under anvendelse af delta Ct-metoden, normalisering af Ct amplifikation data med RNU43. Relative MIR-21 ekspressionsniveauer blev udtrykt i arbitrære enheder (AU).

cellevækstinhiberingen af ​​5-FU (0,1-1000 uM), og gemcitabin (0,1-1000 nM) plus bestråling (100 cGy), blev bestemt ud fra tre separate forsøg ved anvendelse af SRB (sulforhodamin-B) assay og blev udtrykt som procentdelen af ​​kontrol (vehikel-behandlede celler) absorbans, korrigeret for absorbans, før tilsætning af lægemidler, som tidligere [39] beskrevne. For bestråling blev eksponentielt voksende celler udpladet i 100 mm vævskulturskåle (Costar), fik lov at binde i 24 timer, og bestrålet ved anvendelse af en 6 MV foton lineær accelerator (General Electric, Buckinghamshire, UK). Efter bestråling blev cellerne høstet og 10

4 celler /brønd blev udpladet i plader med 96 brønde og lades vokse i yderligere 48 timer i stoffri medium eller behandlet med gemcitabin, som tidligere beskrevet [40]. De 50% hæmmende koncentration (IC

50) af cellevækst for hver cellelinje blev bestemt ved ikke-lineær mindste kvadraters kurvetilpasning af dosis-respons kurver (GraphPad PRISM udgave 5, Intuitiv Software videnskabsminister San Diego, CA ). Virkningen af ​​MIR-21 på cellevækst og kemosensitivitet blev evalueret ved transfektion af cellerne med antisense-oligonukleotiderne (anti-MIR-21) indkøbt fra Ambion-Applied Biosystems (Assay ID, AM10206), ved 30 nM slutkoncentration. Celler blev udpladet med 200.000 celler /brønd i 3 ml RPMI med 10% FBS og 1% antibiotika. Efter 24 timer blev cellerne udsat for 9 pi oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK) i serum-frit medium, blandet i 10 minutter ved stuetemperatur, efterfulgt af tilsætning af 3 pi 6,25 pM MIR-21 precursor eller inhibitor. Celler blev også inkuberet med miRNA negative kontroller og FAM-mærket anti-mir (Ambion). Efter 24 timer blev mediet fjernet fra brøndene og erstattet med RPMI med 10% FBS, uden antibiotika. Derefter blev cellerne opsamlet ved trypsinering og overført til en 96-brønds plade, hvor de fik lov til at vokse i yderligere 48 timer i stoffri medium eller behandlet med 5-FU, som beskrevet ovenfor. Yderligere kontrolbrønde blev anvendt til RNA-ekstraktion, som beskrevet ovenfor, mens transfektionseffektiviteten med FAM-mærket anti-mir kontroller blev evalueret med fluorescensmikroskopi.

Statistiske metoder

Sammenligninger af dikotome parametre var mellem to grupper under anvendelse af Fishers eksakte test. En generaliseret version af Fishers eksakte test blev anvendt til sammenligninger af alder, tumor scenen og differentiering klasse, da opdelt i tre kategorier [41]. Sandsynligheden for samlet overlevelse (OS) eller sygdomsfri overlevelse (DFS) som en funktion af tiden blev bestemt ved Kaplan-Meier-metoden, med en log-rank test anvendes til at bestemme den statistiske signifikans af forskellen af ​​Kaplan-Meier-kurver [42], [43] for de univariate prognostiske faktorer analyser, sager, hvor patienterne blev i sidste ende grupperet i to kategorier, bestemt efter foreløbig evaluering af fire kategorier ved hjælp af kvartiler af fordelingen af ​​den gruppering parameter, havde p-værdien justeres ved multiplicere ujusterede p-værdi med tre. Dette ville forklare den implicitte test, som resulterede i en beslutning om at placere patienter i de to kategorier med et større prognostisk forskel mellem grupperne. En Cox proportionel risiko model analyse blev udført for at bestemme den fælles sammenslutning faktorer oprindeligt fundet at have potentiale association med resultatet i de univariate analyser (evaluere i dette

endelige model

kun de parametre med ukorrigeret p 0,10 fra en log -rank test) [44]. Alle p-værdier er to-halet, og bortset fra som anført ovenfor, er præsenteret uden korrektion for multiple sammenligninger.

