PLoS ONE: synergistiske virkning af Afatinib med Su11274 i ikke-småcellet lungekræft er bestandige mod Gefitinib eller Erlotinib

abstrakt

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) og c-met-receptorer udtrykkes på mange ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) -celler. Nuværende enkeltstof terapeutiske målretning af en mutant EGFR har en høj effektivitet i klinikken, men er ikke helbredende. Her undersøgte vi kombinationen af ​​målretning EGFR og c-met pathways i NSCLC-celler er resistente over for receptor-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er), ved hjælp af RNA-interferens og inhibering med TKI’er. Forskellige NSCLC cellelinjer med forskellige genomiske egenskaber (H358, H1650 og H1975) blev transficeret med EGFR-specifikke-siRNA, T790M-specifikke-siRNA, c-MET siRNA eller kombinationen. Efterfølgende EGFR TKI’er (gefitinib, erlotinib eller afatinib) eller monoklonalt antistof cetuximab kombineredes med henholdsvis c-MET-specifik TKI su11274 i NSCLC-cellelinier. Celleproliferationen, levedygtighed, caspase-3/7 Aktivitetsmenutast og apoptotisk morfologi blev overvåget ved spektrofotometri, fluorimetri og fluorescensmikroskopi. Den kombinerede effekt af EGFR TKI’er eller cetuximab og su11274, blev vurderet ved anvendelse af en kombination indeks. Resultaterne viste, at de cellelinier, der var relativt resistente over for EGFR TKI’er, især H1975 cellelinien indeholdende modstanden T790M-mutationen, viste sig at være mere følsomme over for EGFR-specifikke-siRNA. Kombinationen af ​​EGFR siRNA plus c-MET siRNA forbedret cellevækstinhiberingen, apoptose induktion og hæmning af nedstrøms signalering i EGFR TKI resistent H358, H1650 og H1975-celler, trods manglende aktivitet af c-MET siRNA alene. EGFR TKI’er eller cetuximab plus su11274 var også konsekvent overlegen til enten agent alene. Den stærkeste biologiske virkning blev observeret, da afatinib, blev en irreversibel pan-HER blokker kombineret med su11274, der opnåede en synergistisk effekt i T790M mutant H1975 celler. I en konklusion, vores resultater tilbyde præklinisk bevis for princippet for kombineret inhibition som en lovende strategi behandling for NSCLC, især for patienter, hvor aktuelle EGFR-målrettede behandlinger ikke på grund af tilstedeværelsen af ​​T790M-EGFR-mutation eller høj c-MET-ekspression .

Henvisning: Chen G, Noor A, Kronenberger P, Teugels E, Umelo IA, De Grève J (2013) synergistiske virkning af Afatinib med Su11274 i ikke-småcellet lungekræft er bestandige mod Gefitinib eller Erlotinib. PLoS ONE 8 (3): e59708. doi: 10,1371 /journal.pone.0059708

Redaktør: Ramon Andrade de Mello, University of Porto, Portugal

Modtaget: December 7, 2012; Accepteret: 17 Februar 2013; Udgivet: 18 Mar 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Projektet blev finansieret af Kræftplan Belgien (Grant NKP-29-011), Stichting Tegen Kanker, Belgien. Denne undersøgelse blev delvist støttet af forskningsfond af Boehringer Ingelheim GmbH. Gang Chen blev støttet af den kinesiske Scholarship Rådet (CSC). Gang Chen og Ijeoma Adaku Umelo blev støttet af Vrije Universiteit Brussel (VUB) ph.d.-stipendium. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende interesser: Denne undersøgelse blev delvist støttet af forskning fond af Boehringer Ingelheim GmbH. Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere

Introduktion

I nogle ikke -. Småcellet lungekræft (NSCLC), den epidermale vækstfaktorreceptor (EGFR, også kendt som ErbB1 eller HER1), indeholder “sensibiliserende” mutationer, der øger effektiviteten af ​​EGFR-specifikke tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) [1], [2]. To væsentlige anti-EGFR strategier er i øjeblikket i klinisk anvendelse: lav molekylvægt TKI’er der konkurrerer med ATP for binding til tyrosinkinase-delen af ​​en mutant EGFR receptor, og monoklonale antistoffer (mAb’er), der er rettet mod det ligandbindende ekstracellulært domæne, derved forhindre ligandbinding, og følgelig receptordimerisering, og receptor signalering. Disse to klasser af midler har vist solid præklinisk og klinisk aktivitet i en række forskellige tumortyper [3].

