PLoS ONE: tumorinfiltrerende T-celler korrelerer med NY-ESO-1-specifikke Autoantistoffer i kræft i æggestokkene

Abstrakt

Baggrund

Tumor-infiltrerende CD8 + T-celler er korreleret med forlænget progressionsfri og samlet overlevelse i epitelial ovariecancer (EOC). En betydelig del af EOC patienter mount autoantistofniveauer reaktioner på forskellige tumorantigener, men forholdet mellem autoantistoffer og tumor-infiltrerende T-celler er ikke blevet undersøgt i EOC eller anden human cancer. Vi antager, at autoantistoffer og T-celle responser kan være korreleret i EOC og rettet mod de samme antigener.

Metode og vigtigste resultater

Vi opnåede matchet serum og tumorvæv fra 35 patienter med høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene. Serumprøver blev bedømt ved ELISA for autoantistoffer til den fælles tumorantigen NY-ESO-1. Tumorvæv blev undersøgt ved immunhistokemi for ekspression af NY-ESO-1, forskellige T-celle-markører (CD3, CD4, CD8, CD25, foxp3, TIA-1 og Granzyme B) og andre immunologiske markører (CD20, MHC klasse I og MHC klasse II). Lymfatisk infiltrerer varierede meget blandt tumorer og omfattede celler er positive for CD3, CD8, TIA-1, CD25, foxp3 og CD4. Seks og tyve procent (9/35) af patienterne demonstrerede serum IgG autoantistoffer til NY-ESO-1, der var positivt korreleret med ekspression af NY-ESO-1 antigen ved tumorceller (r = 0,57, p = 0,0004). Autoantistoffer til NY-ESO-1 var forbundet med øget tumor-infiltrerende CD8 +, CD4 + og Foxp3 + celler. I en individuel HLA-A2 + patient med autoantistoffer mod NY-ESO-1, CD8 + T-celler isoleret fra fast tumor og ascites var reaktive på NY-ESO-1 af IFN-y ELISPOT og MHC klasse I pentamer farvning.

Konklusion og betydning

Vi viser, at tumor-specifikke autoantistoffer og tumor-infiltrerende T-celler er korreleret i human cancer og kan være rettet mod det samme mål antigen. Dette indebærer, at autoantistoffer kan samarbejde med tumor-infiltrerende T-celler til at påvirke kliniske resultater i EOC. Endvidere kan serologiske screeningsmetoder vise sig nyttig til at identificere klinisk relevante T-celle-antigener til immunterapi

Henvisning:. Milne K, Barnes RO, Girardin A, Mawer MA, Nesslinger NJ, Ng A, et al. (2008) Tumor-infiltrerende T-celler korrelerer med NY-ESO-1-specifikke autoantistoffer i æggestokkene. PLoS ONE 3 (10): e3409. doi: 10,1371 /journal.pone.0003409

Redaktør: Aric Gregson, University of California Los Angeles, USA

Modtaget: Juni 6, 2008; Accepteret: September 17, 2008; Udgivet: 15 oktober 2008

Copyright: © 2008 Milne et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Britisk Columbia Cancer Foundation, Canary Foundation, US Department of Defense (OC000018). Ingen af ​​sponsorerne havde nogen rolle i udformningen og gennemførelse af undersøgelsen, i indsamling, analyse og fortolkning af dataene, eller i forberedelsen, anmeldelser, eller godkendelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser.: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

Epithelial ovariecancer (EOC) er en udfordrende sygdom, der rammer mere end 190.000 kvinder verden over hvert år (International Agency for Research on cancer) . Den høje dødelighed tilskrives det faktum, at de fleste patienter er diagnosticeret med dissemineret sygdom, ofte med omfattende ascites. Standard behandling indebærer cytoreduktive kirurgi efterfulgt af taxane- og platinbaseret kemoterapi [1]. Over 80% af patienterne er meget lydhøre over for frontline behandling, men 60-70% oplever tilbagefald inden for 2-5 år, og i sidste ende bukke under for deres sygdom [2], [3].

