PLoS ONE: Tab af Aktivering EGFR Mutant Gene Bidrager til erhvervet resistens over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer i lungekræft Cells

Abstrakt

Ikke-småcellet lungecancer huser epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) mutationer opnår en meningsfuld respons på EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er). erhvervet resistens over for EGFR-TKI’er Imidlertid kunne påvirke langsigtede resultat i næsten alle patienter. For at identificere de potentielle resistensmekanismer, vi etablerede cellelinjer er resistente over for EGFR-TKI’er fra det menneskelige lungecancer cellelinier PC9 and11-18, som nærede aktiverende EGFR mutationer. En erlotinib-resistent cellelinje fra PC9 og to erlotinib-resistent cellelinier og to gefitinib-resistente cellelinier fra 11-18 blev uafhængigt etableret. Næsten fuldstændig tab af mutant delE746-A750 EGFR-genet blev observeret i erlotinib-resistente celler isoleret fra PC9, og delvis tab af den mutante L858R EGFR-genet kopi blev specifikt observeret i erlotinib- og gefitinib-resistente celler fra 11-18. Imidlertid konstitutiv aktivering af EGFR nedstrøms signalering, PI3K /Akt, blev observeret selv efter tab af det muterede EGFR-genet i alle resistente cellelinier selv i nærvær af lægemidlet. I erlotinib-resistente celler fra PC9, blev konstitutiv PI3K /Akt aktivering inhiberes effektivt ved lapatinib (en dobbelt TKI af EGFR og HER2) eller BIBW2992 (pan-TKI af EGFR familie proteiner). Endvidere erlotinib med enten HER2 eller HER3 knockdown af deres beslægtede siRNA’er inhiberede også PI3K /Akt aktivering. Transfektion af aktiverende mutant EGFR komplementært DNA restaureret lægemiddelfølsomhed i erlotinib-resistent cellelinje. Vores undersøgelse viser, at tabet af afhængighed til mutant EGFR resulterede i gevinst på afhængighed både HER2 /HER3 og PI3K /Akt signalering at erhverve EGFR-TKI modstand

Henvisning:. Tabara K, Kanda R, Sonoda K, Kubo T, Murakami Y, Kawahara A, et al. (2012) Tab af Aktivering EGFR Mutant Gene Bidrager til erhvervet resistens over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer i Lung Cancer Cells. PLoS ONE 7 (7): e41017. doi: 10,1371 /journal.pone.0041017

Redaktør: Yiqun G. Shellman, University of Colorado, USA

Modtaget: Februar 21, 2012; Accepteret: 15 juni 2012; Udgivet: 17 Juli 2012

Copyright: © 2012 Tabara et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af tilskud-in-støtte til videnskabelig forskning på prioriterede områder (Cancer) fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan og af Term Omfattende 3. Kontrol Research for Cancer fra Ministeriet for Sundhed, Labor og Velfærd, Japan. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) er en af ​​de mest udbredte ondartede kræftformer og en førende dødsårsag på verdensplan. Udvikling af lægemidler mod cancer, der er målrettet epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) har forbedret behandling af NSCLC. To repræsentative EGFR-tyrosinkinaseinhibitorer (EGFR-TKI’er), gefitinib og erlotinib, har en fælles quinazolin struktur og er blevet godkendt til behandling af progressiv NSCLC. Både erlotinib og gefitinib viser lignende kinase hæmning selektivitet baseret på kvantitativ analyse af lille molekyle-kinase interaktion kort til 38 kinaseinhibitorer [1], og vis terapeutisk effektivitet mod progressive NSCLC-patienter [2] -. [4]

de mest almindelige aktiverende EGFR mutationer er i ramme deletion i exon 19 (delE746-A750) og punktmutation til erstatning leucin med arginin i codon 858 af exon21 (L858R) [5] – [9]. Disse to store mutationer udgør 85-90% af alle mutationer og forbedre den terapeutiske virkning af EGFR-målrettede lægemidler [10] – [13]. Desuden er disse aktiverende mutationer opnået afhængighed af EGFR i lungecancerceller, hvilket resulterer i forøget modtagelighed for EGFR-TKI såsom gefitinib og erlotinib [6], [14] – [16].

