PLoS ONE: Hypoxi inducerer Autophagy gennem Translationel opregulering af Lysosomale Proteiner i Human Colon Cancer Cells

Abstrakt

Hypoxi forekommer i en lang række fysiologiske og patologiske tilstande, herunder tumorigenese. Tumor celler har til at tilpasse sig hypoxi ved at ændre deres genekspression og proteinsyntese. Her viste vi, at hypoxi hæmmer translation gennem aktivering af PERK og inaktivering af mTOR i human tyktarmskræft HCT116 celler. Langvarig hypoxi (1% O

2, 16 timer) dramatisk hæmmer generel oversættelse i HCT116 celler, forbliver endnu udvalgte mRNA translateres effektivt under en sådan tilstand. Brug af microarray analyse af polysome- forbundet mRNA’er, der er konstateret vi et stort antal hypoxi-regulerede gener på det translationelle niveau. Translateres effektivt mRNA’er under hypoksi blev godkendt af polysom ​​profilering og kvantitativ real-time RT-PCR. Pathway berigelse analyse viste, at mange af de opregulerede gener er involveret i lysosomer, glycan og lipidmetabolisme, antigenpræsentation, celleadhæsion og remodellering af den ekstracellulære matrix og cytoskelet. Størstedelen af ​​nedregulerede gener er involveret i apoptose, ubiquitinmedieret proteolyse, og oxidativ phosphorylering. Yderligere undersøgelser viste, at hypoxi inducerer lysosomal autophagy og mitokondriel dysfunktion gennem translationel regulering i HCT116 celler. Den overflod af adskillige oversættelse faktorer og mTOR-aktivitet er involveret i hypoxi-induceret mitokondrie autofagi i HCT116 celler. Vores undersøgelser fremhæve betydningen af ​​translationel regulering for tumor celle tilpasning til hypoxi

Henvisning:. Lai MC, Chang CM, Sun HS (2016) Hypoxi inducerer Autophagy gennem Translationel opregulering af Lysosomale Proteiner i Human tyktarmscancerceller . PLoS ONE 11 (4): e0153627. doi: 10,1371 /journal.pone.0153627

Redaktør: Vladimir Trajkovic, School of Medicine, University of Beograd, Serbien

Modtaget: November 2, 2015; Accepteret: April 2, 2016; Udgivet: 14 April, 2016

Copyright: © 2016 Lai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi, Taiwan (NSC100-2320-B-006-021-MY3 til MCL og NSC101- 2627-B-006-005 til HSS) og Chang Gung Memorial Hospital, Taiwan (CMRPD3E0012). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige cancerformer hos mennesker. Hvert år bliver mere end 1 million patienter diagnosticeret med CRC i verden. Forekomsten af ​​CRC er steget støt i de sidste 20 år [1]. Studier af CRC har givet værdifuld indsigt i flertrins genetiske proces med carcinogenese [2, 3]. Størstedelen af ​​CRC er udløst af mutationer i adenomatøs polypose coli (

APC

) genet [4], som inducerer dannelsen af ​​tidlig adenom. Udviklingen af ​​tyktarmskræft er yderligere fremmet af en række genetiske mutationer, herunder

KRAS

,

Smad4

, og

TP53

, som muliggør adenom vækst og karcinom progression. En bedre forståelse af de molekylære mekanismer bag CRC progression kan fremme udviklingen af ​​nye kræftlægemidler. Gennem det seneste årti er flere nye molekylære mål i øjeblikket ved at blive undersøgt til behandling af CRC [5].

På grund af hurtig spredning og afvigende angiogenese, tumorer indeholder områder med forskellige grader af hypoxi [6]. Tumor celler har til at tilpasse sig hypoxisk stress ved at ændre deres genekspression og proteinsyntese [7]. Disse ændringer omfatter energimetabolisme, angiogenese, cellemigration, tumorinvasion og metastase, cellecyklusregulering, inflammatorisk respons, og pH regulering [8-10]. Tumor hypoxi menes at spille en central rolle i tumor progression og malignitet. Tilstedeværelsen af ​​hypoxiske celler i faste tumorer er associeret med en dårlig prognose i mange cancertyper [6]. Tidligere undersøgelser har vist, at hypoxiske tumorceller er mere modstandsdygtige over strålebehandling [11, 12] og mange almindeligt anvendte kemoterapeutiske midler [13]. Derfor er det værd at undersøge reguleringen af ​​genekspression i humane cancerceller under hypoxiske betingelser.