Alle

in vitro Salg eksperimenter blev udført tredobbelt og gentaget mindst to gange. Dataene blev udtrykt som middelværdier ± SE og analyseret ved Students t-test og /eller Mann Whitney test. Statistisk signifikans blev sat til p 0,05

Resultater

Karakteristik af patienterne

Tabel 1 opsummerer klinisk-patologiske karakteristika.. I de koreanske patienter, median OS og DFS var 18,1 og 9,1 måneder. I denne kohorte var OS signifikant længere for patienter behandlet med adjuverende kemoterapi og /eller CCRT (n = 52): median overlevelse var 21,3 vs. 14,7 måneder for patienter behandlet vs. ikke behandlet med adjuverende behandling (n = 27); p = 0,017. Se figur S1 for Kaplan-Meier plot.

Expression analyseresultater

Angivelse af miR-21, miR-34a, miR-155 og lad-7a kunne påvises i alle 82 tilfælde , og ekspressionen af ​​miR-29b, miR-34b, og miR-34c i 81, 73 og 80 tilfælde hhv. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at MIR-34b og MIR-34c deler den samme transkriptionspromotor [45], ekspressionssystemer værdier for disse miRNA var korreleret (data ikke vist). IHC resultater var tilgængelige for neuropilin og MMP-9 i 80 tilfælde, for amphiregulin, HGF, EGFR og TIMP3 i 79 tilfælde, for Ron, CXCR-3, e-cadherin, RRM1, IGF-1R, TS, VEGF, MMP-2 og MMP-7 i 78 tilfælde, CXCR-4 i 77 tilfælde, for c-Met og Pc-Met i 76 tilfælde, for ERCC1 i 75 tilfælde og for epiregulin i 73 tilfælde.

Som beskrevet i metoder sektion, for hvert protein vi scorede farvningsintensiteten og procentdelen af ​​positivt farvede celler. I fig S2, er vist repræsentative billeder af immunhistokemisk farvning for P-c-Met. Tabel 2 sammenfatter resultaterne af immunhistokemisk farvning for alle de undersøgte proteiner.

univariat analyse

I alt 36 klinisk-patologiske, microRNA og protein variabler blev evalueret for deres tilknytning til OS eller DFS i den koreanske kohorte. Baseret på univariat analyse blev et sæt af 10 og 12 parametre i betragtning til evaluering i Cox modeller for OS og DFS, (se tabel S4). Udvalgte parametre blev også testet i henhold til adjuverende behandling status (tabel S4). Derudover, for alle parametre blev populationen opdelt i 4 grupper til sammenligning: (1) negativ parameter, ingen adjuverende behandling vs. (2) negativ parameter, adjuverende behandling vs. (3) positiv parameter, ingen adjuverende behandling vs. (4 ) positiv parameter, adjuverende behandling. Tabel S4 viser kun kombinationer med en tilhørende p-værdi 0,10. Især blev et stærkt samspil af miR-21 udtryk status og adjuverende behandling status til OS og DFS demonstreret. Low MIR-21 ekspression var forbundet med længere OS og DFS i adjuvans-behandlede patienter, med p-værdier på 0,016 og 0,02, henholdsvis, men ikke hos patienter ikke behandles med adjuverende behandling (p-værdier på 0,49 og 0,93, henholdsvis). Denne differentielle associering mellem MIR-21 og behandlingen status blev støttet ved at sammenligne undergruppe af lav MIR-21, adjuvans-behandlede patienter vs. resterende patienter. Gruppen af ​​patienter med lav miR-21 som blev behandlet med adjuverende behandling havde median OS og DFS af 27,7 og 16,2 måneder. Resterende patienter havde median OS på 14,3 og DFS på 7,0 måneder, med p-værdier på 0,002 til OS, og 0,0095 for DFS. Se også figur 1 og figur S3.

Samlet overlevelse ifølge MIR-21 status i (A) ikke adjuvans behandlede patienter og (B) adjuvans-behandlede patienter. Sygdomsfri overlevelse efter miR-21 status i (C) ikke adjuverende behandlede patienter og (D) adjuvans behandlede patienter.

Cens .: censurerede

.

