PLoS ONE: Kombinatorisk Therapy forøger virkningen af ​​anti-IGF-1R mAb Figitumumab til Target småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Lille celle lungekræft (SCLC) er en genstridig malignitet med tydelige biologiske egenskaber. Antistof rettet terapi har været aktivt undersøgt som et nyt lægemiddel modalitet.

Metoder

Vi testede udtryk for IGF-1R og beregnede overlevelsen i 61 SCLC patienter. Vi evaluerede også anti-tumor effekt af anti-IGF-1R monoklonalt antistof Figitumumab (CP) på SCLC, og forsøgte to lægemiddelkombinationer at forbedre CP terapi.

Resultater

foreslået Vores kliniske data at høje IGF-1R ekspression blev korreleret med lav SCLC patientoverlevelse. Vi demonstrerede derefter virkningen af ​​CP var sandsynligvis gennem IGF-1R blokering og nedregulering uden IGF-1R auto-phosphorylering og PI3K /AKT aktivering. Men observerede vi forhøjet MEK /ERK aktivering efter CP behandling i SCLC celler, og dette MEK /ERK-aktivering blev forstærket af ß-arrestin1 knockdown mens svækket ved ß-arrestin2 knockdown. Vi fandt både MEK /ERK-inhibitor og metformin kan øge CP behandling i SCLC celler. Vi illustrerede endvidere additive effekt af metformin var sandsynligvis ved at fremme yderligere IGF-1R nedregulering.

Konklusion

Vores resultater beskrives potentialet af anti-IGF-1R terapi og adjuverende behandling strategi med enten MEK /ERK-hæmmer eller metformin til at målrette SCLC, berettiger yderligere undersøgelser

Henvisning:. Cao H, Dong W, Shen H, Xu J, Zhu L, Liu Q, et al. (2015) Kombinatorisk Therapy forøger virkningen af ​​anti-IGF-1R mAb Figitumumab at målrette småcellet lungekræft. PLoS ONE 10 (8): e0135844. doi: 10,1371 /journal.pone.0135844

Redaktør: Andrea Morrione, Thomas Jefferson University, UNITED STATES

Modtaget: April 29, 2015; Accepteret: 27 Juli 2015; Udgivet: 19 August, 2015

Copyright: © 2015 Cao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. arbejdet blev støttet af Provincial Videnskab og Teknologi Development Planlægning af Shandong (2012GG0021836 og 2014WS0342), National Natural Science Foundation of China (81.301.728), Key Project of Natural Science Foundation of Shandong provinsen (ZR2013HZ001), og Shandong Provincial Naturvidenskabelige Fund (ZR2014HQ073). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lille celle lungekræft (SCLC) er en genstridig malignitet med høj recidiv og lav fem års overlevelse under konventionel kemoterapi og strålebehandling [1]. Behandling af SCLC er udfordrende på grund af sin hurtige vækst og udvikling af resistens under forløbet af sygdommen. SCLC besidder nogle bestemte molekylære og cellulære ændringer, der fører til dens patogenese, herunder mutationer /deletioner af nogle tumorsuppressorer, aktivering af flere onkogener, unormale aktiviteter af nogle udviklingsmæssige forløb, og opregulering af visse receptortyrosinkinaser (RTK’er) [2] . På grund af de unikke patologiske /biologiske funktioner i SCLC, der søger efter nye målrettet terapi er af høj prioritet. Som en hastigt voksende narkotika modalitet, har antistoflægemidler mod RTK’er været aktivt undersøgt til behandling af SCLC, og insulin-lignende vækstfaktor receptor (IGF-1R) er en af ​​sådanne potentielle RTK mål [3-7].

IGF-1R og dets ligander er normalt udtrykt i forøget mængde i SCLC, og er rapporteret at korrelere med dårlig prognose [8,9]. Der er foreløbige beviser, at IGF-1R signalvejen spiller afgørende roller i mitogenese, anti-apoptose, malign transformation og metastatiske begivenheder [10,11]. IGF-1R er nu anses for at være et attraktivt mål for kræftbehandlingen, og der er nogle igangværende kliniske undersøgelser Test af IGF-1R-målrettede lægemidler. Figitumumab (CP-751, 871, CP), en human anti-IGF-IR monoklonalt antistof (mAb), har vist sig at have anti-spredning og anti-tumorigenisitetsforsøg virkninger i cancerceller og xenotransplanterede mus, og det er blevet vist at være effektive i kombination med andre cytostatika at målrette mange cancertyper [12-14]. CP blev undersøgt i et klinisk fase II forsøg i kombination med etoposid og cisplatin som en første-linie behandling for omfattende fase SCLC (NCT00977561). Men dette forsøg blev tidligt afsluttet den 2011 på grund af langsom indskrivning af patienter. For at fremme genoptagelse af kliniske forsøg, er det nødvendigt den molekylære mekanisme for, hvordan CP henvender SCLC. Desuden kombinerer CP med andre stoffer for at øge dens effektivitet er også kritisk at overbevise patienterne til at tilmelde i de kliniske forsøg.