På trods af disse uheldige statistikker, 20-30% af EOC patienterne overlever fem år eller mere efter diagnosen. Gunstige prognostiske faktorer omfatter tidlig fase, ikke-serøs histologi, lav kvalitet, god performance status, og optimal kirurgisk debulking [4], [5]. Desuden har flere nylige undersøgelser vist en sammenhæng mellem tumorinfiltrerende CD3 + CD8 + T-celler og gunstige resultater [6], [7]. Zhang

et. al.

først rapporteret, at patienter med CD3 + T-celle infiltrater i tumor epitel var steget progressionsfri og samlet overlevelse [8]. Dette er blevet bekræftet af to andre undersøgelser [9], [10], og to grupper har udvidet denne konstatering til CD8 + T-celle delmængde især [11], [12]. Desuden har tilstedeværelsen af ​​CD3 + CD56 + -T-celler i ascites blevet forbundet med platin følsomhed [13]. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser en positiv sammenhæng mellem overlevelse og udtryk af interferon-γ (IFN-γ) [14], [15], IFN-γ receptor [16], IL-18 [17], og MHC klasse i [18], [19], som alle er karakteristiske for CD8 + T-cellereaktioner. I modsætning hertil er tilstedeværelsen af ​​tumor-infiltrerende CD25 + foxp3 + T-celler i EOC korreleret med ringere overlevelse [11], [20] – [22]. , Fremgår således det, at balancen af ​​CD8 + effektor T-celler til CD25 + Foxp3 + regulatoriske T-celler er en vigtig determinant for kliniske resultater i EOC.

Udover tumorinfiltrerende T-celler, mange EOC patienter mount serum autoantistof svar på en række forskellige tumorantigener, herunder NY-ESO-1, HOXA7, Ep-CAM, HSP-90, MUC-1 og p53 [23] – [25]. I type I diabetes og andre autoimmune tilstande, udvikling af autoantistoffer responser varsler vævsinfiltration og destruktion af autoreaktive T-celler [26]. Vi hypotese derfor, at EOC patienter kan vise et tilsvarende forhold mellem tumor-specifikke autoantistoffer reaktioner og tumor-infiltrerende lymfocytter. Denne hypotese blev testet i en kohorte af 35 fremskredent stadium, høj kvalitet serøse EOC sager, hvor matchede serum og tumor prøver var til rådighed. Brug af NY-ESO-1 som en test-antigen, demonstrerer vi for første gang en sammenhæng mellem tumorspecifikke autoantistoffer og tumor-infiltrerende T-celler. Vores resultater hæve den mulighed, at autoantistoffer kan spille en rolle i den tidligere indregnet forhold mellem tumor-infiltrerende T-celler og kliniske resultater i EOC.

Resultater

Study kohorte

Vi undersøgt forholdet mellem tumorspecifikke autoantistoffer og tumor-infiltrerende lymfocytter brug af afpassede tumor og serumprøver fra en retrospektiv kohorte af 35 patienter med high-grade serøs EOC (tabel 1). Vi har valgt at fokusere på en enkelt histologisk undertype, som andre underklasser af EOC udviser distinkte biologiske og kliniske egenskaber, der kunne have gendrev analyse [27]. Alle blodprøver blev opsamlet før kirurgi eller kemoterapi, og alle tumorprøver blev opnået på tidspunktet for primær cytoreduktiv kirurgi før kemoterapi. Kontrol blodprøver blev opnået fra 60 alderskategori kvinder uden kendt personlig historie af kræft.

Analyse af tumor-infiltrerende lymfocytter

Tumor-infiltrerende lymfocytter blev vurderet ved immunhistokemisk (IHC ) under anvendelse af antistoffer til en række immunologiske markører (figur 1, tabel 2). Alle rå IHC data findes i supplerende tabeller S1 og S2. Kun 23% (8/35) af de evaluerbare tumorer viste signifikante CD20 + B-celle infiltrater. I modsætning hertil 94% (33/35) af tumorer havde påviselige CD3 + T-celle-infiltrater. Farvning med antistoffer mod CD4 og CD8 afslørede, at 59% (20/34) og 69% (24/35) af de evaluerbare tumorer havde betydelig CD4 + og CD8 + cellulære infiltrater hhv. CD4 + og CD8 + celler blev stærkt korreleret (r = 0,69, p 0,0001). Alle evaluerbare tumorer (27/27) udtrykte MHC klasse I til en vis grad, indikerer de kunne teoretisk foreliggende antigen til de infiltrerende CD8 + T-celler. Halvfjerds-to procent (18/25) af tumorer udtrykte MHC klasse II og dermed kunne teoretisk til stede antigen til CD4 + T-celler.