Som reaktion på hypoxi, cellerne hurtigt at øge niveauet af hypoxi-inducerbare faktor 1 (HIF-1) [14, 15], en heterodimer sammensat af en oxygen-sensitive HIF-1α underenhed og en konstitutivt udtrykt HIF-1β underenhed. HIF-1 regulerer ilt homeostase under hypoxi ved transkriptionelt målrette mere end 100 gener, som indeholder hypoxi-responsive elementer (hres) inden for deres initiativtagere [16, 17]. Foruden transkription, translation betragtes som en vigtig bidragyder til hypoxi-reguleret genekspression [18, 19]. Metaboliske undersøgelser mærkning viste, at hypoxi hæmmer global oversættelse i mange forskellige cellelinjer [20-23]. Generel oversættelse væsentligt hæmmet af akut iltmangel ( 0,02% O

2) eller langvarig hypoxi (≦ 2% O

2, 16 timer) [21, 22, 24-26]. Det er blevet rapporteret, at pattedyr mål for rapamycin (mTOR) og det endoplasmatiske reticulum bosat kinase (PERK) spiller en afgørende rolle i translationel regulering under hypoxi [26-28]. Hypoxi inhiberer kinaseaktiviteten af ​​mTOR og fører til dephosphorylering af translationsinitiering faktor 4E-bindende proteiner (4E-bps). Dephosphorylering af 4E-BPs øger deres bindende affinitet til oversættelsen indledning faktor eIF4E og dermed undertrykker cap-afhængige oversættelse ved at forstyrre sammenslutning af eIF4E med eIF4G. På den anden side, hypoksi inducerer den udfoldede protein respons (UPR), der opstår som følge af endoplasmatisk reticulum (ER) stress, og fører til aktivering af PERK [21, 24, 27]. Aktiveret PERK phosphorylerer eukaryot translationsinitiering faktor 2 subunit α (eIF2α) og inhiberer således translationsinitiering ved at forhindre dannelsen af ​​eIF2-GTP-tRNA (i) Met ternære kompleks [29].

Selvom generel oversættelse er i vid udstrækning hæmmet under hypoxi, forbliver udvalgte mRNA translateres effektivt under en sådan tilstand. Oversættelse af hypoxia-responsive gener kræver alternative mekanismer, såsom internt ribosomindtrængningssite (IRES) [30, 31] og opstrøms åben læseramme (uORF) [32]. IRES er en kompleks RNA strukturelt element, der initierer translation ved direkte rekruttere ribosomer til at finde startkodonen på et mRNA. Det menes, at hypoxi undertrykker cap-afhængig, men ikke IRES-medieret translationsinitiering [29]. Hypoxi-responsive gener HIF-1α og VEGFA har vist sig at opretholde translation gennem IRES under hypoxi [33, 34]. Men mekanismen for translationel regulering under hypoxi stadig ikke fuldt forstået, og den kan variere efter celletyper og hypoxiske betingelser.

Autophagy er en celle biologisk proces, der nedbryder unødvendige eller dysfunktionelle proteiner og organeller til opretholdelse næringsstoffer og energi homeostase under stress betingelser [35]. Det er blevet rapporteret, at hypoksi inducerer autophagy i en HIF-1-afhængig måde [36, 37]. Imidlertid translationel regulering spiller også en vigtig rolle i hypoxi-induceret autofagi. I denne undersøgelse, brugte vi polysom ​​profilering koblet til hele den menneskelige genom udtryk array til at identificere kandidatgener, hvis oversættelse er reguleret af hypoxi i human tyktarmskræft HCT116 celler. Funktionel annotation af kandidatgener viser, at hypoxi regulerer translation af mange gener involveret i lysosomer og forskellige metaboliske veje. Vi dokumenterer, at hypoxi inducerer autophagy gennem translationel opregulering af lysosomale proteiner i HCT116 celler. Vores undersøgelser understrege betydningen af ​​translationel regulering for tumor celle tilpasning til hypoxi.