Metformin, en udbredt anti-diabetisk lægemiddel stammer fra fransk lilla, har kaloriefattige begrænsning handling på cellemetabolisme. For nylig metformin fremstår som en kandidat anti-cancer middel. Ophobning beviser har foreslået, at metformin har anti-cancer effekter i leukæmisk, hoved og hals pladecellekræft, prostatakræft, brystkræft, lungekræft og andre solide tumorer, selv om dens præcise mekanismer uløste [15-20].

Maligne celler har normalt højere glukoseoptagelse sats og øget glykolysen at opfylde deres metaboliske krav om hurtig proteinsyntese og celleproliferation. Desværre er hyperglykæmi rapporteret til at være en af ​​de mest stærkt forekommet bivirkninger i kliniske forsøg med anti-IGF-1R-mAb-behandling, som kunne gavne tumorcellevækst og sænke effektiviteten lægemidlet [21]. Fordi metformin har både hypo-glykæmiske og anti-cancer effekt, bliver det en lovende kandidat i kombination med anti-IGF-1R mAbs til at målrette SCLC.

Ud over den potentielle anvendelse af metformin, en anden gruppe vist, at inhibering af MEK /ERK signalveje fremmet virkningerne af CP på esophageal carcinoma [22]. MEK /ERK inhibitorer er blevet anvendt alene eller i kombination med andre lægemidler til behandling af forskellige cancertyper, såsom sensibiliserende strålebehandling og /eller forbedre kemoterapi. Kombinere Selumetinib (AZD6244), en MEK1 /2-inhibitor, med konventionelle kemoterapeutiske midler forbedret deres effektivitet til at målrette forskellige tumorxenotransplantater [23]. I en NSCLC model, brugen af ​​Selumetinib resulterede i nedsat VEGF-ekspression /aktivering og kobling MEK og VEGFR inhibitorer yderligere inhiberede tumorangiogenese, vækst og metastase [24]. Desuden kombinerer OSI-906 (et IGF-1R /insulin inhibitor) med MEK 1/2 inhibitorer (U0126 og selumetinib) viste synergistiske anti-proliferative virkninger til at målrette colorektale cancerceller [25]. På grund af deres succes i flere kræftformer, er det værd at undersøge, om MEK /ERK-hæmmere kunne forbedre CP-baseret behandling i SCLC.

Heri undersøgte vi de molekylære mekanismer i de antitumor virkninger af CP i SCLC og viste, at kombinere CP med enten MEK /ERK-inhibitor U0126 eller metformin kunne øge de terapeutiske virkninger af CP til at målrette SCLC.

Materialer og metoder

Patienter og prøver

Den foreliggende undersøgelse var gennemført med tilbagevirkende kraft på fortløbende patienter med primær SCLC som havde fået foretaget en kirurgisk resektion mellem januar 2007 og december 2010, Shandong Provincial Hospital. Denne undersøgelse blev revideret og godkendt af Etisk Komité Shandong Provincial Hospital, og skriftligt informeret samtykke blev givet af deltagerne. Kriterier omfattede histologisk diagnose af SCLC, kirurgisk resektion af den primære læsion og ingen kemoterapi eller strålebehandling inden operationen. Patienter, der døde inden for en måned efter operationen, eller med positiv kirurgisk margin blev udelukket. Endelig blev opnået 61 arkivering formalin-fikseret paraffinindlejrede tumorprøver.

Iscenesættelse blev bestemt på grundlag af 7. udgave tumor-node-metastaser (TNM) klassificering for lungekræft [26]. Følgende oplysninger, herunder alder, køn, rygning status, tumor placering, tumorstørrelse, patologisk, og TNM stadie blev indsamlet. Alle patienter blev behandlet i overensstemmelse med retningslinjer National Comprehensive Cancer Network (NCCN). Patienterne blev fulgt op hver 3. måned inden for 1 år efter operationen, hver 6. måned i 3 år, og hvert år derefter.