Da mange tumorer havde tætte CD8 + T-celle infiltrater, vi analyserede væv til TIA-1 og Granzyme B, som begge udtrykkes af CD8 + cytotoksiske T-celler samt naturlige dræberceller [28] – [30]. Halvfjerds-tre procent (25/34) af tumorer havde betydelig TIA-1 + cellulære infiltrater, som viste en positiv korrelation med CD8 + infiltrater (r = 0,83, p 0,0001) (Figur 2). I modsætning hertil kun 20% (7/35) af tumorerne havde signifikant Granzyme B + cellulære infiltrater (data ikke vist); som forventet, 6 af de 7 positive tumorer var også positive for CD8 + -celler.

Tumorer blev også analyseret for cellulære infiltrater udtrykker foxp3, en markør for aktiverede T-celler og regulatoriske T-celler [31]. Sixty-seks procent (23/35) af de evaluerbare tumorer havde signifikant foxp3 + infiltrater (figur 2), der var stærkt korreleret til CD4 + celler (r = 0,73, p 0,0001). Vi evaluerede også ekspression af CD25, en yderligere markør for aktiverede og regulatoriske T-celler [32]. Halvtreds procent (17/34) af tumorer havde signifikant CD25 + cellulære infiltrater (figur 2), der var stærkt korreleret med CD4 + -celler (r = 0,58, p = 0,0003) og foxp3 + -celler (r = 0,75, p 0,0001).

Vi yderligere stratificeret T celleinfiltrater efter deres epitel- eller stromal placering i tumoren, som intraepiteliale CD3 + /CD8 + T-celler i særdeleshed er blevet korreleret med øget overlevelse i EOC [8] – [12]. Til denne analyse, vi først målte tumoren præparat som defineret af epithelial:stromal forhold i hvert væv kerne og derefter beregnet densiteten af ​​T-celler pr epitel eller stroma. Som opsummeret i tabel 3, tætheden af ​​CD3 + T-celler pr enhed af tumor epitel varierede fra 0-17, med en median på 4,6. Til sammenligning er densiteten af ​​CD3 + T-celler pr enhed af tumor stroma varierede fra 0-138, med en median på 16,3. Generelt blev tætheden af ​​CD3 + T-celler i tumor epitel og stroma kun svagt korreleret (r = 0,34, p = 0,048), og der var mange eksempler på tumorer med tæt CD3 + infiltrater i epitel, men ikke stroma, og omvendt, i stroma men ikke epitel. Svarende til CD3 + celler, CD8 +, CD4 +, foxp3 + og TIA-1 + -celler var generelt større massefylde i tumor stroma end tumor epitel (tabel 3).

sammensætning tumorinfiltrerende lymfocytter efter neoadjuverende kemoterapi

TMA anvendt i ovenstående analyser også indeholdt en ekstra kohorte af 15 tumorer fra kvinder, der, som en del af et klinisk forsøg, havde gennemgået neoadjuverende platin /taxan kemoterapi forud for deres primære operation. Som med 35-tilfælde kohorte, disse kvinder havde høj kvalitet serøs EOC. Tumorer var blevet resektion efter tre cykler af carboplatin /taxol kemoterapi. Selvom prøvens størrelse var lille, det var en enestående lejlighed til at vurdere virkningerne af kemoterapi på tumor-infiltrerende lymfocytter. Ved de fleste parametre, lymfocytiske infiltrater var ens mellem behandlede og ubehandlede tumorer. Men viste behandlede tumorer en ensartet tendens i retning af øget nedsivning af alle undergrupper af T-celler vurderes, og denne stigning var signifikant højere for CD3 + (median 80 vs. 35, p = 0,02) og CD8 + (median 78 vs. 30, p = 0,013) celler (data ikke vist)

Serum autoantistoffer reaktioner på NY-ESO-1

Selvom æggestokkene kræftpatienter demonstrerer autoantistofniveauer svar på et bredt repertoire af antigener [23] – [25]., vi fokuserede på en af ​​de mest immunogene antigener, NY-ESO-1 [24], [33], [34]. Sixty kontrolsera blev analyseret for IgG autoantistoffer til rekombinant NY-ESO-1, og middelværdien og standardafvigelsen for OD-værdierne blev beregnet (Supplerende tabeller S1 og S2). Individuelle sera blev scoret som positive, hvis deres OD-værdien var lig med eller større end to standardafvigelser fra middelværdien for kontrolpersoner. I overensstemmelse med publicerede resultater, 26% (9/35) af æggestokkene kræfttilfælde demonstrerede IgG autoantistoffer til NY-ESO-1, sammenlignet med kun 5% (3/60) af kontroller (figur 3A).