Blandt receptoren TKI’er, erlotinib (Tarceva, Genentech, Inc., South San Francisco, CA, og OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY) forbedrer overlevelsen i avanceret NSCLC patienter, der skred efter en eller to tidligere kemoterapiregimer [4], [5], [6], [7]. Både gefitinib og erlotinib er overlegen i forhold til kemoterapi i første linie behandling af lunge adenocarcinom, hvor EGFR-receptoren rummer de sensibiliserende mutationer i exon 19/21 [8], [9], [10]. Den samlede kliniske erfaring i dag viser, at kun patienter, hvis tumorer indeholder et sensibiliserende mutation, udlede en meningsfuld klinisk gavn af EGFR TKI’er. Faktisk randomiserede studier indikerer, at patienter ikke udvalgt til sådanne mutationer, kan disse stoffer har en negativ indvirkning på resultatet [10], [11].

Effektiviteten af ​​inhibitorer er tidsbegrænset på grund af den udseende af celler med resistensmekanismer, i næsten halvdelen af ​​tilfældene en threonin-til-methionin substitution i EGFR ved aminosyreposition 790 (T790M). Afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), er en irreversibel hæmmer af både EGFR, HER2 og HER4 kinaser og bevarer en vis aktivitet i tumorer med T790M mutationer, men ved doser, der er en log højere end hvad der er nødvendigt for kræft huser sensibiliserende mutationer [ ,,,0],12], [13], [14], [15], [16], [17].

kimære IgG1 monoklonalt EGFR-antistof cetuximab (ERBITUX, ImClone Systems Incorporated, New York, NY, og Bristol -Myers Squibb Company, Princeton, NJ) blokerer ligand-receptor interaktion og derved nedregulerer EGFR-signalering, hvilket resulterer i inhibering af celleproliferation og angiogenese, og induktion af apoptose [3]. Cetuximab i kombination med kemoterapi, er blevet godkendt af FDA og EMEA til behandling af metastatisk kolorektal cancer (CRC) og i kombination med strålebehandling til behandling af lokalt fremskreden hoved- og halscancer (HNC) [18], [19]. Cetuximab har vist en beskeden aktivitet som enkeltstof og i kombination med docetaxel til patienter med fremskreden, kemoterapi-resistent NSCLC [20]. Et multinationalt, multicenter, open-label, har fase III forsøg vist, at tilsætning af cetuximab til platinbaseret kemoterapi forbedret resultat for patienter med fremskreden NSCLC [21]. Den overordnede fordel, men er så begrænset, at der ikke er enighed om relevansen for kliniske anvendelse.

RNA-interferens (RNAi), ved kort at blande RNA (siRNA’er) eller korte hårnål RNA (shRNAs), har forudsat en effektiv redskab til at modulere genekspression til undersøgelse af genfunktion. RNAi er i øjeblikket også under overvejelse som et terapeutisk værktøj, i laboratoriet og klinikken [22], [23], [24]. Adskillige rapporter beskrevet virkningerne af EGFR-målrettet RNAi til at hæmme cellevækst [25], [26], [27], [28], [29], men forsøg på at vælte den T790M-holdige allel (ved hjælp af lentiviral shRNA konstruerer) var mislykket [26].

Erhvervet resistens over for TKI’er kan også udvikle sig gennem en “kinase switch”, med c-MET forstærkning og overekspression [30], [31]. Forstærkning af c-MET, en transmembrane tyrosinkinasereceptor, kan allerede ske før behandlingen med TKI’er i NSCLC [32], [33], [34], [35], og c-MET er udtrykt i 60% af NSCLC tumorer som målt ved immunohistokemi [34]. Høje niveauer af hepatocytvækstfaktor (HGF), c-met ligand, produceres af stromaceller [36], er også blevet korreleret med dårlig prognose af NSCLC-patienter [37]. c-MET forstærkning og opregulering blev identificeret i nogle patienter, erhvervet resistens over for gefitinib /erlotinib [30], [31]. Derudover kan C-MET aktiveres ved mutationer såvel [38]. derfor c-MET inhibition kunne blive et værdifuldt behandlingsstrategi for disse patienter.

