PLoS ONE: Blood-Based Protein Biomarker Panel til påvisning af kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

De fleste af kolorektal cancer (CRC) tilfælde kan forebygges ved tidlig opsporing og fjernelse af præcancerøse polypper. Selvom CRC er den anden mest almindelige indre kræft i Australien, kun 30 procent af befolkningen anses for at have risikofaktorer deltage i fæces-baseret test screeningsprogrammer. Beviser indikerer en robust, blod-baseret, diagnostisk analyse ville øge screening overholdelse. En række potentielle diagnostiske blodbaserede protein biomarkører for CRC er blevet rapporteret, men mangler alle sensitivitet eller specificitet til anvendelse som en stand-alone diagnostisk. Formålet med denne undersøgelse var at identificere og validere et panel af protein-baserede biomarkører i selvstændige kohorter, som kunne oversættes til en pålidelig, ikke-invasiv blod-screening test.

vigtigste resultater

i to uafhængige kohorter (n = 145 og n = 197), vi evalueret syv enkelt biomarkører i serum af CRC patienter og alder /køn matchede kontroller, der viste en signifikant forskel mellem kontrol og CRC, men individuelt mangler følsomheden til diagnostisk anvendelse. Ved hjælp af logistisk regression strategier, identificerede vi et panel af tre biomarkører, der diskriminerede mellem kontroller og CRC med 73% sensitivitet ved 95% specificitet, når de anvendes på nogen af ​​de to kohorter. Dette panel består af Insulin vækstfaktor bindende protein 2 (IGFBP2), Dickkopf-3 (DKK3), og pyruvat kinase M2 (PKM2).

Konklusioner

På grund af den heterogene karakter CRC en enkelt biomarkør er usandsynligt at have tilstrækkelig følsomhed eller specificitet til anvendelse som en stand-alone diagnostisk screeningstest og et panel af markører kan være mere effektive. Vi har identificeret en 3 biomarkør panel, der har højere sensitivitet og specificitet for tidligt (fase I og -II) sygdom end den afføringen blodprøve, øge muligheden for dets anvendelse som en ikke-invasiv blod diagnostisk eller screening test.

Henvisning: Fung KYC, Tabor B, Buckley MJ, Priebe IK, Puriņš L, Pompeja C, et al. (2015) Blood-Based Protein Biomarkør Panel til påvisning af kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (3): e0120425. doi: 10,1371 /journal.pone.0120425

Academic Redaktør: Jörg D. Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, TYSKLAND

Modtaget: September 24, 2014 Accepteret 22. januar 2015; Udgivet: 20 Marts 2015

Copyright: © 2015 Fung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af CSIRO Forebyggende Health National Research Flagship og National Health og Medical Research Council (tilskud nummer 1.017.078) (https: //www. nhmrc.gov.au/) til LJC. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje mest almindelige kræftform diagnosticeret på verdensplan, hvor det udgør ca. 10% af alle kræftdiagnoser og har en anslået årlig dødelighed i løbet af 600.000 [1]. Lande som Australien, New Zealand, Europa, USA og Storbritannien er rapporteret at have den højeste forekomst af sygdom, men er forekomsten stigende i lande som Japan og de af Østeuropa. De fleste tilfælde (op til 80%) er sporadisk, hvor miljø- og livsstilsfaktorer menes at spille en rolle i udviklingen [2]. CRC er en heterogen sygdom, der udvikler sig via en akkumulering af genetiske mutationer og epigenetiske ændringer i tyktarmsepitelet der i sidste ende resulterer i neoplastisk transformation [3-5]. Den langsomme og gradvise karakter af denne proces giver mulighed for at gennemføre screeningsprogrammer og diagnostiske værktøjer til tidlig påvisning af sygdommen, der har potentiale til at reducere forekomsten og dødeligheden i forbindelse med CRC. I et forsøg på at reducere forekomsten og at påvise sygdommen i sin vorden, før symptomerne er tydelige, er screeningsprogrammer blevet gennemført i mange lande, herunder USA, Storbritannien, Australien, Japan, og Europa [6-8].