Materialer og metoder

Cell kultur og hypoxiske behandling

HCT116 celler (ATCC

® CCL247

™) blev dyrket i MEM-medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i 5% CO

2 incubator. For hypoxiske (1% O

2) behandling blev cellerne overført til en specielt designet hypoxi kammer (NexBiOxy Inc., Hsinchu, Taiwan), som blev skyllet med 95% N

2 og 5% CO

2 ved 37 ° C

plasmider og transfektion

De plasmider, der udtrykker FLAG-mærket vildtype mTOR eller konstitutivt aktive mutanter (L1460P E2419K). blev købt fra Addgene (Cambridge, MA). Celletransfektion blev udført under anvendelse af transfektionsreagenset Lipofectamine

® 2000 (Thermo Fisher Scientific), i det væsentlige ifølge producentens instruktioner.

RNAi-medieret knockdown

Alle de plasmider der kræves for RNAi medieret knockdown blev leveret af National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taiwan). De to pLKO.1-shRNA vektorer anvendes til at knockdown alarmcentral og LAMP2 var som følger: TRCN0000217974 (shPSAP), og TRCN0000029263 (shLAMP2). Den transfektionsreagens Lipofectamin

® 2000 (Thermo Fisher Scientific) blev anvendt til at overføre plasmid DNA i HCT116-celler. Celler blev høstet 3 dage efter transfektion til analyse.

sucrosegradient sedimentation og polysom ​​profilering

celler blev opsamlet i koldt PBS indeholdende 100 ug /ml cycloheximid. Alle efterfølgende trin blev udført ved 4 ° C. Cellepellets blev resuspenderet i RSB-150 (10 mM Tris-HCI (pH 7,4), 3 mM MgCb

2, og 150 mM NaCl) indeholdende 100 ug /ml cycloheximid, 40 ug /ml digitonin (Calbiochem), 20 U /ml RNasin (Promega), og 1X proteaseinhibitorcocktail (Thermo Fisher Scientific). Efter inkubation på is i 5 min blev cellerne sprængt ved passage gennem en 26-gauge kanyle fem gange. Cytoplasmatiske ekstrakter blev opsamlet ved centrifugering ved 3000 x g i 2 minutter, og afklares ved yderligere centrifugering ved 11.000 x g i 15 minutter. Prøverne blev sat på en lineær 15-40% sucrosegradient og centrifugeret ved 38.000 rpm i 3 timer i en Beckman SW41 rotor. Efter centrifugering blev samlet RNA ekstraheret fra hver fraktion anvendelse af phenol /chloroform-ekstraktion i nærvær af 1% SDS og 0,25 M NaCl, efterfulgt af ethanoludfældning. For polysom ​​profil analyse blev gradienterne monitoreret ved 254 nm med en ISCO fraktioneringssystemet (Lincoln, NE).

immunblotting

Proteiner blev overført til en PVDF Transfer Membrane (PerkinElmer). Protein-blots blev blokeret med 3% skummetmælk i TBST-buffer (100 mM Tris-HCI (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,05% Tween 20) ved stuetemperatur i 1 time. De primære antistoffer omfattede kanin-anti-phospho-eIF2α (Ser51) (1: 1000 fortynding; Cell Signaling), muse-anti-eIF2α (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-phospho-4E-BP1 (Thr37 /46 ) (1: 1000 fortynding; Cell Signaling), muse-anti-4E-BP1 (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), muse-anti-β-actin (1: 2500 fortynding; Sigma-Aldrich), muse-anti-HIF- 1 a (0,2 ug /ml; BD Transduction Laboratories), gede-anti-Glut1 (1 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-VEGF (0,4 ug /ml; Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-LC3B (1: 1000 fortynding Cell Signaling), kanin-anti-P62 (1: 2000 fortynding MBL), kanin-anti-α-tubulin (1: 2000 fortynding; Cell Signaling), kanin-anti-GNS (1: 200 fortynding GeneTex), kanin-anti -PSAP (1: 1000 fortynding; GeneTex), muse-anti-TPP1 (1 ug /ml; Abcam), muse-anti-ATPB (0,5 ug /ml; Abcam), kanin-anti-LAMP2 (1: 1000 fortynding; GeneTex), kanin-anti-eIF4E (1 ug /ml; ABCAM) og kanin-anti-eIF4A1 (1 ug /ml; Abcam). Blots blev inkuberet med primære antistoffer i blokerende buffer ved stuetemperatur i 2 timer, efterfulgt af inkubation med HRP-konjugerede sekundære antistoffer ved stuetemperatur i 2 timer. Detektion blev udført ved hjælp af Immobilon vestlige Chemiluminescent HRP substrat (Millipore) til røntgenfilm eksponering.