( A) Serum autoantistoffer reaktioner på NY-ESO-1 i 35-patient kohorte. Autoantistof reaktioner er rapporteret som antallet af standardafvigelser fra gennemsnittet af 60 alders- og køns- matchede kontroller uden kendt personlig historie af kræft. (B, C) immunhistokemisk analyse af NY-ESO-1-ekspression i to repræsentative serøse tumorer i æggestokkene med høj (B) og negative (C) udtryk af antigenet.

For at afgøre om autoantistof svar til NY-ESO-1 korreleret med ekspression af det tilsvarende antigen, matchede tumorprøver blev analyseret ved IHC for ekspression af NY-ESO-1. Af 34 evaluerbare tumorer, 5 (14,7%) scorede positive for NY-ESO-1 antigen (figur 3B). Alle fem af disse tilfælde var også positive for autoantistoffer mod NY-ESO-1. I modsætning hertil 4 tilfælde var positive for NY-ESO-1-specifikke autoantistoffer, men negativ for NY-ESO-1 antigen udtryk.

Korrelationer mellem autoantistofniveauer svar og lymfatisk infiltrerer

Vi næste undersøgt, om serum autoantistoffer mod NY-ESO-1 blev korreleret med tumor-infiltrerende lymfocytter. Til denne analyse fandt vi epitel- og stromal T celleinfiltrater særskilt som beskrevet ovenfor. Vi klassificerede sager som værende positiv eller negativ for autoantistoffer til NY-ESO-1 ved hjælp af en cut-point af to standardafvigelser fra middelværdien af ​​kontrolgruppen (Supplerende Borde S1 og S2). Af Mann Whitney t-test, patienter med autoantistoffer mod NY-ESO-1 havde en signifikant større stromal tæthed af CD8 + -celler (p = 0,011), Foxp3 + -celler (p = 0,013), og CD4 + -celler (p = 0,026). Således autoantistoffer mod NY-ESO-1 viste en signifikant korrelation til T-celle-infiltrater, især i tumor stroma.

Anerkendelse af NY-ESO-1 af autoantistoffer og tumor-infiltrerende CD8 + T-celler fra den samme patient

korrelationen mellem autoantistoffer til NY-ESO-1 og tumor-infiltrerende T-celler foreslået den mulighed, at tumor-infiltrerende T-celler kan genkende NY-ESO-1 i seropositive patienter. For at løse dette problem, vi indsamlede blod, tumor og ascites prøver fra et prospektivt kohorte af 15 nydiagnosticerede serøse EOC patienter. To patienter var positive for serum autoantistoffer mod NY-ESO-1. Af disse ét tilfælde (IROC013) var HLA-A2 +, hvilket tillader T-celler, der skal optælles ved flowcytometri med HLA-A2 pentamerer lastet med en kendt CD8 + epitop fra NY-ESO-1 (figur 4A). NY-ESO-1-specifikke CD8 + T-celler var sjældne i perifert blod fra denne patient (0,22% af CD8 + -celler), men blev beriget i ascites og fast tumor (1,53% og 6,64% af CD8 + celler, henholdsvis). Endvidere T-celler fra ascites og faste tumor produceret IFN-γ i respons til NY-ESO-1-peptid (figur 4B), men ikke kontrol peptider afledt af p53, HER-2 /

neu

eller WT-1 ( data ikke vist). Faktisk, i ascites reaktionen på NY-ESO-1 var næsten lige så stærk som den, der ses til CEF viral kontrol peptider. Interessant nok tumorvæv fra denne patient viste tætte CD3 + og CD8 + T-celle infiltration af tumor stroma men ikke epitel (figur 4C), svarende til det mønster almindeligvis ses med autoantistof-positive patienter i retrospektiv kohorte. Trods stigende en stærk humoral og T-celle respons til NY-ESO-1, fast tumor fra denne patient farvet negativ for ekspression af NY-ESO-1-antigenet; dog ascites fra denne patient indeholdt NY-ESO-1-positive celler (figur 4C).