Et alvorligt problem med EGFR -TKI behandling er fremkomsten af ​​lægemiddelresistente tumorer. For erhvervet resistens, sekundær mutation i EGFR-genet T790M [16] – [18] eller alternativt EGFR-uafhængig aktivering af cellevækst signalveje, herunder c-Met-aktivering er velkendt [19], [20]. Tabet af PTEN ekspression er en af ​​de overtagne resistente mekanismer, som blev demonstreret ved at isolere gefitinib-resistente mutanter fra PC9 celler, som huser aktiverende mutation af EGFR [21], [22]. Ud over de velkarakteriserede årsager til lægemiddelresistens i lungecancerpatienter, belysning af yderligere mekanisme for erhvervet resistens er afgørende for udviklingen af ​​nye EGFR-målrettet lægemidler.

I denne foreliggende undersøgelse erlotinib- og gefitinib -resistente cellelinier blev etableret fra to humane lungecancer-cellelinjer, PC9 celler huser delE746-A750 mutationen og 11-18-celler, der huser L858R mutation hhv. Overraskende blev den delvist eller fuldstændigt tab af den mutante EGFR-genet kopi observeret i erlotinib- og gefitinib-resistente cellelinier. Den kliniske betydning af tabet af mutant EGFR diskuteres i forhold til dens tætte tilknytning til erhvervelse af lægemiddelresistens til EGFR-TKI’er i NSCLC patienter.

Materialer og metoder

Cell Culture og reagenser

Humane lungekræft cellelinier, PC9, QG56 og 11-18 blev dyrket i RPMI medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) som tidligere beskrevet [14], [21]. PC9 og QG56 blev venligst stillet til rådighed af Dr. Yukito Ichinose (National Hospital Organization Kyushu Cancer Center, Fukuoka, Japan), og 11-18 var af Dr. Kazuhiko Nakagawa (Kinki University, Osaka, Japan). Erlotinib blev venligst stillet til rådighed af F. Hoffman-La Roche Ltd, gefitinib var AstraZeneca Inc. BIBW2992 blev købt fra Selleck Chemicals, SU11274 og wortmannin var fra Calbiochem, LY294002 var fra Cell Signaling Technology og Lapatinib var fra Toronto Research Chemicals. Anti-HER2 og anti-phospho-HER2-antistoffer blev anskaffet fra Upstate Biotechnology, anti-phospho-EGFR, anti-EGFR, anti-phospho-HER3, anti-phospho-c-Met, anti-phospho-Akt, anti-Akt, anti-PTEN, anti-phospho-ERK1 /2, anti-ERK1 /2, og mutationsspecifikke (L858R i exon 21 og sletning E746-A750 i exon 19) antistoffer var fra Cell Signaling Technology, anti-HER3 og anti-c -met antistoffer var fra Santa Cruz Biotechnology, anti-α-tubulin antistof var fra Sigma-Aldrich, og anti-GAPDH antistof var fra Trevigen. Komplementære DNA (cDNA) for EGFR og aktiverende mutant EGFR blev venligst stillet til rådighed af Dr. Willam Pao og Dr. Nishio. Celler blev transficeret med cDNA anvendelse af Lipofectamine LTX, PLUS reagens og Opti-MEM (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger. Rekombinant human EGF blev købt fra PeproTech. De små interfererende RNA’er (siRNA) svarende til HER2 (5′-AAACGUGUCUGUGUUGUAGGUGACC-3 ‘), HER3 (5′-GGCAGUGUAUAAUCUAUCUCCACUA-3′) og PIK3CA (5’-CCCUAUUGGUGGUGUUACUGGAUCAAAU-3 ‘) blev købt hos Invitrogen, og svarende til EGFR (5’-GAGGAAAUAUGUACUACGA-3 ‘) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Celler blev transficeret med siRNA-duplexer anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX og Opti-MEM (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger.

cytotoksicitetsassays

Eksponentielt voksende cellesuspensioner blev podet i hver brønd, og den følgende dag angivne koncentrationer af de forskellige stoffer blev tilsat. Efter inkubation i 72 timer blev cytotoksicitet bestemmes som tidligere beskrevet [21]. Salg