I den aktuelle undersøgelse har vi først undersøgt de kombinerede virkninger af EGFR-specifikke siRNA’er med c-MET siRNA på forskellige NSCLC cellelinier med distinkt genomisk egenskaber. Vi undersøgte også kombinationen af ​​EGFR TKI’er (gefitinib, erlotinib eller afatinib) eller det monoklonale EGFR antistof cetuximab, med c-MET-hæmmer su11274 i det samme sæt af lungekræft-cellelinjer.

Metoder

siRNA’er

Tidligere otte siRNAs rettet mod vildtype EGFR og T790M sekvenser (NCBI reference Sequence: NM_005228.3) blev konstrueret ved hjælp af algoritmer fra Invitrogen, Eurogentec, Dharmacon, Maurice HO Rational siRNA design (http: //ihome.ust.hk/~bokcmho/siRNA/siRNA.html), Reynolds [39], Ui-Tei [40] og Jagla [41]. Kapaciteten af ​​disse siRNA’er kandidater til at vælte EGFR eller T790M-mutant EGFR på mRNA niveau, og deres evne til at undertrykke celleproliferation blev testet [42]. De mest effektive siRNA’er blev udvalgt til eksperimenterne i den foreliggende undersøgelse (tabel 1). c-MET siRNAs (NCBI reference Sequence: NM_001127500.1) blev købt som en “på target smartpool” (Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, England) og siRNA-sekvenserne blev opsummeret i tabel 1. Kodede siRNA’er blev genereret ved www.sirnawizard. com og bekræftet af en BLAST søgning (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) positiv kontrol siRNA fra Invitrogen (ref. SKU # 12.935-140 Stealth RNAi GAPDH Positiv kontrol, Merelbeke, Belgien) blev anvendt som en primær test for siRNA transfektionseffektivitet. En TOX transfektion Kontrol og Siglo Green transfektion indikatorer blev udført som positive kontroller for transfektionseffektivitet (ref D-001630-01-02;. D-001500-01-05, Thermo Scientific Dharmacon, Blenheim, England). Den negative kontrol siRNA var en proprietær sekvens, der ikke svarer til nogen eukaryot gen (OR-0030-neg 05, Eurogentec S.A., Liège, Belgien). SiRNA-duplexerne blev transient transficeret under anvendelse af lipofectamin

TM 2000 (katalog nr. 11.668-019, Invitrogen Merelbeke, Belgien) i RPMI-1640-medium indeholdende 10% føtalt bovint serum uden antibiotika, som tidligere beskrevet [43], [44 ], [45]. Hvert forsøg blev udført i mindst tre eksemplarer og tre gange uafhængigt.

cellelinjer og reagenser

Den menneskelige NSCLC cellelinjer H292 (CRL-1848 ™, mucoepidermoid pulmonal karcinom), H358 (CRL-5807 ™, bronchoalveolær carcinom), HCC827 (CRL-2868 ™, adenocarcinom), H1650 (CRL-5883 ™, adenocarcinom; bronchoalveolær carcinoma), og H1975 (CRL-5908 ™, adenocarcinom) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Holland). Cellelinien H292 blev rapporteret som en EGFR og K-Ras vildtype-cellelinje [46], [47], [48], [49], som vi bekræftet ved anvendelse real-time RT-qPCR og sekventering analyse (data ikke vist ). H358 er EGFR vildtype, har en codon 12 K-ras-mutation [50], og en homozygot deletion af p53 [51]. H1650 og HCC827 har en i-ramme deletion mutation i EGFR tyrosinkinasedomænet (E746-A750 deletion, exon 19). H1650-celler har også en COOH-terminal deletion af PTEN og tab af PTEN-protein [52] og udtrykke insulin-lignende vækstfaktor-receptor (IGF1R) [53]. Cellelinien H1975 har en sensibiliserende L858R kinasedomæne mutation i exon 21, og en anden T790M i exon 20,