(A) MHC klasse I-pentamer analyse demonstrerer berigelse af NY-ESO-1-specifikke CD8 + T-celler i ascites og fast tumor i forhold til perifert blod. De indrammede områder og tilhørende tal repræsenterer procentdelen af ​​pentamer-positive celler i forhold til de samlede CD8 + celler. (B) ELISPOT-analyse af IFN-γ-produktion af T-celler efter stimulering med et HLA-A2-bindende peptid fra NY-ESO-1. Dataene er angivet som antallet af IFN-y-producerende celler pr 1 × 10

6 bulk-celler fra de angivne vævsrum. (C) Immunohistokemisk analyse af tumor-infiltrerende CD3 + og CD8 + T-celler i tumor stroma, og ekspression af NY-ESO-1-antigenet. Mens den faste tumor var negative for ekspression af NY-ESO-1, en fraktion af celler fra ascites var positive. Den cellulære fraktion af ascites indeholdt også cytokeratin-positive epitelceller, formentlig af tumor oprindelse (data ikke vist).

Discussion

Brug matchede serum- og tumorprøver fra 35 patienter med høj -Grade serøs EOC, har vi påvist en sammenhæng mellem tumorinfiltrerende T-celler og tumorspecifikke autoantistoffer. Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse for at identificere en sådan sammenhæng i nogen human cancer. Specifikt tilstedeværelsen af ​​NY-ESO-1-specifikke IgG autoantistoffer i serum korrelerede med infiltration af tumor stroma af celler, der udtrykker CD8, CD4 og foxp3. Desuden er der i den enkelte patient med autoantistoffer mod NY-ESO-1, svarende ascites og faste tumorprøver blev vist at være beriget for NY-ESO-1-reaktive CD8 + T-celler, som bedømt ved MHC klasse I pentamer farvning og IFN-γ ELISPOT. Disse resultater rejser muligheden for, at autoantistoffer svar kan samarbejde med tumor-infiltrerende T-celler til at påvirke kliniske resultater i EOC.

Udover NY-ESO-1-specifikke autoantistoffer, har flere faktorer udtrykt af ovarietumorer vist en positiv korrelation med tumor-infiltrerende T-celler, herunder kemokiner CXCL9, CCL21, CCL22 [8], CCL2 og CCL5 [35]; p53 mutationer [36]; og MHC klasse I [37]. Omvendt tumor-infiltrerende T-celler viser en negativ korrelation med VEGF [8], B7-H1 /PD-L1 [12], CD68 + makrofager [38] og endothelin B-receptoren [39]. Således flere faktorer påvirke sammensætningen af ​​tumor-infiltrerende T-celler i EOC.

Mens denne undersøgelse fokuserede på et enkelt, almindeligt anerkendt tumorantigen, NY-ESO-1, et stort antal andre autoantistof målantigener har blevet identificeret i EOC, herunder HOXA7, Ep-CAM, HSP-90, MUC-1 og p53 [23] – [25]. Faktisk tumorspecifikke autoantistof responser er almindelige blandt EOC patienter. For eksempel, Stone et al. konstateret, at 44% af nydiagnosticerede EOC patienter havde et autoantistof respons på mindst 1 af et panel af 12 tumorantigener [24]. Fremtidige arbejde vil afgøre, om autoantistoffer responser på andre tumorantigener også korrelerer med tilstedeværelsen af ​​tumor-infiltrerende T-celler.

I modsætning til serologisk respons, ved mindre om de målantigener af tumor-infiltrerende T-celler i EOC . T-cellereceptor (TCR) spectratyping undersøgelser har vist, at tumor-infiltrerende T-celler i EOC repræsenterer oligoklonale populationer, hvilket er konsistent med antigeninduceret klonal ekspansion [40] – [44]. Mange undersøgelser har vist anerkendelse af autologe tumorceller ved tumor-infiltrerende T-celler [45] – [50]. Desuden har tidligere arbejde identificeret T specifikke for HER2 /