Western blot analyse

Celler blev skyllet med iskold PBS og lyseret i Triton X-100-puffer (50 mmol /L HEPES, 150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l NaF, 1% Triton X-100, og 10% glycerol, indeholdende 5 mmol /l EDTA, 1 mmol /l phenylmethylsulfonylfluorid, 10 ug /ml aprotinin, 10 ug /ml leupeptin og 1 mmol /l natriumorthovanadat), og proteiner fra cellelysater blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til Immobilon membraner (Millipore Corp.), som tidligere (21) beskrevet. Efter overførsel blev membranerne inkuberet i blokerende opløsning, probet med forskellige antistoffer, vasket og visualiseret under anvendelse af peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (GE Healthcare) og forøget kemiluminescens-reagens (Amersham).

A, Western-blot analyse, som viser ekspressionen af ​​pEGFR, EGFR, pHER2, HER2, pHER3, HER3, pc-Met, c-Met, PTEN, Pakt, Akt, pErk1 /2, og ERK1 /2-proteiner, og α-tubulin som en loading kontrol. B, Eksponentielt voksende PC9 og PC9 /ER1 celler blev udsat for forskellige doser af erlotinib i 5 timer, og efterfulgt af Western blot analyse. C, Eksponentielt voksende 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler blev udsat for forskellige doser af erlotinib i 5 timer, og efterfulgt af Western blot analyse.

Menneskelig RTK arrays

Proteome Profiler human phospho-RTK antistof arrays (R R

h (test) = M × (X /Y), hvor M er en allel-afhængig konstant, der kommer fra forskellene i PCR-amplifikation effektivitet, effektivitet mærkning, og formen af ​​top, mellem vildtype og mutante alleler. Tilsvarende R

h af en lige-del blanding af testceller og henvisningen, R

h (mix), er givet i den følgende ligning.

Fra de to ligninger ovenfor, X og Y er opnået som følger.

ligningerne ovenfor implicerer, at ikke kan estimeres absolutte kopital af den mutante allel i de testede celler, fordi M er ukendt. Dog kan estimeres, relative værdier af kopi-numre til samme mutant allel i forskellige test celler, fordi M er en konstant.

A, Western blots viser ekspressionen af ​​delE746-A750 EGFR og total EGFR i PC9 og PC9 /ER1 celler. B, Påvisning af vildtype og mutation sekvenser ved anvendelse af specifikke primere. PC9 celler viser både vild type og mutanttypen specifikke bånd, while PC9 /ER1, 11-18 og QG56 celler viser only vildtype specifikke bånd. Mut, mutant exon19, og WT, vildtype exon19. C, PCR-analyse viser heteroduplex (Mut /WT) og homoduplex (vægt /vægt og Mut /Mut) i PC9 celler, og kun homoduplex (vægt /vægt) i PC9 /ER1 celler, 11-18 celler huser L858R mutation og QG56 celler indeholdende vildtype EGFR.

A, Western blot-analyse under anvendelse L858R-specifikt antistof og total EGFR antistof, der genkender både vildtype og mutant EGFR. Ekspressionsniveauer af mutant EGFR (L858R), total EGFR og L858R versus total EGFR (L858R /total EGFR) er normaliseret ved deres ekspressionsniveauer i 11-18-celler. Western blot-analyse med primær human endotelcelle (HUVEC) viser ekspression af total EGFR, men ikke mutant L858R EGFR. B, DNA-sekvenser læser af 15 baser omkring L858R mutation i 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler sammenlignes. Pile angiver base ved 2573. Bemærk, at nukleotid 11-18 ved 2573 var G /T heterozygot. C, STED-SSCP analyse af DNA-prøver af 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler i fravær eller tilstedeværelse af lige store mængder af DNA fra humane vaskulære endotelceller (HUVEC’er) er vist. To toppe viser vildtype (WT) og mutant (Mut) EGFR-genet (a). Baseret på de ligninger, der er vist i Materialer og Metoder, kopiere nummer ændringer af vildtype og mutant EGFR gener er estimeret (b).

