PLoS ONE: Mod Human kolorektal cancer microbiome

Abstrakt

Flere faktorer drive progression fra sund slimhinde mod sporadiske colorektale carcinomer og akkumulere beviser associerer tarmbakterier med sygdom initiering og progression. Derfor er målet med denne undersøgelse var at tilvejebringe en første høj-resolution map af colon dysbiosis der er forbundet med human colorectal cancer (CRC). Til dette formål blev de microbiomes koloniserer colontumorvæv og tilstødende ikke-malign mucosa sammenlignet ved dyb rRNA-sekventering. Resultaterne viste slående forskelle i mikrobielle kolonisering mønstre mellem disse to steder. Selvom inter-individuel kolonisering i CRC patienter var variabel, tumorer konsekvent dannede en niche for

Coriobacteria

andre foreslåede probiotiske bakteriearter, mens potentielt patogene

Enterobakterier

blev underrepræsenteret i tumorvæv. Som tarmens mikrobiota er generelt stabil i voksenlivet, disse resultater tyder på, at CRC-associerede fysiologiske og metaboliske ændringer rekruttere tumor-fouragering kommensale-lignende bakterier. Disse mikrober har således en tilsyneladende konkurrencemæssig fordel i tumormikromiljøet og derved synes at erstatte patogene bakterier, der kan være impliceret i CRC ætiologi. Denne første glimt af CRC microbiome giver et vigtigt skridt mod fuld forståelse af det dynamiske samspil mellem tarm mikrobiel økologi og sporadisk CRC, som kan give vigtige fører mod nye microbiome-relaterede diagnostiske redskaber og terapeutiske indgreb

Henvisning.: Marchesi JR, Dutilh BE, Hall N, Peters WHM, Roelofs R, Boleij A, et al. (2011) På vej mod Human Colorectal Cancer microbiome. PLoS ONE 6 (5): e20447. doi: 10,1371 /journal.pone.0020447

Redaktør: Niyaz Ahmed, University of Hyderabad, Indien

Modtaget: Februar 18, 2011; Accepteret den 22. april 2011; Udgivet: May 24, 2011

Copyright: © 2011 Marchesi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AB var støttet af den hollandske Cancer Society (KWF; Projekt KUN 2006-3591). Hollandske Digestive Diseases Foundation (MDLS; -projektet WO 10-53). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

den menneskelige tarmkanal indeholder omkring 10

14 bakterier, bestående ~ 10

3 arter, som er afgørende for fordøjelsen af ​​mad, kontrol af intestinal epitel homeostase, intestinal udvikling og menneskers sundhed [1 ]. Omvendt er en stor mængde beviser understøtter en relation mellem smitstoffer og humane cancere [2], og foreslår, at visse mucosa-associeret bakteriearter spiller en vigtig rolle i patogenesen af ​​colorektal cancer (CRC; [3], [4], [ ,,,0],5]. Desuden kliniske sammenhænge mellem bakteriel infektion og CRC er blevet beskrevet i mange årtier, den mest fremtrædende af som vedrører infektioner med

Streptococcus bovis

[6], [7] og

Clostridium septicum

[8] den co-incidens af disse infektioner med CRC er meget lav ( 1%).. eftersom sådanne lav kvalitet opportunistiske patogener kun kan blive klinisk manifest i kompromitterede patienter Tilsvarende serologiske data har vist en øget eksponering til

S. bovis

antigener i tidlige stadie CRC patienter uden kliniske tegn på bakteriel infektion [9]. Baseret på dette, er det blevet foreslået, at bestemte tarmbakterier har en konkurrencemæssig fordel i CRC mikromiljø, mens opportunistiske infektioner forbliver undertrykt af det aktive immunsystem hos størstedelen af ​​patienterne.