neu

[44], [51] celler – [53], p53 [54] og folat-bindende protein [55], [56] blandt tumor- infiltrerende eller tumorassocierede T-celler. Så vidt vi ved, den aktuelle undersøgelse er den første til at påvise anerkendelse af NY-ESO-1 af tumor-infiltrerende og tumor-associerede (dvs. ascites afledt) T-celler, som det fremgår af resultaterne for patient IROC013. Interessant T-celle responser på NY-ESO-1 kunne ikke påvises i perifert blod fra denne patient, hvilket indikerer en stærk berigelse af denne T-celle subpopulation i tumor og ascites. Faktisk IFN-y ELISPOT respons til NY-ESO-1 var ens i størrelse, der ses med CEF kontrol peptider. Ikke desto mindre, NY-ESO-1-specifikke subpopulation udgjorde kun 6,6% af alle tumorinfiltrerende CD8 + T-celler i dette emne, hvilket indikerer der sandsynligvis mange andre antigener genkendes af infiltrerende T-celler. Især over 80% af ovariecancere udviser tab af BRCA1 og /eller BRCA2 funktion, hvilket fører til kompromitteret DNA-reparation [57], [58]. Man kan forestille sig, at det resulterende genetisk ustabilitet fører til ekspression af unormale proteiner, der kan tjene som neoantigener til værtens immunsystem.

Selvom tumorinfiltrerende T-celler i forbindelse med forlænget progressionsfri og samlet overlevelse i EOC, det er uklart, om dette afspejler en aktiv eller passiv rolle af T-celler. Med andre ord, T-celler modsætte aktivt tumorvækst eller er de simpelthen markører for en anden funktion af tumoren, der driver resultater? Der er flere linjer af beviser til støtte for den førstnævnte mulighed. Først ikke alle T-celle-undergrupper i forbindelse med prognose; snarere er gunstige resultater knyttet til CD8 + delmængde og dårlige resultater til CD25 + foxp3 + delmængde [11], [12], [20], [21]. For det andet er flere faktorer, der er forbundet med de aktive CD8 + cytolytiske responser også knyttet til gunstige resultater, herunder ekspression af IFN-γ [14], [15], IFN-γ-receptor [16], og IL-18 [17]. MHC klasse I er også blevet forbundet med øget overlevelse i ovariecancer [18], [19]. I den foreliggende undersøgelse, som udelukkende fokuseret på serøs subtype, alle evaluerbare tumorer udtrykte MHC klasse I. Lignende resultater er blevet rapporteret af andre til serøs EOC [59], hvilket tyder på det store flertal af serøse tumorer er MHC klasse I positive og har den evne til at præsentere antigen til tumor-infiltrerende CD8 + T-celler. For det tredje, tumor-infiltrerende T-celler viser signifikant cytotoksicitet mod ovarietumorer

in vitro

[43], [45], [47], [60], [61]. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at kun et mindretal af tumorer i denne og en anden undersøgelse [59] havde betydelig Granzyme B-positive immune infiltrater, tyder på, at cytotoksiske funktion kan undertrykkes

in vivo

. Og endelig, som beskrevet ovenfor, tumorinfiltrerende T-celler viser tegn på klonal ekspansion [40] – [44] og anerkendelse af specifikke antigener [44], [51] – [56], som vist her for NY-ESO-1 (figur 4). Således er beviser akkumulere til fordel for konceptet, at tumor-infiltrerende T-celler spiller en aktiv rolle i at fremme gunstige kliniske resultater i EOC. Tilsvarende i colorektal cancer, funktionelle markører associeret med aktiv Th1-lignende cytolytiske T-celle responser er forbundet med gunstige kliniske resultater [62]. Dette antyder, at immunmodulerende strategier, der forbedrer disse naturligt forekommende T-celle-responser kan forbedre kliniske resultater yderligere.

I modsætning til T-celle-infiltrater, forholdet mellem tumorspecifikke autoantistoffer og kliniske resultater er mindre klar. Dette spørgsmål er blevet studeret mest omfattende for tumorantigen p53, som fremkalder autoantistof reaktioner i 20-25% af EOC patienterne. Goodell et. al. rapporterede en positiv korrelation mellem autoantistoffer til p53 og øget samlet overlevelse i EOC [63]. Imidlertid har andre undersøgelser fundet en negativ sammenhæng [64], [65] eller slet ingen sammenhæng [66], [67]. Som for NY-ESO-1, fandt vi en tendens til dårlige resultater blandt patienter med autoantistoffer til NY-ESO-1 i 35 tilfælde kohorte studeret her (data ikke vist), men denne tendens blev ikke set i en uafhængig kohorte af 35 patienter fra en tidligere undersøgelse [24] (data ikke vist). Som beskrevet ovenfor immunresponset på EOC omfatter flere antigener, mener vi derfor, at den prognostiske betydning af autoantistoffer bedst er rettet ved hjælp af en udvidet panel af tumorantigener og større kohorter patientgrupper.