PCR analyse

For at analysere deletionsmutation , exon 19 af EGFR-genet blev amplificeret ved anvendelse af følgende PCR fremadrettede primere: Salg

vildtype specifikke, 5′-CCGTCGCTATCAAGGAATTAAG-3 ‘mutant specifik, 5′-TCCCGTCGCTATCAAAACATC-3′ både vildtype og mutant type, 5’-ATGTGGCACCATCTCACAATTGCC-3 ‘reverse primer 5′-CCACACAGCAAAGCAGAAACTCAC-3’ og TaKaRa ExTaq polymerase.

for at analysere deletionsmutation, exon5 og 8 i PTEN genet blev opformeret ved anvendelse af de følgende PCR fremadrettede primere : exon5, 5′-CTCTGGAATCCAGTGTTTCTTT-3 ‘exon8, 5′-GCAACAGATAACTCAGATTGCC-3’ reverse primer:. exon5, 5’CCAATAAATTCTCAGATCCAGG-3 ‘exon8, 5′-GTTCTTCATCAGCTGTACTCCT-3’

for at analysere deletionsmutation blev Akt genet opformeret ved anvendelse af de følgende PCR fremadrettede primere: 5′-GGGTCTGACGGGTAGAGTGT-3 ‘reverse primer: 5′-GCGCCACAGAGAAGTTGTT-3’

Patient Selection

Vi valgte primære NSCLC. huser EGFR mutationer, såsom exon 19 delE746-A750 og exon 21 L858R punktmutation fra EGFR mutation status registreringer af Department of Diagnostic Pathology, Kurume Universitetshospital, Kurume, Japan. Disse EGFR mutation status optegnelser var blevet bestemt ved DNA direkte sekventering eller PNA-LNA PCR klemme assay [27], [28].

Cytologiske Prøver fra kræftpatienter

Cell prøver blev indhentet fra pleura effusion (5 tilfælde), lymfekirtel fin nål aspiration cytologi (2 tilfælde), perikardial effusion (1 tilfælde), og cerebrospinalvæske (3 tilfælde), ifølge en tidligere undersøgelse [28]. Pleural effusion og cerebrospinalvæske blev centrifugeret ved 1.500 rpm i 10 min, og den overliggende væske blev fjernet. Sedimentet blev smurt på objektglas, og blev fikseret i 95% ethanol natten over. Fin nål aspiration cytologi af lymfeknuder blev udført under anvendelse af en 23-gauge engangsnål fastgjort til en 10 ml plastsprøjte, og objektglasset blev fikseret natten over i 95% ethanol.

Immunfarvning til aktivering EGFR Mutationer

Immunfarvning analyse blev udført ved anvendelse af anti-EGFR delE746-A750 specifikke (6B6), EGFR L858R mutant-specifik (43B2), og total EGFR (D38B1) antistoffer (Cell Signaling Technology) som beskrevet tidligere [27].

Etik Statement

undersøgelsen af ​​kliniske prøver blev godkendt af Det etiske Komité Kurume University.

A, B, Eksponentielt voksende PC9 og PC9 /ER1 celler blev udsat for forskellige doser af wortmannin (A) og LY294002 (B) i 5 timer, og efterfulgt af Western blot analyse. C. PC9 og PC9 /ER1 celler blev behandlet med PIK3CA siRNA eller scramble (SC) siRNA i 48 h, og efterfulgt af western blot analyse.

Resultater

Etablering af Erlotinib- og Gefitinib-resistente cellelinier fra PC9 og 11-18 celler

For at isolere erlotinib-resistent cellelinier fra PC9 celler, der huser delE746-A750, og fra 11-18 celler, der huser L858R, begge cellelinier blev dyrket i trinvis stigende doser af erlotinib fra 0,05 til 10 uM, i ca. 6 måneder, som tidligere beskrevet [21]. Derefter blev celler uafhængigt valgt fra hvert erlotinib-resistent cellelinje fra hver plastskål, at klonalt udvide en erlotinib-resistent cellelinje, PC9 /ER1, fra PC9 celler, og to erlotinib-resistent cellelinier, 11-18 /ER1- 7 og 11-18 /ER2-1, fra 11-18 celler. Desuden blev gefitinib-resistente cellelinier også uafhængigt isoleret og klonalt ekspanderet (11-18 /GEF10-1 og 11-18 /GEF20-1) fra 11-18-celler. Dosisresponskurver af lægemiddelresistente cellelinier og deres parentale modstykke til erlotinib eller gefitinib viste erhvervelse af resistens over for disse lægemidler i forskellige resistente underlinjer (fig S1). Salg

A, Eksponentielt voksende PC9 og PC9 /ER1 celler udsat for forskellige doser af erlotinib i 5 timer, og efterfulgt af western blot analyse. B, blev C, D, PC9 og PC9 /ER1 celler behandlet i 48 timer med 10 nM scramble (sc) siRNA, 2 nM eller 10 nM EGFR siRNA, HER2 siRNA eller HER3 siRNA henholdsvis og efterfulgt af Western blot analyse.