Den første endepunkt var samlet overlevelse (OS), defineret som tiden fra aktiv til dato for død, datoen tabte til opfølgning eller datoen for seneste opfølgning. Det andet endepunkt var sygdomsspecifik overlevelse (DSS), og svigt blev defineret som død af lungekræft eller behandlingsrelaterede komplikationer. Yderligere endepunkt omfattede sygdomsfri overlevelse (DFS), defineret som tidsintervallet mellem datoen for den endelige resektion og afsløring af første recidiv, metastaser, eller datoen for den seneste opfølgning.

immunhistokemisk (IHC) analyse af tumor prøver

Immunhistokemi (IHC) for IGF-1R og Ki-67 blev udført. Nærmere oplysninger om IHC-analyse har tidligere [27] blevet beskrevet. IGF-1R ekspression blev scoret ved at bestemme intensiteten og procentdelen af ​​positive celler. Intensitet blev scoret som negativ (0), svagt (1), moderat (2), eller stærk (+3). Udvidelsen af ​​positive celler blev scoret i seks kategorier: ingen farvning (0), 1-5 (+1), 5-25 (+2), 25-50 (+3), 50-75 (+4), og 75-100% (+5) positive celler. En immunoreaktivitet score (IRS) blev beregnet ved at multiplicere farvningsintensitet og udvidelsen, hvilket resulterer i en skala fra 0 til 15. IRS blev delt i to grupper: negativ eller lav farvning (IRS 0-5) og positive eller høj farvning ( IRS 6-15). Ki-67 farvning blev scoret som procentdelen af ​​positive nukleare farvning celler og cutoff niveau opdelt efter de procentdele af nuklear farvning som 50% positive.

Reagenser

IGF-1Rß, phospho- IGF-1R (Tyr1135 /1136), fosfor-P44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) og phospho-Akt (Ser473) mAbs blev købt fra Cell Signaling Technology. Anti-ß-arrestin1 og anti-ß-arrestin2 mAbs var fra Abcam. Anti-GAPDH mAb var fra Santa Cruz. Human IGF-1 og metformin blev indkøbt fra Sigma. Figitumumab blev leveret af Pfizer.

Cell Culture

H446, H526 og SKBR3 celler blev indkøbt fra ATCC. H446 og H526 blev opretholdt i RPMI-H1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). SKBR3 blev opretholdt i DMEM suppleret med 10% FBS.

Transfektion

siRNA’er mod ß-arrestin-1 og SS-arrestin-2 blev opnået fra GenePharma (Shanghai, Kina). Transient transfektion af siRNA’er (30 nM) blev udført under anvendelse af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens protokol.

Western blotting assay

Proteinprøver blev opløst i lithiumdodecylsulfat prøvepuffer (Invitrogen) og lige store mængder af prøverne blev separeret ved SDS /PAGE. Nærmere oplysninger om Western blotting-analyse er blevet beskrevet tidligere [22].

densitometrianalyse

Band intensitet blev kvantificeret ved ImageJ og resultaterne var normaliseret til de tilsvarende lastning kontrol.

cellelevedygtighed Assay

Celleproliferation blev målt med MTT (Sigma Chemical). Celler blev inkuberet i 96-brønds plader, og efter passende behandling tidsrum blev cellelevedygtighed testet i henhold til producentens protokol. Tredobbelte blev udført for hver behandling.

Statistisk analyse

Forskelle i patientkarakteristika per gruppe og co-ekspression af markører blev beregnet ved Fishers eksakte test. Overlevelseskurver blev beregnet efter den Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log-rank test. At identificere prognostiske faktorer for OS og DFS blev univariate Cox regressionsanalyser udført. Student t-test eller ANOVA blev udført for at korrigere for multiple sammenligninger, som tilegnelse. Alle statistiske tests var to-sidet og blev gjort ved hjælp SPSS software 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

IGF-1R ekspressionsniveauet negativt korrelerer med overlevelse af SCLC patienter

Vi først undersøgt, om IGF-1R ekspressionsniveauet kunne forudsige overlevelse SCLC patienter. I alt 61 patienter blev inkluderet i vores undersøgelse, herunder 39 mænd og 22 kvinder, med en gennemsnitsalder på 57,21 år (spændvidde 30-75 år). Den mediane opfølgningsperiode var 40 måneder, der spænder fra 5 til 81 måneder. De vigtigste kliniske karakteristika for de patienter blev opført i tabel 1 og repræsentanten immunhistokemisk farvning blev vist i fig 1a. I korrelative analyse mellem IGF-1R ekspression og kliniske parametre, IGF-1R ekspression blev signifikant associeret med tumorstørrelse, N-status, stadium, og Ki-67 (tabel 1).