i øjeblikket er de mest anvendte diagnostiske værktøjer omfatter endoskopiske procedurer såsom koloskopi og sigmoideoskopi, og guaiac-baserede fækal okkult blod test (gFOBT) eller immunokemiske afføringen blodprøve (iFOBT), også kendt som den fækale immun test ( FIT) [9]. Mens koloskopi og sigmoideoskopi er de mest følsomme procedurer for påvisning af kolorektale tumorer og forstadier til kræft (adenomer og polypper), og kan være potentielt helbredende hvis polypper er fjernet, disse procedurer er vanskelige at gennemføre på en population-plan på grund af omkostningerne, invasionsevne , ekspertise, og tidskrævende karakter på grund af tarm forberedelse kræves [10,11]. Mens billig og ikke-invasiv, den FOBT og FIT har lavere sensitivitet og specificitet end koloskopi (dvs. disse tests har højere falsk positive satser) og er mest succesfulde til at opdage sent stadie sygdom [10,12]. Desuden den diagnostiske ydeevne FOBT og FIT er variabel, med rapporterede følsomheder for CRC mellem 11-64% for gFOBT (79-98% specificitet) og 56-89% for FIT (83-97% specificitet) [13]. Disse tests er også ofte kompromitteret af dårlig overholdelse patient, variationer i analytiske procedurer såsom forskellige metoder til afføring indsamling og håndtering, behovet for flere prøveemner, og variationer i fortolkningen af ​​testresultater [13,14]. I øjeblikket er det kun gFOBT vist sig at reducere CRC dødelighed i store prospektive randomiserede kliniske forsøg [8,13].

Mange undersøgelser er blevet offentliggjort rapportering biomarkører, der kan gennemføres som en ikke-invasiv test til påvisning af CRC , især i de tidlige stadier (stadium i og /eller præmaligne sygdom). En række strategier til identifikation af blod-baserede protein-biomarkører er blevet rapporteret i litteraturen, herunder proteomik og /eller genekspression analyse af colorektal tumorvæv og udskilte proteiner. Selv om nogle af disse studier har identificeret mulige paneler af proteiner eller gener egnede til CRC detektion [15-19], data fra opfølgende undersøgelser, for eksempel i større grupper patient, er ikke tilgængelige. I øjeblikket er de mest lovende biomarkører synes at være DNA methylering markører, herunder methyleret septin 9 (mSEPT9) målt i blod [20-23] og en taburet-baserede DNA-test består af methyleret BMP3, NDRG4, VIM, og TFPI2 og en mutant form af KRAS [24]. For nylig blev en modificeret taburet-baserede DNA-test består af methyleret BMP3 og NDRG4, mutante KRAS og ß-actin som kontrol i kombination med fækal hæmoglobin testet i en asymptomatisk screening population bestående af 9.989 patienter [25]. Det blev bemærket, at DNA-test havde lavere specificitet, en højere falsk positiv rate og led af en højere teknisk fejlrate på grund af sin komplekse karakter, der kan hæmme dens gennemførelse som en befolkning bred screeningstest. Selvom afføring-baserede DNA-tests har vist lovende resultater for CRC påvisning i kliniske forsøg, er de endnu ikke gennemført i klinisk praksis eller som en population-wide screening.