A, PC9 /ER1 celler blev behandlet med eller uden 1 pM erlotinib, og 5 uM lapatinib i 5 timer, og fulgte Western blot-analyse. B, PC9 /ER1 celler blev behandlet med 10 nM siRNA’er af Scrumble og EGFR familie gener, og udsættes for erlotinib (1 uM) eller BIBW2992 (1 uM) i 5 timer, og fulgte Western blot analyse.

A, blev PC9 /ER1-celler transficeret med del EGFR (E746-A750) cDNA, og fulgte inkubation i forskellige dage. Western blot-analyse blev udført med antistoffer, der genkender del EGFR og total EGFR. B, blev Dosisresponskurver af mock- og aktiveret mutant EGFR cDNA transfektanter af PC9 /ER1 bestemt ved cytotoksicitet assay. Hver værdi er gennemsnittet af tredobbelte skåle ± SD. C, 11-18 /ER1-7 celler blev transficeret med L858R EGFR cDNA, efterfulgt af Western blot-analyse med et specifikt antistof ifølge L858R EGFR. D, Dosisresponskurver af mock- og aktiverede mutant EGFR cDNA transfektanter af 11-18 /ER1-7. Hver værdier er gennemsnit af tredobbelte retter ± SD.

PC-9 /ER1 celler viste 160-250 gange højere modstandsdygtighed over for erlotinib og gefitinib, fem gange højere resistens over for lapatinib på de fleste, og omkring 2000 gange højere resistens mod BIBW2992 (tabel 1). 11-18 /ER1-7, 11-18 /ER2-1, 11-18 /GEF10-1, og 11-18 /GEF20-1 celler viste 20-110 gange højere modstandsdygtighed over for erlotinib og gefitinib og 7 gange højere resistens mod lapatinib og BIBW2992 højst (tabel 1). På den anden side, alle disse resistente celler viste lignende følsomheder til SU11274 og cisplatin som deres forældre modstykker (tabel 1).

Angivelse af vækstfaktorreceptorer og deres Aktivering status i Erlotinib-resistente cellelinier Etableret fra PC9 og 11-18 celler

Western blot analyse viste det mest slående forskel i phosphorylering af EGFR uden markant ændring i fosforylering status HER3, c-Met, Akt og ERK1 /2 mellem PC9 og PC9 /ER1 celler. På den anden side blev relativt lavere phosphorylering af EGFR set i 11-18 /ER1-7 og 11-18 /ER2-1 celler end 11-18 celler (figur 1A).

Vi næste sammenlignet aktiveringsstatus af flere receptortyrosinkinaser, herunder c-Met, Axl, PDGFR og IGF1R som blev overudtrykt i tumorer med EGFR mutationer mellem erlotinib-resistente underlinjer og deres modparter ved hjælp phospho receptortyrosinkinase (RTK) array [29]. Der var dog ingen forskel i aktivering status for disse vækstfaktorreceptorer herunder c-Met mellem drug følsomme og resistente cellelinier (figur S2).

Total EGFR-antistof farvede alle fire histologiske og cytologiske prøver. Anti-delE746-A750 antistof farvede kun kræftceller med delE746-A750-mutation (A, tilfælde 1) (se tabel 2), og EGFR L858R antistof farvede kun kræftceller med L858R mutationer (B, sag 9) i både histologiske og cytologiske prøver. Ingen farvning var tydeligt af både EGFR delE746-A750 og EGFR L858R antistoffer i kræftceller uden aktiverende EGFR mutationer i cytologiske prøver (C: case 6 og D: case 11)

Akt. phosphorylering ikke er blokeret af erlotinib i erlotinib-resistente cellelinier

