PLoS ONE: Nanoformulation af geranylgeranyltransferase-I-inhibitorer for Cancer Therapy: Liposomal Indkapsling og pH-afhængig levering for cancerceller

abstrakt

småmolekylære inhibitorer mod protein geranylgeranyltransferase-I som P61A6 er blevet vist at inhibere proliferation af en række humane cancerceller og udviser antitumorvirkning i musemodeller. Udvikling af disse inhibitorer kan mærkbart ved at overdrage tumortargeting og evne kontrolleret frigivelse. Som et første skridt hen imod dette mål, har vi indkapslet P61A6 ind i en ny type liposomer, der kan åbnes og frigiver laster kun under lav pH tilstand. Disse lave pH-release typen liposomer blev fremstillet ved at justere forholdet mellem to typer phospholipidderivater. Lastning af geranylgeranyltransferase-I inhibitor (GGTI) genererede liposomer med gennemsnitlig diameter på 50-100 nm. GGTI frigivelse i opløsning var skarpt afhængig af pH-værdier, der kun viser frigivelse ved pH lavere end 6. Frigivelse af ladninger i en pH-afhængig måde inde i cellen blev påvist ved anvendelse af en protonpumpeinhibitor bafilomycin A1 at øget lysosomal pH og inhiberet frigivelse af et farvestof bæres i pH-liposom. Levering af GGTI til humane bugspytkirtelkræftceller blev påvist ved hæmning af protein geranylgeranylering inde i cellen, og denne virkning blev blokeret af bafilomycin A1. Desuden GGTI leveret af pH-liposomer inducerede proliferation inhibition, G1 cellecyklusstandsning der er forbundet med ekspressionen af ​​cellecyklus regulator p21

CIP1 /WAF1. Proliferation inhibering blev også observeret med forskellige lungecancer-cellelinjer. Tilgængelighed nanoformulated GGTI åbner mulighed for at kombinere med andre typer af inhibitorer. For at demonstrere dette punkt, vi kombineret det liposomale-GGTI med farnesyltransferase hæmmer (FTI) at hæmme K-Ras signalering i bugspytkirtelkræftceller. Vores resultater viser, at det aktiverede K-Ras-signalering i disse celler kan inhiberes effektivt og observeres, at synergistisk virkning af de to lægemidler. Vores resultater tyder på en ny retning i brugen af ​​GGTI til cancerterapi

Henvisning:. Lu J, Yoshimura K, Goto K, Lee C, Hamura K, Kwon O, et al. (2015) Nanoformulation af geranylgeranyltransferase-I-inhibitorer for Cancer Therapy: Liposomal Indkapsling og pH-afhængig Levering til kræftceller. PLoS ONE 10 (9): e0137595. doi: 10,1371 /journal.pone.0137595

Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: April 23, 2015; Accepteret: August 18, 2015; Udgivet: 9 September, 2015

Copyright: © 2015 Lu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af NIH give CA41996 (FT) og R01GM071779 og P41GM081282 (til OK), https://grants.nih.gov/grants/giwelcome.htm. En del af det udførte arbejde i dette papir blev understøttet af en sponsoreret forskningsaftale med NOF, Inc (FT). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. NOF Corporation ydet støtte i form af løn til forfattere [Kohei Yoshimura og Ken Hamura ]. Deres bidrag til undersøgelsen er defineret i Forfatter bidrag afsnittet. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

En klasse af anticancer narkotika for at hindre membran sammenslutning af signalanlæg proteiner er blevet udviklet i årenes løb . GGTI (geranylgeranyltransferase-I inhibitor) eksemplificerer denne type lægemidler mod cancer [1-3]. GGTI inhiberer protein-geranylgeranyltransferase I (GGTase-I), et enzym, der tilføjer en C20 geranylgeranyl gruppe proteiner, såsom RhoA, RhoC, Rap1 og Ral ved cystein i den carboxyterminale tetrapeptid konsensussekvens CAAL (C er cystein, A er en alifatisk aminosyre, og den C-terminale rest er leucin eller phenylalanin). Karakterisering af mus med betinget knockout af GGTase-I viste, at GGTase-I-mangel resulterer i inhiberingen af ​​onkogene K-ras-induceret lunge tumordannelse og dramatisk forøger overlevelsen af ​​mus [4]. GGTase-I hæmning resulterer i proliferation hæmning forbundet med G1 anholdelse og akkumulering af cellecyklus regulatorer såsom p21