autoantistof respons til NY-ESO -1 korreleret til T-celle-infiltration af tumor stroma i modsætning til tumor epitel. Dette kan afspejle en statistisk problem, som det absolutte antal af T-celler var højere i tumorstroma forhold til epitel, hvilket tillader de stromale værdier for at opnå statistisk signifikans. Faktisk viste Spearman rank korrelationsanalyse en positiv sammenhæng mellem autoantistoffer til NY-ESO-1 og infiltration af tumor epitel af CD3 + og CD8 + celler, men dette nåede ikke statistisk signifikans (data ikke vist). Alternativt kan der være en biologisk forklaring. I Th1 /Th2 paradigme, er immunrespons menes at polarisere mod humorale eller cytolytiske effektormekanismer [68]. Anvendt på vores resultater, ville dette tyder på, at patienter med stærke autoantistoffer reaktioner ville have svage cytolytiske svar, hvilket kan resultere i ufuldstændig (dvs. stromale) infiltration af tumorvæv af T-celler. En anden mulighed er foreslået af murine modeller, hvor autoantistofniveauer reaktioner har været forbundet med svage CD8 + cytolytiske T-cellereaktioner [69]. I dette tilfælde blev det foreslået, at autoantistoffer lette optagelse og præsentation af tumorantigener ved B-celler på bekostning af dendritiske celler. Da B-celler er mindre potente antigenpræsenterende celler end dendritiske celler, er nettoresultatet en ringere T-celle respons mod tumoren [69]. En sidste overvejelse er, at autoantistofniveauer responser på NY-ESO-1 i den foreliggende undersøgelse, blev korreleret med infiltration af tumor ved ikke kun CD8 + T-celler, men også af CD4 + og foxp3 + T-celler. De sidstnævnte celler kan repræsentere regulatoriske T-celler, der kan forhindre cytolytiske T-cellereaktioner og begrænse omfanget af tumor infiltration [32]. Vi er i øjeblikket indsamler matchede blod og tumor prøver fra en større, prospektiv kohorte af EOC patienter til bedre at forstå forholdet mellem tumor-specifikke autoantistoffer, tumor-infiltrerende T-celler og kliniske resultater.

Selvom det ikke er det primære fokus for dette papir, havde vi mulighed for at vurdere effekten af ​​neoadjuverende kemoterapi på tumor-infiltrerende T-celler i 15 patienter. Generelt viste behandlede tumorer forøget infiltration af alle undergrupper af T-celler, og dette nåede statistisk signifikans for CD3 + og CD8 + -celler. Dette minder om studier i brystkræft, som viste øget T-celle infiltration efter kemoterapi med taxaner [70] og andre midler [71], og en forening med gode kliniske respons. Taxaner kan også fremme tumor-immunitet ved at øge T og NK-celle aktivitet [72] – [75] og antigenpræsentation [76]. Ligeledes kan platinmidler forbedre cytokinsyntese af humane T-celler [77], ophæver suppressor T-celle-aktivitet [78] og sensibilisere EOC celler til Fas-medieret apoptose [79]. Således kan platin /taxan kemoterapi have gunstige virkninger på vært immunitet over for EOC, en hypotese, vi undersøger i øjeblikket i et prospektivt patient kohorte.

Flere grupper har forsøgt adoptiv immunterapi af kræft i æggestokkene ved hjælp af T-celler udvidet fra tumorinfiltrerende T-celler [50], [80] – [89]. Selvom lovende anekdotiske reaktioner er blevet rapporteret, har disse bestræbelser generelt haft begrænset succes. Det er bemærkelsesværdigt, at fast tumor væv fra patient IROC013 var stort set negativt for ekspression af NY-ESO-1, trods NY-ESO-1-specifikke T-celler i tumor og ascites. Hvis dette scenario repræsenterer andre EOC patienter, vil det antyde, at mange tumorinfiltrerende T-celler kan genkende antigener, der er dårligt udtrykt af tumorvæv, muligvis på grund af immun selektion under tumorudvikling. Hvis vi skal realisere løftet om immunterapi til EOC, er der et presserende behov for at identificere mål-antigener, der er afgørende for væksten og overlevelsen af ​​tilbagevendende, kemoterapi-resistente tumorer. Vores resultater tyder på, at autoantistoffer svar holder praktisk værdi for antigen identifikation og garanterer yderligere undersøgelse med hensyn til deres rolle i vært tumor immunitet og kliniske resultater.