Vi næste undersøgt effekten af ​​erlotinib på phosphorylering af EGFR, Akt, og ERK1 /2 i erlotinib-resistent cellelinier og deres parentale modstykker (figur 1B og 1C). I PC9 celler, EGFR, Akt og ERK1 /2 phosphorylering blev alle inhiberet på en dosis-afhængig måde ved erlotinib. Men der var næsten ingen hæmning af Akt phosphorylering i PC9 /ER1 celler ved erlotinib, men ERK1 /2 phosphorylering blev tilsvarende hæmmet i PC9 celler (Figur 1B). På den anden side blev EGFR phosphorylering fundet at være tilsvarende undertrykt i 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler ved erlotinib. Men sammenlignet med 11-18 celler, Akt phosphorylering i 11-18 /ER1-7 og 11-18 /ER2-1 celler blev ikke inhiberet af erlotinib. Derimod ERK1 /2 phosphorylering var meget følsomme over for erlotinib i alt 11-18, 11-18 /ER1-7, og 11-18 /ER2-1 celler (figur 1C). Erhvervelse af erlotinib-resistens giver således konstitutive PI3K /Akt fosforylering i resistente celler fra PC9 og 11-18 celler.

Komplet Tab af Aktivering mutant EGFR (delE746-A750) Gene i Erlotinib-resistente PC9 /ER1 Cells

Vi derefter næste undersøgte EGFR status i PC9 /ER1 celler. Western blot analyse under anvendelse af anti-delE746-A750, L858R, og total EGFR-antistoffer viste fuldstændig tab af mutant EGFR proteinekspression i PC9 /ER1 celler (figur 2A). Derefter blev gen-profil af vildtype og mutant EGFR mellem PC9 og PC9 /ER1 celler sammenlignet. Den direkte sekvensanalyse af exon 19 af EGFR-genet afslørede fuldstændigt tab af kun mutantsekvensen i PC9 /ER1 celler (data ikke vist). Dernæst blev PCR-analyse udført i exon 19 af EGFR-genet ved anvendelse af vildtype og mutation specifikke primere. PC9 celler indeholdt både vildtype- og deletionsmutation sekvenser, hvilket indikerer heterozygote alleler for vildtype og mutant EGFR, mens der kun var en vildtype-sekvens i PC9 /ER1 celler (figur 2B). Exon 19 af EGFR-genet blev yderligere amplificeret, og analysen af ​​disse DNA-prøver i gelen konsekvent viste tilstedeværelsen af ​​kun vildtypesekvensen i exon 19 af EGFR-genet i PC9 /ER1 celler, selvom PC9 celler indeholdt både deletion og vildtypesekvensen (figur 2C). Tilsammen viste PC9 /ER1 celler fuldstændigt tab af den mutante EGFR-genet ved erhvervelse af lægemiddelresistens til erlotinib. Salg

Celleproliferation og overlevelse af humane lungecancer-celler, der huser aktiveret mutant EGFR (PC9 og 11-18-celler ) nøje afhænge EGFR-drevne PI3K /Akt pathway, og denne proliferation /overlevelse er meget modtagelige for erlotinib og andre EGFR TKI’er. Først er der en delvis eller fuldstændig tab af mEGFR gen allel i resistente cellelinier, og derefter få af afhængighed af HER2 /HER3 og PI3K /Akt signalering (PC9 /ER1 celler). Imidlertid er mere definitiv analyse på resistente cellelinier af 11-18 påkrævet, fordi 11-18 resistente cellelinier viser kun delvist tab af mEGFR.

delvis fortabelse af den Aktivering Mutant EGFR (L858R) Gene i Erlotinib- eller Gefitinib-resistente cellelinier fra 11-18

Vi yderligere sammenlignet ekspressionsniveauer af vildtype EGFR og mutant EGFR ved et specifikt antistof, der genkender L858R mutant EGFR ved western blot analyse. Sammenlignet med de parentale 11-18 celler, ekspression af den mutante L858R EGFR-protein var relativt lavere i forhold til samlet cellulær EGFR niveauer (figur 3A).