CIP1 /WAF1, der peger på vigtigheden af ​​GGTase-I i celledeling og cellecyklus progression [5-7].

ved at screene en kemisk forbindelse bibliotek bygget af phosphin katalyse af allenoate forbindelser, vi tidligere identificeret flere GGTase-i inhibitor (GGTI) forbindelser, der blokerer proteinet modifikation og hæmmer membran forening og funktion af Ral, Rho, og Rap underfamilie proteiner [8,9]. Disse forbindelser inhiberer GGTase-I ved at konkurrere med sine substratproteiner. Cell aktive forbindelser P61A6 og P61E7 forårsagede cellecyklusstop og undertrykte væksten af ​​menneskelige kræftceller, herunder kræft i bugspytkirtlen og ikke-småcellet lungecancer [10,11]. Effekt af GGTI P61A6 at inhibere tumorvækst blev påvist under anvendelse af human pancreascancer xenograft [10]. I dette forsøg blev signifikant hæmning af tumorvækst observeres med lidt bivirkninger som bedømt ved nyre- og leverenzymer profiler og ved hæmatologisk karakterisering. Inhibering af geranylgeranylering i tumoren blev demonstreret. En lignende hæmning af tumorvækst blev observeret ved brug af lungekræft implanteret i mus [11].

En stor udfordring for yderligere GGTI udvikling er at give tumor kapacitet målretning til disse forbindelser. Selv om det er muligt at anvende lave mængder GGTI at minimere potentielle bivirkninger, den mulighed, at der er dosisbegrænsende toksicitet af denne GGTI forbindelse kan ikke udelukkes, eftersom GGTase-I er et enzym, der fungerer også i normale celler. Således er det vigtigt at udvikle en ny generation af nano-formuleret GGTI der fortrinsvis leverer GGTI forbindelse, tumorer. Dette vil sætte tumor målretning formindske uønsket distribution til andre dele af kroppen, hvorved man undgår eventuelle potentielle virkninger på normalt væv.

En dramatisk fremskridt i nanoteknologi har ført til udviklingen af ​​en række lægemiddeladministrationssystemer herunder liposomer , polymere miceller, vira og mesoporøse silica nanopartikler [12-25]. Disse nanopartikler kan levere lægemidlet til tumoren ved forøget permeabilitet og tilbageholdelse virkning [13], samt ved anvendelse af ligander, der er målrettet receptorer på kræftceller, hvorved man undgår uønsket systemisk kemotoksicitet. Blandt dem, liposomer har fordelagtige funktioner, der omfatter en effektiv indkapsling, relativt nem tilberedning, bionedbrydelighed og biokompatibilitet [26-31]. Desuden er egnet til at skabe bio-relaterede funktioner som membran destabilisering og /eller membran-fusion, fremme cellulær internalisering af membranbundne impermeable molekyler over cellulære membraner i cellerne phospholipid dobbeltlag struktur af liposomer.

Desuden til tumormålretning, er det vigtigt at opnå kontrolleret frigivelse således at anticancerlægemidler vil blive frigivet fortrinsvis i tumoren. For nylig, tilgange til at syntetisere en hidtil ukendt type af liposomer med lav pH-funktionen frigivelse er blevet rapporteret [32,33]. Fordi intracellulær lysosomale pH er lav, og også fordi tumor mikromiljø har lav pH på grund af hypoxiske betingelser [34-36], denne funktion giver en fordel, at stoffet udgivelse er mere begrænset til kræftceller.

I dette papir, vi rapporterer fremstilling af liposomer, som effektivt indkapsler småmolekylelægemidler og farvestoffer og frigive lasten, når de møder lave pH-betingelser. GGTI P61A6 blev effektivt indkapslet i pH-følsomme liposomer og blev leveret til humane cancerceller. Inhibering af protein geranylgeranylering samt proliferation inhibering, celle cyklus effekter og akkumuleringen af ​​cellecyklusinhibitor p21

CIP1 /WAF1 blev observeret ved levering af GGTI ved de pH-følsomme liposomer. Vi udvider yderligere anvendelsen af ​​liposomalt GGTI for kræftbehandling ved at påvise, liposomal-GGTI kan kombineres med farnesyltransferase hæmmer (FTI) at hæmme K-Ras signalering i bugspytkirtelkræftceller.