(a) immunhistokemisk farvning af IGF-1R og Ki-67 (x400) i SCLC-patientprøver ifølge ekspressionsniveauet af IGF-1R. (B) Samlet overlevelse /sygdomsspecifikke overlevelse i SCLC ifølge lav- og høj-IGF-1R udtryk. (C) sygdomsfri overlevelse i SCLC ifølge lav- og høj-IGF-1R udtryk

Vi evaluerede den prognostiske værdi af IGF-1R Udtryk med relation til tre slutpunkter:. Samlet overlevelse (OS ), sygdomsspecifikke overlevelse (DSS), og sygdomsfri overlevelse (DFS). Vi fandt, at alle dødsfald var SCLC-relateret, så DSS havde samme resultat som OS. Kaplan-Meier-kurver i de to patientgrupper til OS /DSS blev vist i fig 1b. OS /DSS var signifikant lavere hos patienter med IGF-1R-low tumorer end dem med IGF-1R-høje tumorer (P = 0,031). Lignende resultater blev også opnået for DFS analyse (p = 0,048) (fig 1c). Vores resultater viste den potentielle anvendelse af IGF-1R som en markør for dårlig prognose for SCLC. Endvidere har vi brugt Cox proportional hazards regressionsmodeller at bestemme de uafhængige prædiktorer for OS /DSS og DFS (tabel 2). Køn, stadium og IGF-1R ekspression var betydelige for OS /DSS (p = 0,006, 0,039, 0,037) i univariate Cox-analyse, mens kun IGF-1R ekspression viste sig at være en uafhængig markør i den multivariate Cox analyse (p = 0,037). For DFS, køn, stadium og IGF-1R ekspression var statistisk signifikant i univariate Cox-analyse (p = 0,002, 0,023, 0,048), mens der ikke parametre var signifikant i den multivariate Cox-analyse. Samlet set foreslog vores kliniske data, at IGF-1R ekspressionsniveauet negativt korreleret med overlevelse af patienter, hvilket indebærer, at IGF-1R-targeting terapi, såsom CP, har potentielle terapeutiske værdier.

antitumorvirkninger af CP i SCLC-cellelinjer

Da IGF-1R er sandsynligvis til at spille en vigtig rolle i SCLC, hæmning af IGF-1R af CP, som konkurrerer med IGF at binde receptoren, kan være nyttigt at behandle SCLC. Vi valgte H446 og h526, typiske SCLC-cellelinier, at undersøge virkningerne af CP. Som vist i figur 2a, IGF-1-stimulering resulterede i IGF-1R auto-phosphorylering og aktivering af nedstrøms PI3K /AKT og MEK /ERK signalveje i H446 og H526 celler, mens SKBR3, en brystcancer-cellelinie kendt for at udtrykke lav mængde af IGF-1R, ikke respons godt.

(a) Celler blev sultet i 12 h og stimuleret med 6.5nM IGF-1 i 10 min. p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK, p-AKT, t-AKT og GAPDH blev påvist ved WB. (B) Celler blev behandlet med 0.065nM, 0.65nM, og 6.5nM af CP i 48 timer med nærvær eller fravær af serum. Cellelevedygtighed blev testet gennem MTT. Antallet af levedygtige celler efter CP-behandling blev præsenteret som procent af ubehandlede celler. Vi gjorde hvert forsøg for tre gange, og data blev repræsenteret som middelværdi ± SEM. Statistisk analyse: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