Vi undersøgte derefter, om aktivering mutant EGFR-genet i 11-18 /ER1- 7 og 11-18 /ER2-1 celler var påvirket af købet af erlotinib modstand eller ej. DNA-sekvensanalyse viste tilstedeværelsen af ​​mutationen (L858R) både i de parentale og resistente celler (figur 3B, pile angiver nukleotid 2573), selv om vekslen tophøjderne for nukleotid 2573 var indlysende. Ændret forhold mellem vildtype til mutant EGFR-genet blev også observeret ved PLACE-SSCP-analyse [23], [24], som eksemplificeret i figur 3C. Dette assay viste to uafhængige toppe, en for vildtype og en anden for mutant EGFR-genet, både i 11-18 og erlotinib-resistente celler. Imidlertid tophøjden ratio (Rh) af de to resistente cellelinier var helt anderledes. Med vedtagelsen blande strategi, dvs. blande DNA’erne af HUVEC’er bærer 2 kopier af vildtype EGFR-genet med den af ​​resistente celler, kunne ændringen i kopital af allelen kvantificeres som beskrevet i Materialer og Metoder. Resultaterne viste et fald på 50% af den mutante EGFR-genet uden tilsyneladende ændring af vildtype-EGFR-genet kopi (figur 3C).

Vi undersøgte også, om selektion ved lægemiddelresistens til gefitinib inducerede også lignende ændringer af nedsat ekspression af den aktiverende EGFR-genet. To gefitinib-resistente cellelinier, 11-18 /GEF10-1 og 11-18 /GEF20-1, viste øget EGFR protein udtryk med relativt nedsat ekspression af HER2 og pHER2 i sammenligning med deres forældre 11-18 celler (Figur S3A). I forhold til de parentale 11-18 celler, Akt fosforylering i 11-18 /GEF10-1 og 11-18 /GEF20-1 ikke var påvirket af gefitinib når phosphorylering af EGFR og ERK1 /2 blev ligeledes hæmmet af gefitinib (figur S3B) . Western blot analyse med det anti-L858R antistof viste reduceret ekspression af den mutante EGFR og lignende udtryk for den samlede EGFR i to resistente cellelinier sammenlignet med 11-18 celler (fig S3C). Dernæst udførte vi DNA-sekvensanalyse og fundet en alternerende tophøjde på nukleotid 2573 i gefitinib-resistente celler (Figur S3D). PLACE-SSCP analyse afslørede også en nedsat mutant EGFR-genet kopi uden synlige ændringer i vildtype-EGFR-genet kopi og kvantitativ analyse indikerer om en 50% reduktion af den mutante EGFR-genet i gefitinib-resistente celler (Figur S3E). Ud fra disse analyser af erlotinib- eller gefitinib-resistente cellelinier, kan erhvervelse af resistens være medieret gennem en nedsat mutant EGFR-genet kopi.

Knockdown af HER2 eller HER3 sensitizes konstitutiv aktivering af Akt til Erlotinib i PC9 /ER1 Celler

der var næsten fuldstændig tab af mutant EGFR-genet i PC9 /ER1 mens der kun var delvist tab af mutant EGFR-genet i erlotinib-resistent cellelinier afledt 11-18. Vi analyserede yderligere mere detaljeret enhver mekanisme underliggende erhvervelse af erlotinib modstand i PC9 /ER1. Vi undersøgte virkningen af ​​PI3K-inhibitorer, wortmannin og LY294002 på Akt aktivering i PC9 og PC9 /ER1 celler (figur 4A og 4B). Begge PI3K-inhibitorer på lignende måde inhiberede phosphorylering af Akt, hvilket indikerer, at aktiveret Akt er ligeledes modtagelige for begge inhibitorer i PC9 /ER1 og PC9 celler. Vi bekræftede også specifik undertrykkelse af Akt aktivering i både PC9 og PC9 /ER1 celler, når de behandles med PIK3CA siRNA (figur 4C). Endvidere sekvensanalyse viste, at der var ingen mutation i brændpunkter PIK3CA, PTEN og Akt-genet (data ikke vist). Den konstitutive Akt aktivering i PC9 /ER1 synes ikke at skyldes ændrede PI3K /Akt vej selv.