i cis

, i EGFR-kinase domæne, der gør dem resistente over for den reversible TKI’er gefitinib og erlotinib [54 ]. Desuden er alle disse fem cellelinier udtrykker c-MET-receptoren uden genamplifikation [28], [30], [53], [55], [56]. Alle fem cellelinier blev dyrket i RPMI 1640-medium (Invitrogen Corp., Gent, Belgien), suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Perbio Science NV, Erembodegem, Belgien), 2 mM L-glutamin og 1 mM natriumpyruvat ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Ti mM lagre af EGFR-specifikke TKI’er gefitinib (AstraZeneca, Cheshire, Storbritannien), erlotinib (AstraZeneca, Cheshire, Storbritannien), den irreversible pan-HER-hæmmer afatinib (Boehringer Ingelheim, Ingelheim, Tyskland) og en c-MET inhibitor , su11274 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgien) blev fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO) og opbevaret ved -80 ° C. Disse lægemidler blev fortyndet i frisk RPMI 1640 med en slutkoncentration på DMSO mindre end 0,1% i alle eksperimenter. EGFR-specifikke monoklonale antistof cetuximab (2 mg /ml) blev indkøbt fra Merck KgaA, Darmstadt, Tyskland.

RT-qPCR

RNA-isolering, RNA normalisering, revers transkription og qPCR var som beskrevet tidligere [43], [44], [45].

Western blot-analyse

Efter at være blevet behandlet med siRNA’er eller forskellige midler til de angivne perioder, cellerne blev vasket med PBS og lyseret i en buffer indeholdende Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCI 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), TRITON-X 1%, Na-pyrophosphat 2,5 mM, natriumorthovanadat (Na3VO4) 1 mM, leupeptin 1 mg /ml, proteasehæmmere cocktails 1% og phosphotase inhibitor cocktails 1% (Sigma-Aldrich NV /SA, Bornem, Belgien). Lysaterne blev centrifugeret ved 12.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og kogt i 5 min. Koncentrationen af ​​lysatet protein blev detekteret af Bio-Rad Bradford protein assay (Nazareth Eke, Belgien) og 25 ug denatureret protein blev underkastet SDS-PAGE (10% SDS-acrylamidgel) med en påsætningsbuffer indeholdende 80 mM Tris -HCI (pH 6,8), 5% SDS, 10% glycerol, 5 mM EDTA (pH 8), 5% 2-mercaptoethanol, 0,2% Bromophenolblue og 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid. De separerede proteiner blev overført til PVDF-membraner (BioRad) i 2 timer ved 100 mA. Membranen blev inkuberet med de følgende primære antistoffer som indikeret: EGFR (cellesignalering), phospho-EGFR (Tyr1173, klon 9H2, Upstate), c-MET (L41G3, Cell Signaling), phospho-c-MET (Tyr1234 /1235, 3D7, Cell Signaling), phospho-AKT /PKB (pS473, Invitrogen), phospho-ERK1 /2 (pTpY185 /187, Invitrogen), phospho-STAT3 (Tyr705, 3E2, Cell Signaling), phospho-STAT5 (pY694, BD Biosciences ) og β-actin (Sigma-Aldrich NV). En peroxidase-konjugeret sekundært antistof (1:4000 fortynding ECL Anti-mus eller anti-kanin IgG HRP bundet, Na 931, GE Healthcare Bio-sciences /Amersham, Diegem, Belgien) blev tilsat, og membranerne blev udsat for kemiluminescensdetektion (ECL Plus vestlige Blotting Detection Reagenser, GE Healthcare Bio-videnskaber /Amersham, Diegem, Belgien).

spredning

Cell vækst blev vurderet ved hjælp af en kolorimetrisk tetrazolium assay (substrat MTS, CellTiter96 vandig One opløsning celleproliferationsassay G3580, Promega, Madison, USA). Protokollen var som følger: forskellige midler og kombinationer blev tilsat til plader med 96 brønde med stigende koncentrationer og inkuberet ved 37 ° C i op til 96 h (kombinationseksperimenter op til 72 timer). Efter tilsætning af 20 pi MTS-reagens til hver brønd blev pladerne inkuberet i 2 timer ved 37 ° C i en fugtig 5% CO

2 inkubator, og absorbansen ved 490 nm blev registreret ved anvendelse af en 96-brønds mikropladelæser (Scientific Multiskan MK3, Thermo Finland). Resultaterne var gennemsnittet af seks brønde og udtrykt som forholdet mellem absorbansen divideret med absorbansen af ​​mock kontrol × 100.