På grund af den heterogene karakter af CRC, en enkelt biomarkør er usandsynligt at have tilstrækkelig følsomhed eller specificitet til anvendelse som en stand-alone diagnostisk screeningstest og et panel af markører kan være mere effektive. Tidligere evaluerede vi ydeevne og egnethed 32 protein biomarkører i serum og /eller plasma af kolorektal kræftpatienter og normale kontroller [26] for deres evne til at diagnosticere CRC. Selv om denne analyse identificeret 12 protein biomarkører, der afveg betydeligt mellem de to grupper, ingen protein havde tilstrækkelig følsomhed og specificitet til brug som en stand-alone diagnostisk. Vi identificerede også potentielle biomarkør kombinationer repræsenterer forskellige aspekter af sygdommen proces, der kan føre til en diagnostisk test til CRC. Her rapporterer vi om evalueringen af ​​syv af disse protein biomarkører (IGFBP2, PKM2, DKK3, MAC2BP, væv inhibitorer af metalloproteinaser 1 (TIMP1), Interleukin 8 (IL8) og Interleukin 6 (IL6) som en potentiel diagnostisk eller screening test for CRC .

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle forskningsaktiviteter protokoller, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af de relevante menneskelige Forskning etiske komitéer på Commonwealth Scientific Industrial Research Organisation, Adelaide (CFNS Menneskelig Research etiske komité-Forslag 17/03 (a) (b)), og Royal Melbourne Hospital, Melbourne (HREC projekt 2003,145 . 2003,146) Skriftlig informeret samtykke blev opnået fra hver patient før blodprøve samling

prøvetagning

Patienter blev nydiagnosticerede tilfælde af CRC med ingen tidligere sygdom. Blod blev opnået forud for kirurgi ved kolorektal kirurgi preadmission klinikker fra et netværk af hospitaler, der er forbundet med den victorianske Cancer Biobank, Melbourne, Victoria, Australien, mellem 2005 og 2011. Patienter, der allerede havde fået kemo- og /eller radio- terapi blev udelukket fra denne undersøgelse. For CRC patienter blev blodprøver taget efter diagnose og mindst én dag før operation. Iscenesættelse blev udført i overensstemmelse med den TNM klassificering for colon og rektal cancer [27].

Serumprøver fra CRC patienter og alder /køn matchede kontroller blev indsamlet ved hjælp af en standardprocedure, som beskrevet tidligere [28,29]. Blod blev opsamlet i serum gelrør (Scientific Specialties Inc., USA), og hver prøve fik lov at henstå ved stuetemperatur i 30 minutter før centrifugering (1,200g, 10 min, stuetemperatur). Serum fraktion blev derefter overført til rene 15 ml rør og centrifugeret igen (1,800g, 10 min, stuetemperatur) forud for at blive aliquotted (250 pi) og opbevaret (-80 ° C). Alle prøver blev behandlet og opbevaret inden for 2 timer efter opsamling

Biomarker analyse og identifikation af biomarkør panel

Følgende biomarkører blev målt ved hjælp af kommercielt tilgængelige ELISA-kits i henhold til de respektive producentens protokoller:. IGFBP2 (Diagnostic Systems Laboratories, USA eller Demeditec Diagnostics GmbH, Tyskland), MAC2BP (Bender Medsystems GmbH, Østrig), PKM2 (Schebo Biotech, Tyskland), DKK3 (R 0,0001) og 59% (p 0,0001) ved 95% specificitet for CRC samlet målt i uddannelses- og test kohorter, hhv. Tilsvarende PKM2 viste sig også at være den mest succesfulde markør på at identificere CRC på hver sygdom stadiet sammenlignet med kontrollen befolkning i denne særlige undersøgelse, herunder tidlig fase sygdom (følsomhed 48% (p = 0,0008), 52% (p 0,0001 ), 61% (p 0,0001) og 75% (p 0,0001) for trin i, II, III og IV, henholdsvis i uddannelsen kohorten og følsomhed 52% (p 0,0001), 65% (p 0,0001) , 54% (p 0,0001) og 80% (p 0,0001) til trin i, II, III og IV, respektivt i testen kohorten) (S1 tabel). Præstationsegenskaber enkelte biomarkører i uddannelses- og test årgange kan findes i S1 tabel. Når betragtes individuelt, ingen af ​​disse biomarkører havde tilstrækkelig følsomhed til at diagnosticere CRC. Vejviser