Materialer og Metoder

Materialer

En GGTI sammensatte P61A6 anvendt til denne undersøgelse blev afledt af allenoate-afledte sammensatte bibliotek, som beskrevet i vores tidligere publikationer [9-11]. 20 mM stamopløsning af GGTI P61A6 i DMSO blev holdt ved -20 ° C indtil anvendelse. FTI sammensatte BMS225975 blev beskrevet tidligere [37]. Denne forbindelse inhiberer protein-farnesyltransferase specifikt med ringe inhibering af protein-geranylgeranyltransferase I og RabGGTase. COATSOME

® MC-6081 (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-phosphocholin (POPC)), SUNBRIGHT

® DSPE-PG8MG (kondensationsprodukt af N- (octaglycerol-glutaryl) distearoylphosphatidylethanolamin med 3- methylglutaric syre (DSPE-PG8MG)), blev leveret af NOF CORPORATION (Tokyo, Japan). 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- (lissamin rhodamin B sulfonyl) (ammoniumsalt) (Rhodamin-PE) blev fremskaffet fra Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, USA).

design og Udarbejdelse af lav pH-følsomme liposomer

pH-følsomme tomme liposomer blev fremstillet af POPC og DSPE-PG8MG. Typiske procedurer blev beskrevet nedenfor. POPC og DSPE-PG8MG (molforhold; 85:15) blev opløst i en chloroform-methanol-blanding, og opløsningsmidlet blev fjernet i en rotationsfordamper. Lipidblandingen var vakuumtørredes og hydreret med vandig opløsning (10 ml) indeholdende saccharose som et kryobeskyttelsesmiddel. Efter ekstrudering af liposomsuspensionen gennem membran (porestørrelse 0,22 um), den opnåede suspension blev frysetørret til opnåelse af de pH-følsomme tomme liposomer [38].

rhodaminfluorescens-mærkning af liposomer

rhodamin-mærkede pH-følsomme tomme liposomer blev fremstillet ud fra POPC, DSPE-PG8MG, og rhodamin-PE (molforhold; 85: 15: 0,1). POPC og DSPE-PG8MG blev opløst i en chloroform-methanol-blanding. Rhodamin-PE blev opløst i chloroform og sættes til lipider opløsning, og opløsningsmidlet blev fjernet i en rotationsfordamper. Lipidblandingen var vakuumtørredes hydreret med phosphatbufferopløsning indeholdende sucrose. Efter ekstrudering af liposomsuspensionen gennem membran (porestørrelse 0,22 um), den opnåede suspension blev frysetørret, hvilket gav det fluorescerende farvestof-mærkede pH-følsomme tomme liposomer.

Rhodamin-mærkede liposom pulver blev rekonstitueret i PBS buffer ved 10 ug /ml, sonikeret i sonikator (vandbad type) i 10 minutter, og tilsat til MiaPaCa-2-celler, der var dyrket i 8 brønde maalekuvetten kammer i 4 timer. Cellerne blev derefter vasket med PBS-buffer og inkuberet med 50 nM LYSOTRACKER grøn, efterfulgt af inkubation i celledyrkningskamret i yderligere 1 time før observation med fluorescerende mikroskop.

Drug-loaded Liposomfremstillinq

En lille prøve (130 gi) af opløst GGTI (1,2 mg) i 75% EtOH med 10% DMSO (slutkoncentration = 6,41 mg /ml), fortyndet i dH

2O til 10%, blev blandet med 1,3 mg tørt pulver af liposomer, og blandingen blev roteret ved 4 ° C i 4 timer efterfulgt af lydbehandling i 2 minutter under anvendelse af et vandbad-sonikator typen. Liposomsuspensionen blev ekstruderet gennem en polycarbonatmembran med en porestørrelse på 100 nm. På samme tidspunkt blev 6 ml Sepharose 4B-gel blandes med 2 ml PBS på is og blev påført til 10 ml søjle, pakket med en hastighed på 15 cm /time. Og derefter blev blandingen af ​​liposom og GGTI blev fyldt på toppen af ​​gelen i søjlen. Efter at lade prøven at komme ind i harpiksen blev søjlen straks fyldt med kold PBS-buffer, og pumpning blev startet med en hastighed på 15 cm /time for at fjerne frie lægemidler, der ikke blev indlæst i liposomer fra lægemiddel fyldte liposomer [32] . Eluenterne blev opsamlet, og fraktionerne indeholdende liposomerne blev identificeret ved deres turbiditet. Prøven blev holdt ved 4 ° C i yderligere eksperimenter.