Levedygtighed

Cellelevedygtighed blev analyseret ved fluorimetrisk påvisning af resorufin (CellTiter -Blue cellelevedygtighed Assay, G8080, Promega, Madison, USA). Fremgangsmåden var ifølge producenten. Behandlingerne og kontroller var som førnævnte. Fluorimetri (ex: 560 nm /em: 590 nm) blev under anvendelse af en FL600 fluorescenspladelæser (Bio-Tek, USA). Alle assays blev udført tre gange og hver gang seks individuelle brønde blev anvendt. Fluorescensdata udtrykkes som fluorescensen af ​​behandlede prøver divideret med fluorescens af mock kontrol × 100.

Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast detektion

Caspase-3/7 aktivitet blev målt ved anvendelse af et syntetisk rhodaminmærket caspase-3/7-substrat (Apo-ONE® Homogent caspase-3/7 Assay, G7790, Promega, Madison, USA) umiddelbart efter fluorimetrisk påvisning af cellernes levedygtighed på de samme brønde, ifølge instruktionerne fra fabrikanten. Efter inkubation ved stuetemperatur i 60 minutter, blev fluorescensen af ​​hver brønd målt (ex: 499 nm /em: 512 nm) under anvendelse af en FL600 fluorescenspladelæser (Bio-Tek, USA). Caspase-3/7 aktivitet udtrykkes som fluorescens af behandlede prøve /mock kontrol × 100.

Fluorescensmikroskopi evaluering af celle apoptose og morfologi

Virkningerne af de forskellige behandlinger på apoptose og nuklear morfologi i cellerne blev vurderet af Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgien) og propidiumiodid (PI, Sigma-Aldrich NV Bornem, Belgien) dobbelt fluorescerende kromatin farvning. Kort fortalt, efter enkelt eller dobbelt behandling af siRNA’er eller midler blev cellerne vasket med iskoldt PBS og farvet 15 min med Hoechst (1 mg /ml) og propidiumiodid (PI, mg /ml), og observeret under et avanceret fluorescens mikroskop (ZEISS Axiovert 25, Zaventem, Belgien). Apoptose og nuklear morfologi blev identificeret ved kondensering af nukleare chromatin og dets fragmentering. Dette system bestemmer det absolutte antal levedygtige celler (Hoechst positiv /PI negativ), tidlige apoptotiske celler (Hoechst positiv /PI negativ med blå fragmenteringer i cellerne), sent apoptotiske celler (Hoechst positiv /PI positive, med røde fragmenteringer i cellerne ), nekrotiske celler (Hoechst negative /PI positiv) og vragrester signaler. Levedygtige og apoptotiske celler blev talt i 10 forskellige områder under 200 × forstørrelse, og i hver brønd fra tre uafhængige forsøg. Tælling var af to personer, og den gennemsnitlige resultat blev udtrykt i forhold til mock kontrol. Apoptotiske celletal fra forskellige behandlinger blev sammenlignet ved at blive normaliseret til deres levedygtige celleantal.

Statistisk analyse

SPSS19.0 blev anvendt til statistisk analyse. Resultaterne var repræsentative for tre uafhængige forsøg, medmindre andet er angivet. Værdier blev præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til at analysere signifikans mellem grupperne. Den mindste signifikante forskel (LSD) metode til multiple sammenligninger med forskellige behandlinger og kontrolgruppen blev påført, når sandsynligheden for ANOVA var statistisk signifikant. Statistisk signifikans blev bestemt ved en

P

0,05 niveau. Analysen af ​​additivitet og synergi blev vurderet af Biosoft CalcuSyn programmet (Ferguson, MO, USA). Kombinationen Index (CI) blev anvendt til at udtrykke synergisme (CI 1), additiv effekt (CI = 1), eller antagonisme (CI 1). [57]

Resultater

Effekt af EGFR vildtype og T790M-specifikke-siRNA’er på target udtryk og maligne fænotype

siRNA rettet mod vildtype-sekvenser var i stand til at banke ned EGFR udskrift, reducere EGFR protein niveau, hæmmer cellevækst og fremkalde celle apoptose i alle NSCLC cellelinier testet, men med forskellig størrelse uafhængig af den specifikke driver genmutationer (figur 1). Ligeledes vil den T790M-specifikke-siRNA vælte T790M mRNA og også undertrykke celleproliferation og forbedre celle caspaseaktivitet i H1975 celler, der indeholder T790M-mutationen. Men virkningen var mindre potent end EGFR-specifikke-siRNA (data ikke vist). Alle negative og scrambled kontrol siRNA’er havde ingen effekt.