microarray analyse

For microarray analyse, isoleret RNA blev ryddet op med RNeasy Mini (Qiagen) . Ca. 6 ug totalt RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af en oligo d (T) primer, der indeholder T7 RNA-polymerase promotorsekvens ved 3 ‘enden. Biotin-mærket komplementær RNA (cRNA) blev produceret af

in vitro

transkription efterfulgt af metal-induceret hydrolyse ved 94 ° C. Efterfølgende blev fragmenteret cRNA hybridiseret på Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array ved 45 ° C i 16 timer. Efterfølgende vask og farvning blev udført med en Fluidic Station-450 og GeneChips scannes med Affymetrix GeneChip Scanner 7G. Rå mikroarraydata blev yderligere analyseret under anvendelse GeneSpring GX 10 software (Silicon Genetics).

RT-PCR og kvantitativ real-time PCR

RT-PCR blev anvendt til at detektere mRNA-ekspression niveau. Ekstraherede RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits (Thermo Fisher Scientific) ifølge producentens instruktioner. Den resulterende cDNA blev underkastet konventionel PCR eller kvantitativ real-time PCR-analyse. Konventionel PCR blev udført ved anvendelse GoTaq DNA-polymerase (Promega) og forward og reverse primere: p-actin (fremadrettet primer (FP): 5’CATCCACGAAACTACCTTCAACT3 ‘og revers primer (RP): 5’TCTCCTTAGAGAGAAGTGGGGTG3’), HIF-1α (FP : 5’TGGACTCTGATC ATCTGACC3 ‘og RP: 5’CTCAAGTTGCTGGTCATCAG3 «), og VEGFA (FP: 5’CCTGGT GGACATCTTCCAGGAGTACC3’ og RP: 5’GAAGCTCATCTCTCCTATGTGCT GGC3″.) [38]

Kvantitativ realtids-PCR var udføres ved hjælp af StepOnePlus

™ realtids-PCR Systems ifølge leverandørernes anbefalinger (Thermo Fisher Scientific). Primere anvendt til kvantitativ realtids-PCR er anført i S1 tabel. Niveauerne af mRNA blev detekteret med Fast SYBR

® Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Kvantitativ analyse blev udført ved måling af Ct-værdier under den eksponentielle fase af amplifikationen. Relative kvantificeringsfremgangsmåder værdier blev beregnet ved hjælp af 2

-ΔΔCT metode [39].

Pathway berigelse analyse

Funktionel annotation af hypoxi-regulerede gener blev udført ved hjælp af den offentligt tilgængelige DAVID Bioinformatik Resources Version 6.7 software (https://david.abcc.ncifcrf.gov/) med Kyoto Encyclopedia of Gener og genomer (Kegg) pathway database. Den statistiske signifikans blev vurderet ved en modificeret Fishers eksakte test. P-værdi = 0 repræsenterer perfekt berigelse. P-værdi 0,05 anses stærkt beriget med annotation kategorier

Flowcytometrianalyse

Cellekulturer blev afgørende farvet med acridinorange. (AO, Sigma-Aldrich) ved en koncentration på 5 ug /ml i 15 minutter og derefter vasket med PBS. AO er et fluorescerende kationisk farvestof, der kan anvendes til at måle indholdet af sure vesikulære organeller (lysosomer) inden celler. Niveauerne af sure vesikulære organeller blev analyseret ved anvendelse af FACSCalibur (BD Biosciences) med excitation indstillet ved 488 nm, og emissionen fra fluorescerende AO blev påvist ved FL-3 kanal (670 nm).

mitochondriemembranpotential var bestemt under anvendelse af tetramethylrhodamin methylester (TMRM). Cellekulturer blev afgørende farvet med 0,5 uM TMRM i 30 minutter ved 37 ° C og derefter vasket med PBS. Fluorescensintensiteten af ​​TMRM blev analyseret ved anvendelse af flowcytometri med FL-2 kanal (564 ~ 606 nm). Prøverne blev analyseret ved hjælp CellQuest Pro 4.0.2 software (BD Biosciences) og kvantificering blev udført ved hjælp WinMDI 2.9 software (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA).