Vi derefter undersøgte følsomheden af ​​SCLC-cellelinjer til CP behandling.. Som vist i figur 2b, efter behandling med 0.65nM CP, H446 og H526 cellelevedygtighed sammenlignet med ubehandlede kontrolceller var 84,2% vs. 48,6% og 75,1% vs. 63,9% i serum-tilsat medium og serum-frit medium (SFM ), henholdsvis mens SKBR3 cellelevedygtighed ændrede ikke meget ved CP behandling. Dette indebærer, at virkningerne af CP er IGF-1R afhængig. SFM gruppe skulle beskytte konkurrencen af ​​IGF-1 indeholdt i normalt serum medium. CP blev oprindeligt designet til at konkurrere med IGF1 for IGF-1R at forhindre receptoraktivering, og den anti-proliferative virkning i serum-tilsat medium støttede denne teori. anti-proliferative virkning i SFM betingelser foreslås imidlertid, at CP enten yderligere kunne undertrykke nogle basale IGF-1R-aktivitet, der var påvises ved Western blot, eller det kan have andre anti-proliferation /apoptosis virkninger uafhængigt af IGF-1R auto-phosphorylering /aktivering.

CP induceret IGF-1R endocytose /nedregulering med øget ERK-aktivering, men ikke til IGF-1R og PI3K /AKT

Som nogle mAbs kunne inducere målrettet receptor endocytose og down- regulering, undersøgte vi, om CP har lignende virkninger. Som vist i figur 3a, kunne CP nedregulere IGF-1R i en tidsafhængig måde, som svarer til IGF-1-induceret receptor endocytose /nedbrydning. Interessant, sammenlignet med IGF-1, CP faldt støt IGF-1R ekspression mens IGF-1R begyndte at udtrykke tilbage efter 48 timer af IGF-1-stimulering (figur 3a), hvilket antyder en kraftig og vedvarende virkning af CP på IGF-1R nedregulering .

(a) H446 og H526 celler blev serum sultet i 12 timer og behandlet med enten 0.65nM CP eller 6.5nM IGF-1. IGF-1R og GAPDH blev påvist via WB. Intensiteten af ​​IGF-1R blev kvantificeret ved densitometri, normaliseret til GAPDH, og vist som en procentdel af intensiteten ved 0h. (B) Celler blev sultet i 12 timer og behandlet med 6.5nM IGF-1 eller 0.65nM CP for en serie af tidspunkter. Cellelysater blev analyseret via WB for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH. (C) Celler blev sultet i 12 timer og behandlet med 6.5nM IGF-1 eller 6.5nM IGF-1 plus 0.65nM CP for en række tidspunkter. Cellelysater blev analyseret via WB for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH. (D) Celler blev behandlet med U0126 (0, 0,5, 1, 2, 3, 5, 8, 10 uM) i 60 min, og derefter inkuberet med eller uden 0.65nM CP i 48 timer. Cellelevedygtighed blev testet via MTT. Cellelysater blev fremstillet med forskellige koncentrationer af U0126 med eller uden CP, p-ERK og t-ERK blev analyseret ved WB. (E) Knock ned af ß-arr1 og ß-arr2 af siRNA i H446 celler. (F) H446 celler blev slået ned for enten ß-arr1 eller ß-arr2. Celler blev derefter sultet i 12 timer, behandlet med 0.65nM CP eller 6.5nM IGF-1 i 24 timer. Celler transficeret med scrambled siRNA som kontrol. IGF-1R og GAPDH blev påvist via WB. (G) H446 celler blev slået ned for enten ß-arr1 eller ß-arr2. Celler blev derefter sultet i 12 timer, behandlet med 0.65nM CP eller 6.5nM IGF-1 i 10 min. Celler transficeret med scrambled siRNA som kontrol. p-IGF-1R, p-ERK og GAPDH blev påvist via WB. Vi gjorde hvert forsøg for tre gange, og data blev repræsenteret som middelværdi ± SEM. Statistisk analyse:. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

Vækst faktor-induceret receptor endocytose er kritisk for RTK-signal transduktion og hæmning af endocytose kunne dæmpe nedstrøms signalering veje [28]. Fordi CP synes at have en lignende effekt som IGF-1 på IGF-1R endocytose og nedbrydning, undersøgte vi, om CP behandling kunne ændre de nedstrøms signalveje. Som vist i figur 3b, efter celle sult, kunne IGF-1 aktivere IGF-1R-signalvejen i en tidsafhængig måde, med Pakt og pERK toppede efter 10 minutters stimulering. CP undladt at inducere auto-phosphorylering af IGF-1R eller aktivere PI3K /AKT (Fig 3b). Aktivering af ERK var lidt højere, især efter 60min af CP behandling, men det var stadig meget svagere end den aktiveres af IGF-1 (fig 3b). Endvidere undersøgte vi virkningen af ​​CP på IGF-1 afhængige nedstrøms signalering. Som vist i figur 3c, kunne tilsætning af CP dæmpe phosphorylering af IGF-1R, AKT og ERK udskille stimuleret af IGF-1. Vore data antydede, at CP kunne nedregulere IGF-1R i H446 og H526 celler, hvilket sandsynligvis gennem mAb-induceret receptor endocytose /nedbrydning, og endocytose receptor ikke kunne aktivere nedstrøms signalveje betydeligt i forhold til IGF-1. Denne næsten “tavse” receptor nedregulering fænomen kan til dels forklare de antitumorvirkninger af CP.