Cox modeller for samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse

Ved hjælp af en tilbagestående udvalg algoritme, en Cox model blev konstrueret indeholder parametre, viste sig at være i fællesskab forbundet med OS. En anden model blev identificeret for prognostiske bestemmelse af DFS (tabel 3 og 4). Fra multivariat analyse blandt alle patienter, som den mest signifikant associeret parameter for både OS og DFS blev patienter med lav miR-21 som blev behandlet med adjuverende behandling vist sig at have en signifikant lavere hazard ratio (HR) for død (0,443, 95% CI: 0,263 til 0,748; p-værdi, 0,002) og for tilbagefald (0,358, 95% CI: 0,188-0,682; p-værdi: 0,002) sammenlignet med alle resterende patienter. I modsætning til patienter ikke behandlet med adjuverende behandling, er lavere end medianen miR-21-ekspression var ikke forbundet med en signifikant forskellig HR for død eller fornyet 0,880, p-værdier 0,76 og 0,30, henholdsvis.

Sammenligning af kovariater efter adjuverende behandling vs. ubehandlede patienter

Da sagerne ikke blev randomiseret til behandling i dette studie, vi ønskede at afgøre, om der var signifikante forskelle i kovariat fordeling mellem de behandlede patienter og ikke behandlet med adjuverende behandling (tabel S5). Den eneste signifikante forskel var en lavere gennemsnitsalder i adjuverende behandlede gruppe på 61 år (interval: 45-75 år) vs. 66 år (spændvidde: 49-83 år) i den ubehandlede gruppe (p-værdi: 0,002, Wilcoxon to sample test). Se tabel S6 for differentiel proteinekspression. Desuden har vi konstrueret separate Cox modeller for patienter behandlet med adjuverende behandling vs. patienter ikke behandles med adjuverende behandling. Først gjorde vi en univariat analyse i begge grupper (tabel S7 og S8). Cox model analyse viser, at kun i undergruppen af ​​adjuvans patienter lav miR-21 status blev forbundet med en signifikant lavere HR for død og tilbagefald (tabel 5, tabel 6, tabel 7 og tabel 8). I undergruppen af ​​ikke adjuverende behandlede patienter, positiv angiolymphatic invasion og ekspressionen af ​​miR-34a over medianen var forbundet med øget HR for død og tilbagefald henholdsvis mens miR-21 ikke havde en tilstrækkelig lav p-værdi for optagelse i endelige model. Vejviser

sammenligning af kovariater ifølge miR-21 udtryk

Fordeling af klinisk-patologiske og IHC kovariater blev sammenlignet mellem lav miR-21 og høje miR-21 patienter, som rapporteret i tabel 9 og tabel S9. Median alder i den lave miR-21-gruppen var 63 år (spændvidde: 45-83 år), ikke signifikant forskellig fra den høje miR-21-gruppen, median alder 64 år (interval: 46-78 år), p-værdi: 0,94 . Der var imidlertid en tendens til en mere avanceret AJCC stadium (IIa vs IIb) i høj MIR-21-ekspression (p-værdi: 0,07). Ligeledes var der flere tilfælde med dårlig differentiering kvalitet i høj MIR-21-gruppe, selvom denne gruppe også indeholdt flere tilfælde med veldifferentierede tumorer (tabel 5). Vi kunne ikke bekræfte en tidligere rapporteret sammenslutning af miR-21 og TIMP3 udtryk [46], mens vi fandt, at Pc-Met og VEGF udtryk var signifikant mere almindelig i MIR-21 høje tilfælde (tabel S9).

Som høj mIR-34a-ekspression blev påvist at være forbundet med nedsat DFS har vi desuden sammenlignet distribution af klinisk-patologiske og IHC kovarianter mellem lav mIR-34a og høje mIR-34a patienter. Høj ekspression af MIR-34a var kraftigt forbundet med høj ekspression af phospho-c-Met (p-værdi: 1x10E-6). Endvidere blev høj MIR-34a-ekspression er forbundet med lav ekspression af HGF (p-værdi: 0,01) samt høj ekspression af VEGF (p-værdi: 0,01). Endelig blev lav miR-21-ekspression observeret hyppigere i miR-34a lave sager. (P-værdi: 3x10E-8)

Høj miR-21-ekspression viser association med øget fjernt recidiv rate

Næste, vi sammenlignet antallet af lokale vs. fjernt recidiv af sygdom i den lave vs. høj ekspression gruppe af miR-21. I high MIR-21 ekspression gruppe 25 ud af 41 patienter (61%) havde tilbagevendende sygdom på et fjernt sted, som var signifikant forskellig fra den lave MIR-21 ekspression gruppe, i hvilken kun 12 ud af 38 patienter (32%; med 3 patienter tabt for opfølgning) oplever fjernt recidiv (p-værdi: 0,013). Til sammenligning blev der i den gruppe, der modtog adjuverende behandling 25 ud af 51 patienter (49%) havde tilbagevendende sygdom. Dette var ikke signifikant forskellig fra den gruppe, der ikke behandles med adjuverende behandling med 11 ud af 26 patienter (42%) oplevede fjernt recidiv (p-værdi: 0,63; med 5/82 patienter mangler på grund af utilstrækkelige data)

Selvom det ikke er statistisk signifikant, høj miR-21-ekspression viste også en tendens mod højere trin og positiv lymfeknude status (tabel 5).