LYSOTRACKER farvning

lYSOTRACKER Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific) anvendes til at undersøge biosyntese og akkumulering af lysosomer ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt blev HCT116 celler dyrket på dækglas mærket med LYSOTRACKER Red DND-99 (1: 5000 fortynding) i 1 time under vækstbetingelser. Efter mærkning blev cellerne vasket med koldt PBS og fikseret med 3% formaldehyd i PBS i 30 min. Efter grundig vask med PBS anbragtes prøverne umiddelbart og observeret ved anvendelse af et inverteret fluorescensmikroskop (Zeiss Axio Observer A1, Tyskland) udstyret med et CCD-kamera.

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som middel ± standardfejl og analyseret under anvendelse af GraphPad Prism 4.0 software (GraphPad software Inc., La Jolla, CA, USA). Statistisk analyse blev udført under anvendelse af en uparret t-test. P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Generelt oversættelse er modtagelige for iltmangel i HCT116 celler

Det er blevet rapporteret, at generel oversættelse hæmmes af hypoxi. i forskellige celletyper, men hypoxi-responsive gener kan undslippe fra translationelle undertrykkelse under hypoxi [32-34, 40]. Her udførte vi polysom ​​profilering og RT-PCR til påvisning polysomalt distributionen af ​​specifikke mRNA’er. MRNA /ribosom komplekser blev separeret i 11 fraktioner under anvendelse af en lineær 15-40% saccharosegradient centrifugering (Fig 1A). Fordelingen af ​​en mRNA inden for de polysomalt fraktioner er reflekterende af dens translationelle effektivitet. Første anvendte vi forskellige kolorektale cancercellelinjer at undersøge virkningerne af hypoksi på oversættelse og observeret, at langvarig hypoksi (1% O

2, ≧ 16 h) forårsagede en dramatisk inhibering af generel translation i HCT116 celler (S1 Fig). Translationseffektivitet af housekeeping-gen p-actin ændringer fra ~ 60% til ~ 30% inden for 16 timer af eksponering for hypoxi (fig 1B). Fordi Perk og mTOR kinaser er blevet foreslået som vigtige faktorer i translationel regulering under hypoxi [27], derfor analyseret vi phosphorylering status for deres downstream substrater, eIF2α og 4E-BP1, i HCT116 celler under hypoxi. Immunoblotanalyse viste, at langvarig hypoxi fører til en lille stigning i eIF2α phosphorylering (Fig 1C), og 4E-BP1 gradvist dephosphoryleret inden for 16 timer af eksponering for hypoxia i HCT116-celler. Dette indikerer, at hypoxi hæmmer generel oversættelse i det mindste delvis gennem aktivering af PERK og inaktivering af mTOR i HCT116 celler.

A. Cytoplasmatiske ekstrakter blev læsset på en lineær 15-40% sucrosegradient ultracentrifugering. Efter centrifugering blev polysom ​​profil afbildet af A

254 værdier (øvre), og RNA blev ekstraheret fra hver fraktion til analyse. Det oprensede RNA blev opløst på en 1% formaldehyd /agarose-gel, og rRNA blev visualiseret ved ethidiumbromidfarvning (lavere). Fordelingen af ​​ribosomale subunits og polysomer er angivet. B. HCT116-celler blev behandlet med hypoxi (1% O

2) i 0, 4, 8, 16 og 24 timer. Den polysomalt fordeling af β-actin mRNA blev påvist ved polysom ​​profilering og RT-PCR. Translationseffektivitet af β-actin mRNA blev beregnet og vist som en procentdel på forskellige tidspunkter. C. phosphorylering status eIF2α og 4E-BP1 blev bestemt ved immunoblotanalyse i HCT116 celler udsat for hypoxi i den angivne tidsperiode. Niveauerne af phosphoryleret (PI-) og totale proteiner blev detekteret ved specifikke antistoffer mod phospho-eIF2α (Ser51), eIF2α, phospho-4E-BP1 (Thr37 /46), og 4E-BP1. Påvisning af β-actin protein tjente som en loading kontrol. D. Immunblotanalyse af HIF-1α, GLUT1, VEGFA, og p-actin proteiner i HCT116 celler udsat for hypoxi i 16 timer. Påvisning af β-actin protein tjente som en loading kontrol. E. HCT116-celler blev dyrket under normoxi (21% O