Drug og Dye Frigivelse fra Liposomer

Frigivelse af narkotika fra liposom blev målt med Højtydende væskekromatografi (HPLC). 400 pi Liposomer, der indkapsler GGTI (indsamlet fra Sepharose-søjle) blev blandet med 150 mM NaCl, centrifugeret ved 100.000 rpm i 10 min, 4C, til udfældning liposomale GGTIs. Bundfaldet blev resuspenderet i 400 pi PBS. 73 pi resuspenderet opløsning blev tilsat til 927 pi PBS-buffer med varierende pH-værdier, og derefter blandet ved 37 ° C i 15 minutter. Triton X-100 blev anvendt som 100% kontrol, fordi Triton X-100 kan nedbryde de liposomer (slutkoncentration: 0,1%). Blandingerne blev tilsat til de indre rør af ultrafilter Amicon Ultra-4 (MWCO = 10 kDa, Millipore) og centrifugeret ved 13.000 g i 10 min ved stuetemperatur. Eluaterne blev underkastet HPLC for at måle koncentrationen af ​​frigivet GGTI (Waters Micromass LCT Premier Mass Spectrometer). Frigivelse af fluorescerende farvestof pyranin blev udført som tidligere [32] beskrevne. En lille prøve (500 pi) af 35 mM pyranin, 50 mM DPX (p-xylen-bis-pyridiniumbromid), og 25 mM phosphatpufferopløsning (pH 7,4) blev blandet med 7 mg af liposomer, og blandingen blev sonikeret i 2 min ved anvendelse af et vandbad-sonikator. Pyranin fluorescens standses ved DPX indersiden af ​​liposomer, men vil udsende intens fluorescens efter at være blevet frigivet fra liposom. Liposomer, der indkapsler pyranin og DPX blev tilsat til 25 mM phosphat og 125 mM NaCI-buffer med varierende pH-værdier og fluorescensintensitet (512 nm) blev målt med et spektrofluorometer (416 nm, Jasco FP-6500). Den procent frigivelse af pyranin fra liposomer blev defineret som Release (%) = (Ft-Fi) /(Ff-Fi) × 100 hvor Fi og Ft betyder de indledende og formidlende intensiteter fluorescens, hhv. Ff er fluorescensintensiteten efter tilsætning af Triton X-100 (slutkoncentration: 0,1%).

Cell Culture

human brystcancer cellelinje, MCF-7, pancreascancer cellelinie MiaPaCa2, ikke-småcellet lungekræft cellelinien H596, H358, A549 og en normal human bronchial epitel-cellelinje BEAS-2B blev opnået fra American Type Culture Collection. Alle cancer cellelinjer blev opretholdt i DMEM eller RPMI suppleret med 10% FCS (Sigma), 2% L-glutamin, 1% penicillin og 1% streptomycin. BEAS-2B-celler blev dyrket med BEBM medier tilsat med særlige vækstfaktorer (Lonza /Clonetics Co.). Mediet var rutinemæssigt skiftes hver 3. dag, og cellerne blev adskilt ved trypsinisering, før de når sammenflydning.

Levering af Farvestoffer for cancerceller

doxorubicin levering blev undersøgt som følger. Efter centrifugering gennem en Sepharose 4B-søjle for at fjerne frie lægemidler blev en homogen suspension af doxorubicin-liposomer tilsættes til brystkræft MCF-7-celler, der var dyrket i en 8 brønd glas kammer. 6 timer efter inkubation blev cellerne vasket og undersøgt med fluorescensmikroskopi af billedet fordelingen af ​​doxorubicin i cancerceller. De pyranin liposomer blev fremstillet som beskrevet ovenfor. MiaPaCa-2-celler (3 x 10

5 celler) blev dyrket natten over i en 8 brønde glas celledyrkningskamret. Liposomsuspensioner blev tilsat til cellerne og inkuberet i 4 timer ved 37 ° C. Efter inkubationen blev cellerne vasket med PBS to gange og observeret med et fluorescensmikroskop (Carl Zeiss). Bafilomycin behandling blev udført med 160 nM bafilomycin A1 i 6 timer forud for tilsætningen af ​​liposomer. Acridin Orange (Sigma) farvning blev udført ved 6 pM koncentration.