Inhibering af ERK-aktivering yderligere forbedrer den terapeutiske virkning af CP til at målrette SCLC celler

Vi derefter forsøgt at kombinere CP med andre stoffer for at øge sin effektivitet mod SCLC. Vi bemærkede, at der var nogle basale MEK /ERK-aktivering i H446 og H526 celler efter celle sult og pERK niveauet blev forøget endda lidt efter CP behandling (figur 3b). Eftersom CP-induceret ERK-aktivering kan ligge til grund mekanismen for SCLC celleoverlevelse og medikamentresistens under CP terapi, undersøgte vi virkningerne af at kombinere CP med U0126, en specifik MEK /ERK-inhibitor til at inhibere den nedstrøms ERK-aktivering, på H446 cellelinien . Som vist i figur 3d, cellelevedygtighed holdes faldende med stigende koncentration af U0126, hvilket antyder en vigtig rolle af MEK /ERK-signalering i SCLC. Endvidere var der en additive virkninger af U0126 plus CP behandling sammenlignet med enten U0126 kun eller CP kun, hvilket indebærer en potentiel fordel ved at hæmme ERK under CP terapi. Og western blot Resultatet viste den hæmmende effekt af U0126 på MEK /ERK-signalering. Disse resultater er i overensstemmelse med Zinn.

et al

., Som erklærede, at lav forbehandling p-ERK-niveau kan være tegn på følsomhed over for IGF-1R lille molekyle-hæmmer i SCLC [29].

Knockdown af SS-arrestin2 specifikt hæmmer MEK /ERK-aktivering i CP-behandlede SCLC celler

Vi har vist, at CP kunne fremkalde IGF-1R nedbrydning og ERK aktivering. Vi derefter forsøge at undersøge mekanismen af ​​denne IGF-1R auto-phosphorylering-uafhængig ERK-aktivering. Som en af ​​de vigtigste virkninger af CP var at fremkalde IGF-1R endocytose /nedbrydning, besluttede vi at fokusere på ß-arrestiner (SS-Arr), en central familie af proteiner involveret i IGF-1R ubiquitinering og endocytose [30]. Der er to ß-arrestin isoformer, SS-arr1 og 2, og de er blevet foreslået at være funktionelt overflødige [31,32]. Vi brugte siRNA til knockdown specifikke ß-arrestin (ß-arr1 KD eller ß-arr2 KD) i H446 celler (Fig 3e), med scrambled siRNA som kontrol. Vi først undersøgt deres virkninger på IGF-1R nedbrydning. KD af ß-arr1, men ikke ß-arr2, reddede IGF-1-induceret receptor nedbrydning; dog KD hverken ß-arr1 eller ß-arr2 kunne hæmme CP-induceret IGF-1R nedbrydning (fig 3f). Vi undersøges yderligere virkningerne af ß-arrestiner KD på ERK aktivering. Overraskende, når vi slået ned ß-arr1 i H446 celler, det pERK niveau blev dramatisk forøget i både IGF-1- og CP-behandlede grupper (fig 3g), hvilket antyder en inhibitorisk rolle af ß-arr1 under ERK-aktivering. I modsætning hertil i ß-arr2 KD celler aktiveringen af ​​ERK var lavere i begge IGF-1 og CP-behandlede celler sammenlignet med kontrolceller. Vore data antydede, at ß-arr2 var kritisk for ERK-aktivering, og kombinationen af ​​CP med ß-arr2 KD dramatisk nedsatte pERK under detektionsgrænsen af ​​Western blot, hvilket indikerer potentielle terapeutiske værdier for at kombinere CP med ß-arr2 inhibitor til behandling af SCLC . Vores resultater er også i overensstemmelse med offentliggjort litteratur, hvor ß-arrestiner blev revideret til stillads tyrosinkinasen og kan føre til aktivering af ERK i G-protein-koblede receptorer (GPCR) [33].