2) eller hypoxi (1% O

2) i 16 timer. Celler blev høstet og lyseret i RSB-150-puffer. Cytoplasmatiske ekstrakter blev læsset på en lineær 15-40% sucrosegradient ultracentrifugering og opsamlet i 11 fraktioner (1 ml /fraktion). RNA isoleret fra hver fraktion blev påvist ved RT-PCR og underkastet agarosegelelektroforese. Den polysomalt region af gradienten omfatter fraktionerne 7-11. Translationseffektivitet af β-actin, HIF-1α, og VEGFA mRNA’er blev beregnet og vist som en procentdel. 28S og 18S rRNA blev direkte visualiseret ved ethidiumbromidfarvning. Fordelingen af ​​ribosomale subunits og polysomer er angivet.

For at undersøge ændringer i oversættelse under hypoxi blev HCT116 celler dyrket under normoxisk (21% O

2) og hypoxiske (1% O

2) dyrkningsbetingelser for 16 timer. Som forventet, hypoxi stabiliserer HIF-1α protein og inducerer ekspressionen af ​​HIF-1-målgener GLUT1 og VEGFA i HCT116-celler (Fig 1D). Vi udførte også polysom ​​profilering og RT-PCR for at evaluere translationseffektivitet af udvalgte mRNA’er. Denaturerende agarosegelelektroforese af rRNA viste et skift af mRNA’er fra polysomer i translationsinitierings- komplekser (Fig 1E, nedre panel). Ophobning af 18S og 28S rRNA i lavmolekylære ribosomale fraktioner (fraktionerne 5-6; hypoxi) angivet translationel undertrykkelse under hypoxi. Den polysomalt fordeling af β-actin mRNA blev åbenbart faldet i hypoxiske HCT116 celler sammenlignet med normoxisk kontrol (Fig 1E, øvre panel). En stor del af β-actin mRNA (68,7%) var forbundet med polysomer i normoksiske HCT116 celler, mens kun 32,0% af β-actin-mRNA forblev associeret med polysomer i hypoxiske HCT116 celler. I modsætning hertil polysomalt fordeling af HIF-1α og VEGFA mRNA’er forholdsvis upåvirkede af hypoxi (fig 1E, midterste paneler). Mere end halvdelen af ​​HIF-1α (58,1%) og VEGFA (53,8%) mRNA’er forblev associeret med polysomer Efter 16 timers udsættelse for hypoxi. Efter aftale med tidligere undersøgelser [33, 34], HIF-1α og VEGFA mRNA har evnen til at undslippe translationel undertrykkelse under hypoxi. Derfor antager vi, at udvalgte mRNA forbliver effektivt oversat i HCT116 celler under hypoxiske betingelser.

Translationel regulering af udvalgte mRNA i HCT116 celler under hypoxi

For at undersøge effekten af ​​hypoxi på oversættelse, udnyttede vi polysom ​​profilering koblet til cDNA microarray analyse til screening hypoxi-regulerede gener. Begge polysom-associerede mRNA’er og total RNA fra normoxiske og hypoxiske HCT116 celler blev isoleret og udsat for microarray hybridisering. Polysom-associerede mRNA’er blev isoleret fra en pulje af polysomalt fraktioner (Fig 1A, fraktioner 8-11) til analyse af translatome. Total RNA blev ekstraheret fra de samme prøver til analyse af transkriptomet. Den translationelle ændring af et mRNA blev målt ved ændringen i overflod af polysomalt RNA normaliseret til ændringen i overflod af total RNA for hver mRNA (fig 2, polysomalt /total). Gener med ændringer ≧ 2-fold efter eksponering for hypoxi blev betragtet som hypoksi-reguleret kandidatgener. Alle kandidatgener blev inddelt i fire kategorier: opreguleres og nedreguleres gener på enten det translationelle eller transkriptionelle niveau (figur 2). Som et resultat blev 1.036 op-regulerede gener og 480 ned-regulerede gener identificeret ved translatome analyse. Den parallelle transkriptom identificerede 144 up-regulerede gener og 134 ned-regulerede gener. Det er dog kun ~ 32% af hypoxi-regulerede gener på de transkriptionelle niveau udviser tegn på translationel samregulering i HCT116 celler under hypoxi (fig 2, Venn diagrammer). Dette indikerer, at hypoxi kan påvirke forskellige delgrupper i målgener mellem translatome og transkriptom.