Proliferation inhiberingsassay

Proliferation inhibition assay blev udført ved anvendelse af en celle-tælling kit fra Dojindo Molecular Technologies, Inc. Kræftceller blev podet i plader med 96 brønde (5000 celler godt

-1) og inkuberet i frisk dyrkningsmedium ved 37 ° C i en CO 5%

2/95,% luft atmosfære i 24 timer. Cellerne blev derefter vasket med PBS, og mediet blev ændret til et frisk medium indeholdende GGTI liposomer eller tomme liposomer med samme volumen i puffer som kontrol i de angivne koncentrationer. Efter 24 timer blev cellerne vasket med PBS for at fjerne liposomer, som ikke blev taget op af cellerne, og cellerne blev derefter inkuberet i frisk medium i yderligere 48 timer. Cellerne blev vasket med PBS og inkuberet i DMEM med 10% WST-8-opløsning i yderligere 2 timer. Absorbansen af ​​hver brønd blev målt ved 450 nm med en pladelæser. Da absorbansen er proportional med antallet af levedygtige celler i mediet, blev antallet af levedygtige celler bestemmes ved hjælp af en tidligere fremstillet kalibreringskurve (Dojindo Co.). Salg

Western blot analyse

Celler blev behandlet med GGTI-liposomer, tomme liposomer eller GGTI i 24 timer, høstet og lyseret i lysisbuffer (1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI ved pH 7,5, 1 mM EDTA, og 1 × proteaseinhibitor-blanding). Proteiner blev separeret ved gelelektroforese på en SDS polyacrylamidgel og derefter overført til nitrocellulosemembraner. Membranerne blev blokeret med Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 5% (vægt /volumen) skummetmælk. Efter vask med TBS indeholdende 0,1% Tween 20 (Sigma) blev membranerne inkuberet natten over med det første antistof (mod unprenylated form af Rapi, Santa Cruz Biotechnology, CA) fortyndet med TBS. Efter vask blev membranerne inkuberet i 2 timer med det andet antistof (Santa Cruz Biotechnology, CA). Bånd blev detekteret med et ECL-systemet (Amersham Pharmacia Biotech K.K., UK). Phosphorylering af ERK blev testet under anvendelse af et antistof mod phorphorylated form af ERK samt mod total ERK (Cell Signaling, CA). Anti-actin antistof blev købt fra Sigma-Aldrich (CA).

Statistisk analyse

Alle resultater er udtrykt som middelværdi ± SD. Statistiske sammenligninger blev foretaget under anvendelse af t-test efter variansanalyse. Resultaterne blev betragtet som signifikant forskellige ved P-værdi 0,05, markeret med *.

Resultater

Design og Udarbejdelse af lav pH-følsomme liposomer (pH-liposomer)

Vores pH-liposomer er stabile ved fysiologisk pH, men blive destabiliseret under sure betingelser på grund af protonering, derfor reagere på lav pH miljøer endosom-lysosomer inde i cellerne [32]. Liposomerne blev fremstillet ved anvendelse af to forskellige lipider, DSPE-PG8MG og POPC. En almindelige opbygning af DSPE-PG8MG er vist i figur 1. Dette molekyle indeholder en phospholipid, der er knyttet til carboxyleret polyglycerin del (PG kæde). Under sure betingelser, er PG-kæden protonerede resulterer i destabilisering af liposomale membraner forårsager fusion med endosomale membraner. Indholdet af liposomer vil derefter frigives i cytosolen. Ved at ændre forholdet mellem de to lipider, er det muligt at designe liposomer, der reagerer på forskellige pH-værdier. Her er polyglycerin modificeret med 3-methyl glutarsyre kendt for at have en pKa-værdi på 6,3 [39,40]. Derfor DSPE-PG8MG har en lignende pKa værdi polyglycerin derivat, og vil have en pH-responsivitet nær pH ​​6. I vores tilfælde, vi ville opnå indhold frigivelse ved pH under 6, men lidt frigivelse over pH 6. Således er det blev besluttet at finde en passende lipidsammensætning i lignende procedure. Kort beskrevet dispersioner af pH-liposomer, som er indkapslet pyranin farvestof blev tilsat til opløsninger ved forskellige pH-værdier. Og pH-responsivitet af liposomerne blev vurderet ved at måle mængden af ​​pyranin frigives fra dem. Efter at have testet forskellige forhold, besluttede vi at bruge POPC og DSPE-PG8MG forhold på 85 and15 (mol%).