Metformin hæmmer SCLC gennem IGF-1R signalvejen

Næste vi spurgte om vi kunne bruge CP sammen med en anden potentiel anti-cancer medicin, metformin, for at øge dens effektivitet. Vi forsøgte først at bekræfte antitumorvirkninger af metformin i SCLC ved behandling H446 og H526 celler med metformin alene eller sammen med IGF-1 (fig 4a). Fordi IGF-1-stimulering svækkede de antiproliferative virkninger af metformin, vi spekuleret på, at metformin og CP kan have additive antitumorvirkninger. Vi vurderede også konsekvensen af ​​metformin på IGF-1R-signalvejen, og som vist i figur 4b, blev IGF-1-stimulerede IGF-1R phosphorylering og den nedstrøms PI3K /AKT og MEK /ERK-aktivering faldt efter behandling af celler med metformin. Også, svarende til tidligere resultater, KD af SS-arr1 fremmet ERK aktivering mens KD af SS-arr2 svækket ERK-aktivering, og disse effekter forekom med både IGF-1 kun og IGF-1 plus metformin forhold i H446 cellelinje (Fig 4c) . Endvidere metformin også kunne nedregulere IGF-1R i en tidsafhængig måde i H446 celler (Fig 4d). Samlet, selvom de præcise mekanismer af metformin anti-cancer effekter var undvigende, foreslog vores data, at det virker delvist gennem inhibering IGF-1R-signalvejen.

(a) H446 og H526-celler blev behandlet 48h med metformin (3mM ) alene, IGF-1 (6.5nM) alene eller IGF-1 plus metformin. Cellelevedygtighed blev testet via MTT. Antallet af levedygtige celler efter behandlinger er præsenteret som en procentdel af ubehandlede celler. (B) Efter 12 h sult, blev H446 og H526-celler behandlet med eller uden 3 mM metformin i 1 time. Celler blev derefter behandlet med 6.5nM IGF-1 for en række tidspunkter. Cellelysater blev analyseret via WB for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-AKT, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH. (C) ß-arr1 og ß-arr2 KD H446-celler blev udsultet i 12 h og behandlet med eller uden 3 mM metformin i 1 time. Celler blev derefter stimuleret med 6.5nM IGF-1 i 10 min. Cellelysater blev analyseret for p-IGF-1R, p-ERK og GAPDH gennem WB. (D) Celler blev inkubering med 3 mM metformin til en række tidspunkter, og niveauet af total IGF-1R blev påvist via WB. Vi gjorde hvert forsøg for tre gange, og data blev repræsenteret som middelværdi ± SEM. Statistisk analyse: * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

Additive virkninger af CP med metformin til at målrette SCLC

Eftersom virkningerne af metformin. og CP var ret ens i form af receptor nedregulering og IGF-1R signalvejen hæmning, vi spurgte så, hvis der er nogen tilsætningsstoffer anti-tumor effekt, når man kombinerer metformin med CP. Vi testede H446 cellelevedygtighed (MTT-assay) efter behandling med CP alene eller CP plus metformin, og eksperimentet blev udført både med og uden serum. I lighed med tidligere resultater, CP havde mere dramatiske anti-proliferative virkninger i udsultede betingelser sammenlignet med serum-holdige betingelser (figur 5a). Interessant nok metformin fremmes CP virkninger mod SCLC celler i både serum-indeholdende (82,6% vs. 64,5%) og SFM (49,4% vs. 40,7%) betingelser.

(a) H446-celler blev forbehandlet med 3mM Metformin i 1 time, og derefter 0.65nM CP blev tilsat med nærvær eller fravær af serum. MTT blev udført for at teste cellernes levedygtighed efter 48 inkubering. Antallet af levedygtige celler efter behandling er vist som procent af ubehandlede celler. (B) Efter 12 h sult blev celler behandlet med eller uden 3 mM af metformin i 1 h, og derefter behandlet med 0.65nM CP i 10 min. Cellelysater blev analyseret for p-IGF-1R, t-IGF-1R, p-ERK, t-ERK og GAPDH via WB. (C) 3 mM Metformin blev tilsat til celler i 1 h, derefter 0.65nM CP blev tilsat til en række tidspunkter. Ekspressionsniveauet af IGF-1R og GAPDH blev påvist gennem WB. (D) ß-arr1 KD H446-celler blev behandlet med 3 mM metformin i 1 time, og derefter inkuberet med 0.65nM CP i 24 timer. blev påvist niveauer af IGF-1R og GAPDH via WB. Vi gjorde hvert forsøg for tre gange, og data blev repræsenteret som middelværdi ± SEM. Statistisk analyse:. * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001