Resultat af microarray-analyse blev analyseret ved hjælp GeneSpring GX 10 software. Gener med ≧ 2-fold ændring i polysomalt /total RNA-forhold eller total RNA blev defineret som hypoksi-regulerede gener. Resultaterne blev opnået fra tre uafhængige forsøg. Hypoxi-regulerede gener blev inddelt i fire kategorier: opreguleret og ned-regulerede gener på translationel (translatome) og transkriptionelle (transkriptom) niveauer, hhv. Venn diagrammer viser overlapningen af ​​hypoxi-regulerede gener mellem translatome og transkriptom. Tal i overlappende områder angiver hypoxi-regulerede gener på både translationelle og transkriptionelle niveauer i HCT116 celler.

Validering af kandidatgener, hvis oversættelsen er opreguleret af hypoxi i HCT116 celler

For at verificere microarray data blev flere kandidatgener analyseret af polysom ​​profilering og kvantitativ real-time RT-PCR. Den polysomalt sammenslutning af β-actin mRNA blev åbenbart faldet i HCT116 celler udsat for hypoxi (fig 3A). I modsætning hertil polysom-associerede mRNA’er både translatorisk og transkriptionelt opreguleret gener

GLUT1

,

ADM

, og

VEGFA

blev forøget i HCT116 celler under hypoxi sammenlignet til normoxi (fig 3B), hvilket indikerer, at de tre gener forbliver effektivt oversat under hypoxi. Lignende resultater blev opnået fra translationelt men ikke transkriptionelt opreguleret gener

HSPA5

,

VCAN

, og

GPR126

(Fig 3C). Efter beregning viste disse translationelt up-regulerede gener øget translationseffektivitet under hypoxi sammenlignet med normoxi (fig 3D). Resultaterne af validering eksperimenter er stort set i overensstemmelse med microarray målinger. Dette indikerer, at mange gener kan flygte fra translationel undertrykkelse og forblive effektivt oversat i HCT116 celler under hypoxi.

Flere up-regulerede gener på translationel niveau (translatome) i hypoxiske HCT116 celler blev valideret. RNA isoleret fra saccharosegradientfraktionering blev analyseret ved kvantitativ real-time RT-PCR. Fordelingen af ​​mRNA’er i hver fraktion blev beregnet og vist som en procentdel (%). A. Polysomalt profil β-actin tjente som en negativ kontrol. B. Polysomalt profiler på op-regulerede gener på både translationelle og transkriptionelle niveauer (

GLUT1

,

ADM

, og

VEGFA

). C. Polysomalt profiler på op-regulerede gener på translationel men ikke transkriptionel niveau (

HSPA5

,

VCAN

, og

GPR126

). D. Translational effektivitet β-actin, GLUT1, ADM, VEGFA, HSPA5, VCAN, og GPR126 mRNA’er blev beregnet og vist som en procentdel (%) i HCT116 celler under normoxi og hypoxi. Bar grafer viser gennemsnit ± standardfejl fra mindst tre uafhængige forsøg (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)

Pathway berigelse analyse af iltmangel. -regulated gener på translationel niveau

for at få indblik i de biologiske funktioner af hypoxi-regulerede gener, blev pathway berigelse analyse udført ved hjælp af DAVID Bioinformatik Resources 6.7-software til at kortlægge gener til biologiske veje som defineret af Kegg pathway database. Resultaterne viste, at hypoxia fører til translationel opregulering af gener, der fungerer i lysosomer, glycan og lipidmetabolisme, antigen-processering og præsentation, celleadhæsion og remodellering af den ekstracellulære matrix (ECM) og cytoskelettet (tabel 1). I modsætning hertil hypoxi nedregulerer translationen af ​​gener involveret i apoptose, ubiquitinmedieret proteolyse og oxidativ phosphorylering (tabel 2). En vigtig funktion af lysosomer er fordøjelsessystemet autofagi i eukaryote celler. Derfor antager vi, at hypoxi inducerer lysosomal autophagy og metabolisk omlejring at opretholde energi homeostase via en translationel mekanisme.