Intracellulær Lokalisering af pH-liposomer

For at undersøge cellulær optagelse og intracellulær lokalisering af pH-liposomer syntetiserede vi rhodamin-mærkede pH-følsomme tomme liposomer (Rhodaminfarvestof blev kovalent konjugeret til lipiderne under syntese) som beskrevet i materialer og fremgangsmåder. Bugspytkirtelkræftceller MiaPaCa-2 blev inkuberet med rhodamin-mærkede liposomer i 4 timer og liposomalt fluorescens blev undersøgt med et fluorescensmikroskop. Som vist i figur 2A, blev punktformig fluorescens observeret ved en perinukleær region indikerer lysosomal lokalisering. Dette punkt blev bekræftet ved brug af Lysosensor Green DND-189 (Life Technologies). Lysosensor Green DND-189 udviser grøn fluorescens, når inde intracellulære sure rum, såsom lysosomer. Co-lokalisering af røde rhodamin fluorescens og grøn Lysosensor fluorescens blev observeret, hvilket bekræfter lysosomal lokalisering af liposomerne. Således liposomer synes at akkumulere i lysosomer, når de tages op af celler.

GGTI liposomer blev fremstillet og derefter udsat for opløsning justeret til forskellige pH-værdier i 15 minutter og frigivelsen af ​​GGTI blev undersøgt ved HPLC. TritonX-100 blev anvendt som en kontrol fuld frigørelse. Symbolet * angiver statistisk signifikant forskel på P-værdi 0.05.

Drug Loading og Release

liposomets belastningseffektivitet af narkotika og farvestoffer blev testet ved at blande med liposomer, ved hjælp af Sepharose 4B kolonne for at fjerne frie lægemidler og slippe indhold fra liposomer ved Triton X-100. GGTI koncentrationen blev målt ved sammenligning med en standard GGTI prøve ved LC-MS. Vi skønnede, at lasteevne GGTI i liposomer er cirka 30% af den samlede GGTI. For at undersøge størrelsen af ​​rekonstituerede liposomer, underkastede vi GGTI liposomer til dynamisk lysspredning (DLS) måling. Som det kan ses i figur 2B, fandt vi, at størrelsen af ​​de GGTI liposomer varierede fra 46 til 65 nm i diameter med en gennemsnitlig størrelse på 54,9 nm. Vores præparat har således en relativt snæver størrelsesfordeling.

Frigivelse af GGTI fra liposomer blev undersøgt ved lastning GGTI, indsamling GGTI liposomer og frigive indholdet ved at udsætte til PBS-buffer med forskellige pH-værdier i området fra 4,5 til 8. Som vist i fig 2C, liposomer tilbageholdes GGTI inde stramt på neutrale eller basiske buffere. blev observeret lille frigivelse af GGTI ved et pH-område 6-8. Men når pH var under 6, blev der observeret et betydeligt udslip af GGTI fra liposomer. Ved pH 5,5, blev mere end 80% af loaded GGTI frigivet. Tilsvarende blev næsten fuldstændig frigivelse observeret ved pH 5 og ved pH 4,5 (ikke vist). Disse resultater antyder, at de pH-følsomme liposomer effektivt blev destabiliseret ved sure betingelser. En skarp overgang mellem pH 5,5 og pH 6 antyder, at denne type liposom tilvejebringer et egnet vehikel til intracellulær kontrolleret frigivelse.

Lav pH-afhængig levering af Loaded Dye inde i cellen

doxorubicin loaded liposomer blev anvendt til at undersøge intracellulær kapacitet lægemiddelfrigivelse, da doxorubicin udsender stærk rød fluorescens under UV-excitation. Efter eluering fra en Sepharose 4B-søjle for at fjerne frie lægemidler blev en homogen suspension af doxorubicin-liposomer tilsættes til brystkræft MCF-7-celler, der var dyrket i en otte-brønds glas kammer. 6 timer efter inkubation blev cellerne vasket og undersøgt med fluorescensmikroskopi af billedet fordelingen af ​​doxorubicin i cancerceller. Cellerne behandlet med doxorubicin udviste stærk rød fluorescens (fig 3A) i cytosolen og i kerner. Dette svarede til det observeret med celler behandlet med frit doxorubicin (data ikke vist). På den anden side, kontrolceller behandlet med liposomer uden doxorubicin forblev ikke-fluorescerende