Vi undersøgte derefter den mekanisme af dette tilsætningsstof anti-cancer effekt. Fordi CP alene stimuleret pERK, og vi har vist nogle additive lægemiddelvirkninger med MEK /ERK-hæmmer, kan metformin handle på samme måde for at hjælpe slukke ERK aktivering. Men selv om CP alene stadig øget pERK niveau, der kombinerer CP med metformin kunne ikke hæmme det (figur 5b). Derfor er vores resultater underforstået, at lægemidlet additive effekt af metformin er forskellig fra den af ​​MEK /ERK-inhibitor. Vi undersøgte derefter, om metformin havde nogle additive virkninger på receptor nedregulering. Som vist i figur 5c, blev tidsafhængig IGF-1R nedbrydning set i både CP alene og CP og metformin, og metformin yderligere forbedre CP-induceret receptor nedregulering. Også, svarende til tidligere resultater, ß-arr1 KD kunne delvist redde IGF-1 plus metformin fremkaldt IGF-1R nedregulering, men ikke for CP plus metformin (figur 5d), mens SS-arr2 KD kunne redde hverken (data ikke vist). Samlet set vores resultater foreslog en additiv terapeutisk effekt af CP med metformin til at målrette SCLC. Denne multikombinerbare terapeutisk virkning kan være gennem induktion af yderligere IGF-1R nedregulering, og vores data viste, at denne proces blev reguleret uafhængigt af ß-arrestiner.

Diskussion

antistoflægemidler er for nylig været meget anvendt i behandlinger mod kræft. Selvom CP viste nogle opmuntrende resultater i kliniske fase II-undersøgelser til behandling af flere kræftformer, resultatet af kliniske fase III-forsøg var skuffende. En af de største ulemper ved CP var manglende effekt. Et andet nyligt klinisk forsøg for at teste CP blev reduceret ved opsigelse på grund af langsom rekrutteringen af ​​patienter. Derfor øjeblikket er der et behov for at vurdere, om CP har nok terapeutiske værdier for at genoptage det kliniske forsøg, og hvis ja, hvordan vi kunne fremme rekrutteringen af ​​patienter. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi den mekanisme af CP og evalueret potentialet af kombinationsbehandling at målrette SCLC.

Vi undersøgte tværs forskellige SCLC patientens væv og i overensstemmelse med ædle resultater, vi fandt patienter med højere IGF-1R ekspression tumorer havde en dårligere overlevelse (fig 1b), hvilket tyder på en potentiel terapeutisk værdi CP til at målrette SCLC. Svarende til SCLC patientens væv, H446 og H526 celler har relativt høj ekspression af IGF-1R (fig 2a), og CP behandling kunne hæmme proliferation af H446 og H526 celler i både serum-tilsat, og serumfrie betingelser (figur 2b). Den anti-proliferative virkning i serumfrit betingelser var overraskende, fordi IGF-1R var generelt ikke-phosphoryleret og inaktive uden serum og den vigtigste virkning af CP mentes at konkurrere med IGF-1 til at binde /hæmme IGF-1R. Vores resultat antydede, at ved siden af ​​som en IGF-1 konkurrent, kunne CP også hæmme SCLC via en mekanisme, der er uafhængig af IGF-1R auto-phosphorylering. Vi fandt CP kunne inducere IGF-1R endocytose /nedregulering, som var mere potent end den induceret af IGF-1, og CP-induceret endocytose IGF-1R holdt phosphorylerede og inaktive (figur 3b). Derfor kunne en mulig forklaring være den endocytose ikke-phosphoryleret IGF-1R kan udløse andre signalveje, der fremmer de antiproliferative /apoptose effekter. Imidlertid bør denne hypotese valideres i fremtidige studier.

Selvom CP ikke kunne aktivere PI3K /AKT, der er nedstrøms for IGF-1R signalvejen, viste vi, at CP kunne fremme ERK aktivering, som blev formidlet via ß -arrestin2 mens hæmmet af ß-arrestin1.