Vi endelig undersøgt, hvilke molekyler blandt EGFR, HER2 eller HER3 kunne være ansvarlig for den konstitutive Akt aktivering i erlotinib-resistent PC9 /ER1 celler. Vi fandt phosphorylering af HER3 blev ikke undertrykt af erlotinib i PC9 /ER1 sammenlignet med PC9 (figur 5A). Vi undersøgte derefter, om knockdown af EGFR, HER2 eller HER3 deres beslægtede siRNA’er kunne modulere aktiveringen af ​​Akt og EGFR familie proteiner. Knockdown af EGFR resulterede i markant nedsat aktivering af Akt kun i PC9 celler, men ikke i PC9 /ER (figur 5B). På den anden side kunne knockdown af HER3 undertrykke aktivering af Akt i både PC9 og PC9 /ER (fig 5D). Endvidere aktivering af HER3 blev markant undertrykt af HER2 knockdown kun PC9 /ER (figur 5B). Disse resultater tyder på, at HER3 sammen med HER2-signalering er ansvarlige for konstitutiv aktivering af PI3K /Akt i erhvervet resistens over for erlotinib i PC9 /ER.

Vi yderligere undersøgt, om lapatinib, en dobbelt kinase inhibitor af EGFR og HER2, kunne undertrykke Akt aktivering i PC9 /ER1. Behandling med lapatinib hæmmede phosphorylering af Akt og HER3 mens erlotinib ikke gjorde (figur 6A). Vi næste undersøgte effekten af ​​erlotinib eller et pan-tyrosinkinasehæmmer af alt EGFR familie, BIBW2992 [30], på Akt fosforylering i PC9 /ER1 når hver EGFR, HER2 eller HER3 blev stille (figur 6B). Phosphoryleringen af ​​HER2, HER3 og Akt blev alle undertrykt af BIBW2992 alene. På den anden side blev phosphoryleringen af ​​Akt inhiberet af erlotinib med enten HER2 eller HER3 knockdown. Endvidere HER2 knockdown resulterede i en markant inhibering af HER3-phosphorylering, hvilket antyder, at PC9 /ER1 celler får afhængighed HER2 /HER3 signalering (figur 6B).

Vi endelig undersøgt, om ekspression af aktiverende mutant EGFR kan genoprette lægemiddelfølsomhed at erlotinib i resistente cellelinier, PC9 /ER1 og 11-18 /ER1-7. Transient transfektion af del (E746-A750) EGFR cDNA induceret forøget ekspression af aktiveret mutant EGFR i PC9 /ER1 (figur 7A). Overekspression af del (E746-A750) EGFR cDNA overvandt lægemiddelresistens til erlotinib i PC9 /ER1 (Figur 7B). Endvidere transfektion af en anden aktiveret mutant L858R EGFR cDNA inducerede også forøget ekspression (figur 7C) og restaureret lægemiddelfølsomhed for erlotinib i 11-18 /ER1-7 celler (figur 7D).

Tab af Aktivering Mutant EGFR i Ildfaste Ikke-småcellet kræft

Figur 8 viste repræsentative IHC billeder til vildtype, delE746-A750, og L858R EGFR i primære lungekræft væv (Figur 8, hver øverste panel), og også kræft celler i pleural effusion eller cerebrospinalvæske i tilbagevendende patienter efter behandling med gefitinib (figur 8, hver lavere panel). Som vist i tabel 2, ud af 11 patienter, der først modtog gefitinib efter lunge kirurgi og derefter viste tilbagefald, 8 patienter havde delE746-A750 mutation og 3 havde L858R mutation i deres primære lungetumorer. Fire havde T790M mutation i formidling eller metastatisk cytologiske prøver. Ud af 11 refraktære patienter, 2 af de 8 sager, der havde nære den delE746-A750 udviste tab af aktiverende EGFR mutation og 1 af de 3 tilfælde, der havde nærede L858R viste tab af aktiverende mutation (tabel 2). I ét tilfælde (tilfælde 6), blev der observeret både T790M mutation og vildtype EGFR. Der var ingen uenighed mellem ekspressionen af ​​EGFR mutation-specifikke antistoffer og påvisning af EGFR-mutationer ved sekvensanalyse hjælp PNA-LNA PCR klemme assay i alle testede i denne undersøgelse prøver.

Diskussion

Aktivering EGFR-mutationer, såsom delE746-A750 og L858R, forårsage lungekræft celler tæt par EGFR med celledeling eller overlevelse [5], [6], [15].