A:. Fluorescerende mikroskopi billeder af MCF7-celler inkuberet med doxorubicin-fyldte liposomer i 6 timer (rød fluorescens). Kontrolceller modtog ikke liposomer. B: Frigivelse af pyranin farvestof i MiaPaCa-2-celler undersøges ved sin fluorescens med eller uden behandling med bafilomycin A1. Fasekontrast billede skal vises. C:. Virkninger af bafilomycin A1 på pH af intracellulære organeller vises med Acridin Orange

De ovennævnte eksperimenter viser, at liposomer kan belastes med farvestoffer og lægemidler og succes og effektivt levere indhold til kræftceller. Vi ønskede at yderligere at karakterisere pH-afhængig funktion af liposomerne inde i cellen med lav frigivelse. For at undersøge dette punkt anvendte vi pyranin farvestof liposomer og behandlede celler med bafilomycin, et stof som ændrer lysosomal pH. Bafilomycin A1 (Baf) er en specifik inhibitor af den intracellulære vakuolær proton pumpe, inhibering forsuring af vakuolær system, såsom endo /lysosomer, således øge lysosomal pH [41,42]. Bugspytkirtelkræftceller MiaPaCa-2 blev behandlet med 160 nM Baf i 6 timer og derefter pyranin dye liposomer blev føjet til cellerne. Cellerne blev inkuberet i yderligere 12 timer før undersøgelse ved fluorescensmikroskopi. Som vist i fig 3B, behandling med Baf forhindres fuldstændigt intracellulær frigivelse af pyranin, demonstreret ved manglen på farvning, sammenlignet med den lyse grønne fluorescens af cellerne ueksponerede til Baf. For at bekræfte effekten af ​​Baf på afsyring af endosomer, blev acridinorange (AO) farvning udføres. AO er en fluorescerende svag base, der ofte bruges som en sonde til overvågning af forsuring af organeller. I neutrale eller alkaliske miljøer dette farvestof udsender grøn fluorescens, men når de udsættes for sure rum, det er ioniseret og dens emission gennemgår en rødforskydning. I de ubehandlede celler, blev rød fluorescens observeret inde diskrete cytoplasma organeller, hvilket indikerer, at AO havde akkumuleret i sure organeller (fig 3C). Men den røde fluorescens dramatisk faldt efter 6 timers Baf behandling, hvilket indikerer, at Baf havde øget pH endosomerne i MiaPaCa-2-celler. Disse resultater tyder på, at frigivelsen af ​​farvestof fra liposomerne er afhængig af lav pH forhold i intracellulære organeller.

liposomalt GGTI inhiberer Protein geranylgeranylering inde i cellen, og denne effekt er afhængig af lav pH på Lysosomer

GGTI frigivelse og effektivitet til at hæmme protein geranylgeranylering inde kræftceller blev undersøgt. Fig 4A viser, at leveringen af ​​GGTI af liposomer i, inhiberingen af ​​protein geranylgeranylering inde i cellen. I dette eksperiment blev MiaPaCa-2-celler behandlet med liposomal-GGTI i 3 timer, og proteiner blev opsamlet fra cellelysatet til Western-analyse. Som vist behandling af celler med enten GGTI P61-A6 alene eller GGTI-loaded liposom førte til udseendet af unprenylated Rap1 band, hvilket indikerer, at liposomer levere og frigive GGTI forbindelse inde i cellerne for at funktionere og inhiberede protein geranylgeranylering. Da pH-liposomer udviser signifikant destabilisering under pH 6, som svarer til pH endolysosome interiør, pH-liposomer var sandsynligvis blive destabiliseret eller kondenseret med endosomale membraner resulterer i frigivelse af lægemidlet lasten i cytosol, inhibering GGTase-I og blokerer Rap1 prenylering. For at undersøge pH-følsomhed GGTI frigivelse, blev det samme forsøg gentaget efter behandling af cellerne med pH-ændring forbindelse bafilomycin A1. Som vist i fig 4A, behandling med bafilomycin A1 afskaffet effekten af ​​liposomale GGTI på Rap1 prenylering. Dette er i overensstemmelse med tanken om, at øget pH lysosomer ændret ved bafilomycin A1 kunne ikke destabilisere pH-liposomer længere, derfor GGTIs blev holdt inde i liposomer. Derfor, når der optages af cellerne, surhedsgrad endosomer er kritisk for destabilisering og /eller fusion af pH-liposomer med endolysosome til effektiv udledning og overførsel af indholdet i cytosol.