Materialer og Metoder

Undersøgelse fag

Alle prøver og kliniske data blev opnået med informeret samtykke under protokoller godkendt af Research Ethics bestyrelse BC Cancer Agency og University of British Columbia. Den retrospektive tilfælde kohorte bestod af 35 kvinder med høj kvalitet serøs kræft i æggestokkene fra hvem matchet serum og tumorvæv var til rådighed (OvCaRe Ovarian Tumor Bank, Vancouver, BC, Canada). Tumorvæv blev opnået på tidspunktet for primær kirurgi forud for enhver anden behandling. Tabel 1 viser de generelle kliniske karakteristika af 35-sag kohorte. Den retrospektive kohorte omfattede også væv fra yderligere 15 kvinder, der modtog neoadjuverende kemoterapi forud for primær kirurgi; disse sager behandles separat i resultater. Blod, ascites og tumor prøver blev også indsamlet fra en prospektiv kohorte af 15 patienter gennem BC Cancer agenturets Tumor Tissue Repository. Kontrolsystemer serumprøver blev opnået fra 60 kvinder med nogen kendt personlig historie af ovariecancer eller andre kræftformer. Alle kontrolpersonerne selvrapporteret modtager et negativt mammografi resultat inden for det seneste år. Aldersfordelingen af ​​kontrollen kohorte (gennemsnit 62,0 år, standardafvigelse 12,3 år, interval 45,9 til 88,9 år) blev ligner sagen kohorte.

Tumor og serumprøver

Retrospektiv kohorte .

Tumor væv blev opnået under primær cytoreduktive kirurgi. Væv havde en iskæmi på mindre end 30 minutter og brugt mindre end 48 timer i formalin før behandles i paraffin. Væv microarray (TMA) blev konstrueret ved at tage dubletter 0,6 mm borekerner fra tumorblokke efter gennemgang af hematoxylin- og eosin-farvede sektioner af en patolog. Kerner blev valgt blandt regioner i tumoren indeholder repræsentative andele af epitel og stroma, og samtidig undgå stærkt nekrotiske regioner. TMA’erne blev samlet under anvendelse af en Patologi Devices væv arrayer (Westminster, MD). Serumprøver fra sager blev indsamlet før kirurgi eller kemoterapi. Blodprøver blev behandlet ved standard laboratorieprocedurer.

prospektivt kohorte.

Blod blev opsamlet før kirurgi i heparanized vakuumbeholderrør, og mononukleære blodceller (PBMC) fra perifert blev isoleret ved Ficoll-densitetscentrifugering. HLA-A2-status blev bestemt ved flowcytometri på en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) efter overfladefarvning PBMC med anti-HLA-A2-antistof (klon BB7.2, BD Pharmingen, San Diego, CA). Ascites indsamlet under operation blev centrifugeret (1200 rpm i 10 min), og røde blodlegemer (RBC) blev fjernet ved behandling med ACK-lysepuffer (Sigma, St. Louis, MO). Fast tumor fjernes under kirurgi blev hakket med skalpeller til ca. 2 mm

2 og blev derefter spaltet natten over ved 4 ° C i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende collagenase type I og IV (hver ved 0,05 mg /ml) , 0,025 mg /ml hyaluronidase og 0,01 mg /ml DNAse I (alle fra Sigma, St. Louis, MO). Efter fordøjelse blev materialet ført gennem en 100 um sterilt cellefilter at fjerne klumper, og den resulterende enkelt cellesuspension blev pelleteret som beskrevet ovenfor.

Immunhistokemi og immunocytokemi

TMAs blev snittet ved 5 um på Superfrost plus slides (Fisher Scientific, Ottawa, ON) og inkuberes natten over ved 37 ° C. Efter afparaffinering blev pladerne placeret i en Ventana Discovery XT autostaineren (Ventana, Tucson, AZ) for immunhistokemisk farvning. Ventana standard CC1 protokol blev anvendt til antigen-genvinding. Primære antistoffer er anført i tabel 2.

TMA’er blev inkuberet med primære antistoffer i 60 minutter, og det passende cross-adsorberet, biotinyleret sekundært antistof (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) blev ansøgt om 32 minutter.