Lungekræft cellelinjer blev behandlet med EGFR-specifikke-siRNA 1247. Levende celler og apoptotiske celler blev påvist med Hoechst 33342 og PI dobbelt fluorescerende farvning. Antallet af apoptotiske celler blev normaliseret til antallet af levende celler i den samme brønd. Hoechst 33342 og PI dobbelt fluorescerende farvning × 200

Dual målretning af EGFR og c-MET med siRNA’er

Cellelinjer med forskellige mutationer (KRAS: H358; PTEN:. H1650; T790M : H1975), der gør dem resistente over for EGFR TKI’er blev yderligere udvalgt til den dobbelte målretning. Modstanden i H1975-celler mod EGFR TKI’er er blevet tilskrevet tilstedeværelsen af ​​T790M-mutationen, men også til aktivering af c-MET-receptoren [30], [31]. Synergi af c-MET-inhibering med EGFR-hæmning er blevet vist i modeller, der har en aktiveret eller overudtrykt c-MET-vejen [58]. I vort eksperiment har vi undersøgt vekselvirkningen mellem EGFR hæmning og c-MET-inhibering i celler, hvor sådanne c-MET-aktivering ikke er til stede. En pulje af c-met siRNAs havde ringe eller ingen virkning på cellevækst (MTS assay) i cellelinjerne H358 og H1650. I H1975 celler, blev en yderst beskeden reduktion i spredning observeret (til 87%, figur 2A). Der var en tilsvarende mangel på caspase-3/7 induktion til c-MET inhibition eneste behandling i alle cellelinjer (figur 2B). Selv immunoblotting afslørede, at c-met-receptor effektivt blev slået ned, og at c-MET-phosphorylering blev inhiberet, også i H1975-celler (figur 3), der var lille effekt på nedstrøms signalering (AKT, ERK og STAT pathways). c-MET siRNA behandling har alene således ingen signifikant effekt på nogen af ​​de testede NSCLC cellelinier

in vitro

Panel A:. Cell proliferation efter transfektion med forskellige siRNAs. Cellelinier H358 (hvid), H1650 (grå) og H1975 (sort) blev transficeret med EGFR-specifikke-siRNA 1247 blev T790M specifikke siRNA, en c-MET siRNA pool, eller kombinationer af disse, og spredning analyseret 72 timer efter transfektion ved anvendelse af et kolorimetrisk MTS assay. Panel B: Caspase-3/7 Aktivitetsmenutast. *

P

0,05 og **

P

0,01 sammenlignet med både enkelt behandling

Panel A: Immunoblotanalyse af H358 og H1650 celler transficeret. med vildtype EGFR siRNA, en c-MET siRNA pool eller en kombination af disse. Panel B: Immunoblotanalyse af H1975-celler, som i panel C. Her T790M-specifikke-siRNA var også inkluderet. Antistoffer inkluderet fosforyleret (p-) EGFR, EGFR, pc-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, p-STAT5, p-STAT3, og β-actin.

Tilsætningen af ​​EGFR siRNA (enten vildtype eller T790M-specifik) til c-MET siRNAs øget væksthæmning i H358 og H1650-celler sammenlignet med EGFR siRNA alene, men i meget mindre grad i H1975-celler (figur 2A). Kombineret behandling steg også caspase-3/7-aktivitet. I H1650 celler apoptose signal endda forøget til 8,94 gange af kontrollen sammenlignet med enkelt EGFR siRNA (4,16-fold. I H1975-celler, var der en mere beskeden stigning til 3,29 gange, hvilket er lidt højere end EGFR siRNA alene (2,26 fold). Western blotting, viste imidlertid, at kombinationen EGFR /c-MET siRNA kunne påvirke ERK-vejen samt (udover AKT, figur 3), hvilket er i modsætning til EGFR inhibering alene. den ERK pathway blev nedreguleret mest i H1975 celler, hvorimod blev observeret den største reduktion af p-AKT i H1650 celler.

effekten på levedygtighed blev også vurderet ved hjælp af en fluorimetriske resorufin levedygtighed assay og ved mikroskopisk tælling af levedygtige (Hoechst 33342 positive /PI negativ) celler. i begge assays resultaterne spejlet MTS tetrazolium assay (data ikke vist). ligeledes caspase-3/7-aktivitet blev også bekræftet af Hoechst og PI dobbelt fluorescerende farvning assay (data ikke vist).