liposomalt GGTI Årsager Hæmning af spredning af bugspytkirtlen og Lung Cancer Cells

effekten af ​​lægemiddeladministration fra pH-liposomer blev undersøgt med celleproliferationsassay. Pankreatisk cancercellelinie MiaPaCa-2 blev behandlet med ubelastede liposomer, GGTI liposomer eller frie GGTI (samme volumen i puffer) med forskellige koncentrationer i 72 timer. Som vist i fig 4B, blev signifikant inhibering af proliferation observeret med GGTI-loaded liposom. Denne hæmning var tilsvarende eller bedre end den, der ses med gratis GGTI. I modsætning hertil tomme liposomer ikke påvirke celleproliferation, selv ved 180 ug /ml. Liposomerne selv synes at være ikke-toksiske ved disse koncentrationer.

En af de vigtigste elementer i GGTI er, at de inducerer cellecyklusstop på G1 fasen. For at undersøge, om dette gælder til celle effekter ved hjælp af liposomal GGTI blev cellerne behandlet med liposomal GGTI analyseret ved flowcytometri. Som vist i fig 4C, behandling af MiaPaCa-2-celler med enten GGTI opløsning eller Lipo-GGTI i 24 timer forårsagede berigelse af G1-fase celler, mens procentdelen af ​​S-fase celler blev reduceret med disse behandlinger. Procentdel af G2-celler blev kun ændret sig lidt.

Vi har tidligere vist, at GGTI inducerer ekspression af et cellecyklus regulator p21

CIP1 /WAF1 [7]. Induktion af denne cyclinafhængige kinaseinhibitor medfører akkumulation af G1-fase celler. Vores tidligere undersøgelser viste, at RhoA er et af de vigtigste mål for GGTI og at RhoA undertrykker p21

CIP1 /WAF1 udtryk. For at undersøge om liposomal-GGTI inducerer p21

CIP1 /WAF1 udtryk, vi behandlede MiaPaCa-2 celler med liposomalt GGTI og udført Western-analyse. Som vist i figur 4D, signifikant induktion af p21

CIP1 /WAF1 blev observeret af behandlingen med liposomal GGTI.

I vores tidligere undersøgelser, viste vi, at GGTI P61A6 hæmmede både bugspytkirtlen og lungekræft celler i dyr modeller vi derfor også testet liposomal GGTI med forskellig lung cancercellelinjer, H596, H358 og A549 samt med normal bronchial epitelcellelinie BEAS-2B. Som vist i figur 5, sammenlignet med losset liposomer viste liposom-GGTI signifikant celleproliferation inhibering med en række ikke-små testede lungekræft cellelinier. Liposomale GGTI undertrykt ca. 60-80% af celleproliferation, mens den samme koncentration af tomme liposomer ikke gjorde. Interessant nok viste det normale humane bronkieepitel cellelinje BEAS-2B uventet stor modstandsdygtighed mod liposomal GGTI forhold til lungecancerceller. Mekanismen for denne modstand er fortsat ukendt og garanterer yderligere undersøgelse.

Cell numre efter 72 timer ‘behandlinger er vist i procent af ubehandlede celler. Tomme liposomer påvirker ikke spredning. Symbolet * angiver statistisk signifikant forskel på P-værdi 0.05.

Liposomale GGTI synergistisk med FTI (farnesyltransferase inhibitor) til at hæmme spredning af K-Ras Aktiveret Cancer Cells

Ovenstående resultater tyder på, at liposomal-GGTI er en ny type anticancer lægemidler, der har potentiale til at blive leveret til tumoren. Dette åbner mulighed for, at den kan anvendes til at inhibere K-Ras-signalering, der aktiveres i et antal humane cancertilfælde herunder pancreas, lunge og tyktarmskræft. Ras familie proteiner, især K-Ras, kan alternativt prenyleres ved enten FTase eller GGTase-I [43-45].