Validering kohorte

en række 45 resektion pancreasadenocarcinom patienter , alle behandlet med adjuverende gemcitabin, blev brugt til at validere forudsigende rolle miR-21-ekspression i kaukasiere. Median OS og DFS var 20,4 og 18,7 måneder. Se tabel 1 for klinisk-patologiske parametre (italiensk kohorte). MIR-21 ekspression var påviselig i alle prøver. Univariate analyse viste en tendens til signifikant sammenhæng mellem dårlig tumor differentiering og kortere OS (p-værdi: 0,07), mens forekomsten af ​​neurale infiltration marginalt var associeret med signifikant kortere DFS (p-værdi: 0,047), men ikke OS (p- værdi: 0,90), som angivet i tabel S10. Alder, køn, scene, lymfeknude, og vaskulær infiltration var ikke associeret med resultatet. Patienter med høj MIR-21-ekspression havde en signifikant kortere OS, dvs. median 15,6 sammenlignet med 24,4 måneder hos patienter med MIR-21 ekspressionsniveauet ringere end median (p-værdi: 0,006). Den mediane DFS af patienter med høj MIR-21 ekspression var 14,0 måneder, sammenlignet med 23,8 måneder hos patienter med den lave MIR-21-ekspression (p-værdi: 0,0042). Se figur 2 for Kaplan-Meier-kurver. Cox modeller blev konstrueret som bekræftede sammenslutning af miR-21 udtryk status og overlevelse varighed, med høj miR-21 udtryk, som den eneste tilbageværende faktor, der er forbundet med en øget HR for død på 3,538 (95% CI: 1,415-8,849; p -værdi: 0,007) og tilbagefald på 4,008 (95% CI: 1,385 til 11,595; p-værdi: 0,01). Samlet analyse af de to kohorter bekræftede betydelig prædiktiv betydning miR-21 udtryk status, som rapporteret i Tal S4 og S5.

(A) Samlet overlevelse i henhold til miR-21 status og (B) sygdomsfri overlevelse status ifølge mIR-21 status.

Cens .: censureret

.

MIR-21 og antiproliferative virkninger af 5-FU i PDAC celler

Angivelse af miR-21 var påviselig i alle PDAC celle linjer, der spænder fra 4,5 i PL45 celler til 1,5 au i BxPC-3-celler (figur 3A). En dosisafhængig inhibering af cellevækst blev observeret efter både 5-FU, og gemcitabin plus strålebehandling, som vist i figur 3B-C. Navnlig 5-FU behandling resulterede i en beskeden inhibering af cellevækst i Panc-1 og PL45 celler, med IC

50’erne i 138,4 ± 23,4 um og 174,2 ± 31,1 uM. Blandt de undersøgte cellelinier, BxPC3 og HPAF-II var de mest følsomme over for gemcitabin og 5-FU, hvorimod PL45 var den mest modstandsdygtige over for både 5-FU og gemcitabin og strålebehandling.

(A) MiR -21 ekspression i 5 PDAC cellelinier. Ekspression blev bestemt ved kvantitativ PCR under anvendelse af delta Ct-metoden med RNU-43 som reference, og værdierne er i au. (B-C) Repræsentative kurver for væksthæmmende effekter af 5-FU (B) og gemcitabin og strålebehandling (C) , 48-timers drug eksponering. (D). Celler blev podet ved 10

4 /brønd, og antiproliferative virkninger blev evalueret under anvendelse af SRB-assayet, som beskrevet i fremgangsmåderne. Den gennemsnitlige IC

50 værdier for 5-FU (48 h kontinuerlig eksponering) var som følger: 36,3 pM (BxPC-3), 30,9 uM (HPAF-II), 138,4 uM (Panc-1) og 174,2 uM (PL45 ); mens de IC50-værdierne for gemcitabin (i celler forbehandlet med 100 cGray) var 2,1 nM (BxPC-3), 3,4 nM (HPAF-II), 10,2 nM (PANC-1) og 11,4 nM (PL45).