Dual målretning af EGFR med TKI’er eller cetuximab og c-MET med su11274

Vi yderligere kontrolleret, om de opnåede resultater med kombineret siRNA behandling kunne efterlignes ved hjælp dobbelt EGFR og c-MET-specifikke inhibitorer, der kan være lettere at anvende

in vivo

. Lungekræft celler blev behandlet med en enkelt EGFR TKI’er gefitinib, erlotinib, eller afatinib, og i kombination med c-MET-hæmmer su11274. Kombinationen af ​​det monoklonale antistof EGFR cetuximab med su11274 blev også undersøgt.

Virkningen af ​​su11274 alene på cellevækst og apoptose var yderst svag i alle tre cellelinier, selv om der var en anelse stærkere virkning i H1975-celler , der har højere c-MET-ekspression end de andre to cellelinjer (figur 4). Ved en koncentration på 1 uM su11274, for eksempel en reduktion på 20-30% i proliferationshastighed og en beskeden stigning på 40-50% i caspase-3/7-signaler i kontrast til en manglende virkning i de to andre cellelinier (figur 4, figur 5). Disse resultater er kongruente med c-met-siRNA eksperimenter.

H358, H1650 og H1975-celler blev inkuberet med et koncentrationsområde på su11274, og cellerne blev inkuberet i 72 timer. Panel A: proliferation. Panel B: caspase-3/7-aktivitet. Panel C: apoptose. Panel D:. Dosis-effekt kurver

Panel A: spredning af celler efter enkelt eller kombineret TKI behandling. Cellelinier H358 (hvid), H1650 (grå) og H1975 (sort) blev dyrket i RPMI indeholdende 10% FBS og 1 uM su11274, gefitinib, erlotinib, afatinib eller cetuximab, og deres kombinationer. Proliferationen blev analyseret 72 timer efter behandling under anvendelse af et kolorimetrisk MTS assay. Panel B: caspase -3/7 induktion ved en enkelt eller kombineret TKI behandling. *

P

0,05 og **

P

. 0,01 sammenlignet med både enkelt behandling

I kombination med EGFR TKI’er, koncentrationerne blev opretholdt ved 1 uM for alle agenterne. I H358 og H1650-celler (figur 5A), den TKI’er alene inducerede en lille reduktion i cellevækst (maksimalt 41% i H1975 med afatinib, figur 5A), og en beskeden stigning på caspase-3/7-signaler (1,6 gange -at maksimum også i H1975 med afatinib, figur 5B) sammenlignet med kontrollerne af køretøjer. Kombinationerne med su11274 kunne formindske cellevækst smule længere i H358 og H1650, og kombinationen effekt var mere potent i H1975 (navnlig su11274 + afatinib, figur 5A). I mellemtiden tilsætningen af ​​su11274 tilbydes nogle gevinst i caspase-3/7-signaler, i overensstemmelse med cellevækstinhiberingen data (figur 5B). De stærkeste effekter blev set i H1975 celler, der er kendt for at være EGFR-TKI resistente. I disse celler, single-agent behandling med gefitinib og erlotinib er ineffektiv, mens afatinib kan reducere væksten og inducere apoptose. Alle kombinationer med su11274 opnås en forbedret virkning på cellevækst og apoptose. Kombinationen su11274 + afatinib var i stand til at reducere cellernes levedygtighed til 49% ved 1 uM koncentration (figur 5A), og øget apoptotiske signaler til 2,64 gange (figur 5B).

For at fastslå additiv eller synergistisk natur af de dobbelte behandlinger, blev en række koncentrationer op til 1 uM sat op for hver forbindelse og kombinationerne. Virkningerne blev scoret med den kolorimetriske MTS formazan spredning assay, og et CI, der skelner mellem additive og synergistiske virkninger blev beregnet (Biosoft CalcuSyn software). Resultaterne viser entydigt, at den kombinerede effekt af alle agenter på spredning i H358 og H1650 var additiv. I H1975 celler, blev en additiv virkning fra gefitinib eller erlotinib eller cetuximab + su11274 også observeret (figur 6). Kombinationen af ​​afatinib + su11274 scorede synergistisk (CI 1) i cellevækstinhibering og apoptose induktion (figur 7). Denne synergistiske virkning kunne forklares ved kooperativ inhibering af det proliferative /overlevelse og anti-apoptotiske signalveje AKT, ERK og STAT (figur 8). Western blot antydet, at hæmning af disse tre veje er særlig effektiv i H1975-celler efter kombineret behandling med su11274 + afatinib (figur 8).

kombinationsindeks (CI) blev beregnet i H1975. Initiativerne 1, hvilket indikerer additiv virkning (Panel A: gefinib + su11274; Panel B: erlotinib + su11274; Panel C: cetuximab + su11274).