Identifikation af en tre-biomarkør panel til CRC diagnose

Brug fremad trinvis logistisk regression anvendes på uddannelse datasæt (Kohorte 1), en tre biomarkør model, som består af DKK3, PKM2 og IGFBP2 blev identificeret som kunne diagnosticere CRC med 73% sensitivitet på 95% specificitet (tabel 4). Desuden er denne tre-biomarkør model viste sig at være robust, når valideret i testen kohorten (Kohorte 2, følsomhed på 73% ved 95% specificitet), og var i stand til at skelne mellem kontroller og CRC patienter på forskellige TNM stadie med tilsvarende følsomhed (tabel 4). Vigtigere er det, denne biomarkør model er i stand til at identificere patienter med tidlig stadie sygdom med høj følsomhed (dvs. 57% og 76% sensitivitet, ved 95% specificitet for trin I og II henholdsvis i træningen kohorten og 59% og 84% for fase i og II henholdsvis i testen kohorten). Fig. 1 viser ROC-kurven for de tre-biomarkør modellen og ydeevne af modellen er beskrevet i tabel 4.

Diskussion

Tidligere vi målte 32 protein biomarkører i plasmaet og sera fra CRC-patienter og kontroller [26]. Disse biomarkører blev indledningsvis identificeret som potentielt nyttige for CRC diagnose baseret på biologi, genekspression microarray og proteom data, fra såvel egne undersøgelser og fra litteraturen. I vores tidligere undersøgelse, målte vi PKM2 i plasma og besluttet, at det havde 19% følsomhed (ved 95% specificitet) henviser i serum vi observerede følsomhed på 56% ved 95% specificitet. Når den måles i serum, PKM2 var den bedste resultater biomarkør for CRC diagnose sammenlignet med de andre biomarkører vi målte. Desuden var det også den bedste ydende markør, når der skelnes tidligt stadie sygdom (48% følsomhed). Som en yderligere forlængelse af denne undersøgelse, har vi foretaget yderligere evaluering af syv af disse proteiner i to uafhængige tilfælde kontrol kohorter (Kohorte 1 og 2). Vi har endvidere identificeret et panel af tre protein-biomarkører, der er i stand til at diagnosticere CRC fra en kontrolpopulation med 73% sensitivitet ved 95% specificitet i både træning (n = 145) og test (n = 197) kohorter i vores undersøgelse. Selv om disse indledende undersøgelser er lovende, er vi i øjeblikket foretager yderligere undersøgelser af vores biomarkør panel i en patient kohorte, som omfatter ikke-maligne kolorektale sygdomme (for eksempel inflammatorisk tarmsygdom, diverticulutis), adenomer, godartede og /eller forstadier polypper og andre kræftformer. Dette vil gøre det muligt for os at bestemme specificiteten af ​​panelet for CRC detektion og dens følsomhed for tidligt eller præmaligne sygdom.

Vores tre biomarkør panel består af IGFBP2, DKK3 og PKM2, og hver af disse proteiner er kendt for at være biologisk vigtige i CRC sygdom og progression og er repræsentative for den heterogene karakter af denne kræft. For eksempel er der talrige rapporter indikerer inddragelse af IGFBP2 i proliferation, migration og invasion af cancerceller [31], og forhøjede niveauer af IGFBP2 er også rapporteret i serum og plasma fra CRC patienter sammenlignet med normale kontroller [32- 35]. Transkriptionel nedregulering af DKK3 grund promotor hypermethylering i CRC væv er blevet rapporteret [36,37], og dette kan forklare de nedsatte niveauer i serum fra CRC patienter, vi observeret i denne undersøgelse. Imidlertid har en forhøjet protein ekspressionsniveau i endotelcellerne af mikrokar i cancervæv også rapporteret indikerer den potentielle betydning af DKK3 i CRC progression, grundet angiogenese og neovaskularisering [38]. PKM2 er et cytosolisk enzym involveret i energistofskiftet der udtrykkes af både normal prolifererende celler og cancerceller. Forhøjet ekspression af det tumor-specifikke dimere form af dette protein er blevet rapporteret i CRC og andre gastrointestinale cancere [39-41] og talrige undersøgelser har evalueret dens anvendelighed som en fækal eller blod-baserede markør for CRC screening og /eller diagnose [40 , 42-46]. Den primære ulempe vedrørende dets anvendelighed som en stand-alone diagnostisk markør har været dens dårlige specificitet for CRC.