Hypoxi inducerer lysosomal autophagy og mitokondriel dysfunktion gennem translationel regulering i HCT116 celler

Vi har identificeret 35 translationelt up-regulerede gener, der fungerer i det lysosomale pathway i HCT116 celler udsat for hypoxi (tabel 1). Interessant alle 35 lysosomale gener blev opreguleret under hypoxi på det translationelle niveau uafhængigt af transkription (tabel 3). Dette viser, at translationel regulering kan spille en afgørende rolle i hypoxi-induceret autofagi. Lysosomer kan kvantificeres ved flowcytometri efter farvning af cellerne med acridinorange (AO), en lysosomotropiske svag base, der akkumuleres inden de sure vesikuløse organeller af levende celler. Fluorescensintensiteten af ​​AO var signifikant forøget i HCT116-celler efter eksponering for hypoxi i 24 timer (Fig 4A), hvilket antyder, at hypoxi fører til en stigning i indholdet af lysosomer. Vi næste brugte LYSOTRACKER Red DND-99, en fluorescerende acidotropic farvestof til mærkning og sporing af sure organeller i levende celler, til at farve lysosomer. Lysosomer blev farvet lys rød i HCT116-celler, og hypoxi giver anledning til udvidede lysosomer sammenlignet med normoxi (Fig 4B). Resultaterne viser, at hypoxi øger størrelsen på lysosomale volumen. Vi undersøgte yderligere induktion af autophagy ved at overvåge autofagi markørprotein let kæde 3 (LC3) i HCT116 celler under hypoxi sammenlignet med normoxi. Omdannelse af LC3-I til LC3-II og nedbrydning af total LC3 (LC3-I plus LC3-II) blev anvendt til at bestemme ændringer i omfanget af autofagi [41]. Immunoblotanalyse viste, at LC3-I til LC3-II konvertering (LC3-II /LC3-I-forholdet) blev øget, og den totale mængde LC3 blev reduceret i HCT116 celler udsat for hypoxi i 24 timer og 48 timer (Fig 4C, venstre panel ), hvilket antyder hypoxi-induceret autofagi. Vi har registreret også autofagi markørproteinet P62, som nedbrydes under autofagi [41]. Konsekvent, mængden af ​​p62 viste også et markant fald i hypoxiske HCT116 celler (Fig 4C, højre panel). For at verificere hypoxi-induceret translationel opregulering af lysosomale proteiner (tabel 3), vi har registreret både protein og mRNA-niveauer af lysosomale gener glucosamin (N-acetyl) -6-sulfatase (

GNS

), prosaposin (

alarmcentral

), og tripeptidyl peptidase 1 (

TPP1

). Efter eksponering for hypoxi i 24 timer blev niveauet af GNS og alarmcentraloperatørerne proteiner steg med ~ 2-gange sammenlignet med normoxi (Fig 5A). Niveauet af TPP1 protein blev også steg lidt i hypoxi. En kvantitativ analyse viste, at mRNA niveauerne af GNS, alarmcentral, og TPP1 ikke væsentligt påvirket af hypoxi (Fig 5A). Resultaterne indikerer, at hypoxi beriger lysosomale proteiner gennem translationelle mekanismer.

A. HCT116-celler blev dyrket under normoxi (21% O

2) eller hypoxi (1% O

2) i 24 timer. Celler blev farvet med acridinorange (AO) og analyseret ved flowcytometri til måling af indholdet af lysosomer. Bar grafer viser gennemsnitlige fluorescensintensitet af AO fra mindst tre uafhængige forsøg (** p 0,01). B. HCT116-celler blev dyrket under normoxi (21% O

2) eller hypoxi (1% O

2) i 24 timer. Lysosomer blev mærket med LYSOTRACKER Red DND-99 i 1 time i levende celler og overvåget af en inverteret fluorescensmikroskop. C. HCT116 celler blev udsat for hypoksi (H) eller normoxi (N) i 24 timer og 48 timer. Total celleekstrakter blev analyseret ved immunblotting med LC3 og p-actin-antistoffer (venstre panel). De LC3-I og LC3-II bånd blev kvantificeret, og autofagi blev målt ved variationer i forholdet LC3-II /LC3-I og den totale mængde af LC3 (LC3-I plus LC3-II) normaliseres til p-actin til hver betingelse. Bar grafer viser relative LC3 proteinniveau normaliseret til p-actin fra mindst tre uafhængige forsøg (** p 0,01). Ovennævnte prøver blev også analyseret ved immunoblotting med P62 og α-tubulin antistoffer (højre panel).