Kombination Index (CI) i afatinib og su11274. Her CI afatinib + su11274 1, hvilket indikerer synergistisk effekt

Immuno blotting af cellelysater af H358, H1650 og H1975 celler behandlet med en enkelt eller kombineret TKI’er /cetuximab.. Antistoffer inkluderet fosforyleret (p-) EGFR, EGFR, pc-MET, c-MET, p-AKT, p-ERK1 /2, p-STAT5, p-STAT3, og β-actin.

Discussion

EGFR er et terapeutisk mål i NSCLC. I en tidligere undersøgelse har vi vist, at enkelt middel lægemiddelmålretning med EGFR TKI ikke sikrer en maksimal biologisk effekt, selv i følsomme cellelinjer, og at tilføjelsen af ​​EGFR-specifikke-siRNA til EGFR TKI’er eller cetuximab forøger de terapeutiske virkninger [45 ]. Det er dog kun rettet mod EGFR-vejen ikke er effektiv i celler, som skjuler resistensmekanismer og er endda utilstrækkelig til at annullere den fulde maligne fænotype i sensitive celler. det næste spørgsmål var således, om samtidige inhibering af EGFR og c-MET, ved RNAi, ville resultere i øgede biologiske virkninger, og derfor være nyttige til at overvinde TKI resistens i H1975-celler. Tang et al [28] viste, at kombinationen af ​​EGFR siRNA og c-MET siRNA i H1975-celler resulterede i forøget inhibering af downstream EGFR-signalering, herunder pro-overlevelse AKT og STAT3 veje. Her har vi undersøgt virkningen på cellevækst og apoptose. Tilsætningen af ​​c-MET siRNA til enten EGFR vildtype eller T790M-specifikke siRNA’er, resulterede i en øget effekt på cellevækst hæmning og caspase-3/7 Aktivitetsmenutast induktion. Den EGFR vildtype siRNA var mere potent end T790M siRNA efter aftale med enkelte siRNA resultater beskrevet ovenfor, og i overensstemmelse med graden af ​​sti hæmning (se nedenfor). Kombinationen med c-MET siRNA øget væksthæmning og apoptose induktion mere markant i H358 og H1650 celler. Immunblotting viser en konsekvent nedregulering af phospho-AKT, i overensstemmelse med Tang et al. [28], men den nedregulering af phospho-STAT3 var svagere. Vi fandt også, at to downstream signaler blev inhiberet: phospho-STAT5 og især phospho-ERK1 /2. Når T790M og c-MET siRNAs blev kombineret, den kooperative effekt var mindre potent.

Den dobbelte målretning af EGFR og c-MET blev derefter kontrolleres ved hjælp af TKI’er (gefitinib, erlotinib og afatinib plus su11274). Enkeltstof behandling med enten inhibitor, i de tre EGFR TKI’er resistente cellelinjer havde en relativt svag virkning på vækstinhibering og apoptose induktion og var endda minimal eller fraværende i c-MET-inhibitor. højere doser af erlotinib, kan imidlertid inducere apoptose i KRAS mutantcellelinie H358 [45]. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at en kombination af su11274 og erlotinib havde også en højere effekt på cellevækst hæmning i H1975-celler. Graden af ​​inhibering (med 35%) var i det samme område som rapporteret af andre (42%) [28]. For at sikre den additive eller synergistiske karakter af den dobbelte behandling, blev en række stigende TKI koncentrationer oprettet. Virkningerne blev evalueret ved brug af kolorimetriske MTS formazan proliferationsassay, og en CI blev beregnet. Effekten af ​​dobbelt erlotinib plus su11274 behandling i H1975 celler var additiv. En lignende additiv effekt blev fundet med gefitinib eller cetuximab plus su11274 i H1975 celle. Kombinationen af ​​afatinib og su11274 klart havde en synergistisk virkning på cellevækst hæmning i H1975-celler.