Udførelsen af ​​tre-biomarkør model, som består af IGFBP2, DKK3 og PKM2 (73% sensitivitet ved 95% specificitet ) svarer til citeret for FOBT og FIT (følsomhed 61-79% ved 86-95% specificitet) [12,14,47-49]. Endvidere panelet af biomarkører, som vi har identificeret synes at fungere godt for sygdommens tidlige stadium detektion (dvs. trin I og II sygdom). Denne overlegne ydeevne på tidlige stadier, især på trin I, er en vigtig fordel af vores biomarkør panel i øjeblikket anvendes ikke-invasive tests for CRC. Dette er en vigtig overvejelse siden begyndelsen sygdom afsløring og passende patient management forbedrer den generelle overlevelse for denne sygdom. Yderligere testning af panelet i en stor prospektivt kohorte, som omfatter patienter med høj risiko adenomer eller polypper, er nødvendig for fuldt ud at forstå potentialet nytte af vores panel til diagnostiske eller screening formål. Det er også muligt, at biomarkør Panelet kan anvendes i kombination med nuværende screening fremgangsmåder, f.eks FOBT, FIT, eller de nyligt rapporterede plasma mSEPT9 test eller taburet-baserede DNA-markører [20-24] for yderligere at forbedre diagnostiske resultater.

Selv om det er kendt, at screeningsprogrammer kan reducere dødeligheden af ​​CRC, spirende tegn på, at en ikke-invasiv blod-baserede test med høj sensitivitet og specificitet for sygdommen, især tidligt stadium sygdommen, kan være en fordel at overvinde opfattet hindringer for deltagelse i forbindelse med brugen af ​​FOBT [50,51]. Mens ikke-invasiv, det FOBT er ikke specifik for CRC, og det er ikke i stand til nøjagtigt at detektere sygdommens tidlige stadium. Endvidere er værdien af ​​denne test hæmmet af dårlig patientefterlevelse [50]. Data fra undersøgelser, der vurderer patientens præference for blod test versus endoskopi, herunder koloskopi eller sigmoideoskopi, er ikke tilgængelige. Men studerer undersøger patient præference mellem FOBT og koloskopi viser modstridende resultater. For eksempel Schroy et al. indikerer, at patienter har en præference for fækal undersøgelse for rutinemæssig screening grundet dens bekvemmelighed og ikke-invasiv art [52]. En anden undersøgelse af Hol et al. konkluderede, at screening ved hjælp af endoskopi teknikker var at foretrække blandt en screening befolkning på grund af sikkerhed for diagnosticering og reduktion i risikoen for sygdom [53]. Dette indikerer, at der kan gennemføres med succes i samfundet, høj følsomhed og specificitet til præcist og pålideligt diagnosticere CRC og informere patientens opfølgende procedurer er vigtige elementer i enhver diagnostisk test, der skal overvejes.

Støtte Information

S1 fig. Scatter grunde til de syv biomarkører evalueret i uddannelses- og test kohorter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120425.s001

(PDF)

S2 Fig. Modtager operatør karakteristiske kurver for de syv biomarkører evalueret i uddannelses- og test kohorter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120425.s002

(PDF)

S1 tabel. Ydeevnekarakteristika for de enkelte biomarkører i uddannelses- og test kohorter

doi:. 10,1371 /journal.pone.0120425.s003

(PDF)

Tak

Forfatterne vil gerne takke victorianske Cancer Biobank (Melbourne, Victoria) for deres hjælp med prøvetagning.