Seneste publikationer har tilvejebragt mekanistisk bevis for inddragelsen af ​​tarmbakterier i udviklingen af ​​CRC, som omfatter i), produktion af DNA-beskadigende superoxidradikaler, ii) fremstilling af genotoxins, iii) T hjælper celle-afhængig induktion af celleproliferation, iv) Toll-lignende receptor-medieret induktion af pro-kræftfremkaldende pathways [10] – [14]. På trods af denne enorme krop af indicier, men ingen kliniske data har hidtil været til rådighed for direkte at vise tydelige bakteriel kolonisering mønstre i CRC patienter. Faktisk er den molekylære beskaffenhed af komplekset intestinal samfund var stort set uudforsket før det øjeblik, Eckburg og medarbejdere [15] afslørede tilstedeværelsen af ​​~400 bakteriearter ved sekventering prokaryote ribosomale RNA-gensekvenser fra flere colon slimhinder og fæces fra raske forsøgspersoner . Yderligere undersøgelser afslørede høj intra-individuel variation af intestinale microbiomes i den menneskelige befolkning, mens den mikrobielle kolonisering af slimhinden i voksne individer er relativt stabil i hele tyktarmen [16] – [18]. Baseret på de sidstnævnte observationer vi hypotese, at den grundige analyse af et relativt lille antal parrede vævsprøver on /off-tumor fra CRC patienter kunne afsløre bakteriearter, der kan være impliceret i CRC ætiologi. For at nå dette mål, brugte vi dybt pyrosekventering af bakteriel rRNA at sammenligne CRC tumor microbiomes som i tilstødende ikke-maligne slimhinde tværs seks patienter. Dataene forudsat den første høj opløsning billede af den menneskelige CRC microbiome og viste, at CRC er forbundet med ganske dramatiske ændringer i den vedhængende tarm mikrobiota.

Materialer og metoder

Patient Materiale

Seks patienter (mærket A-F, tabel 1) undergik resektioner for primær colonadenocarcinom ved Radboud Universitet Nijmegen Medical Centre. Efter resektion blev colon prøver skyllet grundigt med sterilt vand, hvorefter enhederne blev undersøgt af en onkologisk patolog. Sygdom blev iscenesat i henhold til Tumor-Node-Metastase (TNM) klassifikation [19]. Fra hver colon prøve, blev biopsier taget fra tumor ( “on-tumor”, A

on-F

på), og fra tilstødende ikke-maligne væv ( “off-tumor”, A

off -F

off) på den luminale side af colon væg (afstand ca. 5-10 cm). Vævsprøver blev sprængt ved mekanisk forskydning, hvorefter totalt DNA blev ekstraheret under anvendelse af AllPrep DNA /RNA-kittet (Qiagen). Alle prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil brug.

Etik Statement

Forskning blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Undersøgelsen blev godkendt af af Medical Etisk udvalg af distriktet Arnhem-Nijmegen (Nederlandene); patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til indsamling af prøver og efterfølgende analyse når det er påkrævet.

denatureringsgradient Gel Elektroforese (DGGE) og Ribosomal intergenisk Spacer Analysis (RISA)

Brug total DNA fra 12 colon biopsier som template, blev bakterielle 16S rRNA-generne amplificeret ved en indlejret tilgang [20] anvendelse af primerne parrene 27f /1492r [21] og L1401r /968f-GC [22], [23] i to efterfølgende PCR-reaktioner (tabel S1) . DGGE blev udført på den resulterende PCR-blanding som tidligere [24] beskrevne. Det skal bemærkes, at synlige bånd (se figur 1) repræsenterer bakteriearter, der har en overflod af mindst 1-10% af det samlede samfund, mens lave rigelige arter, der ikke vil resultere i en påviselige bands af denne tilgang. For at bekræfte DGGE data blev bakterielle ribosomale intergeniske spacer regioner forstærkes med primere 1406f og 23Sr bruger den samme DNA som skabelon (tabel S1 [24]). RISA blev udført som beskrevet tidligere [23].

Et internt fragment (~450 bps) af det bakterielle 16S rRNA-genet blev amplificeret fra colon tissue-ekstraherede DNA ved en bredspektret PCR tilgang hvorefter disse amplicon blandinger blev anvendt til DGGE. Patientkarakteristika kan findes i tabel 1;

off

, ikke-maligne væv;

på

, tumorvæv.

FLX 454 titanium pyrosekventering

I det andet trin af nested PCR tilgang, vi forstærkede V1-V3-regionen i den bakterielle 16S rRNA-genet ved hjælp af primerpar tagged med 12 forskellige metagenom Identification (MID) tags (tabel S1). 454 sekventering blev udført på University of Liverpool Advanced Genomics Facility. Sekvenser er tilgængelige på anmodning.

Læs forarbejdning og samfund mangfoldighed

Alle partielle 16S rRNA gensekvenser blev behandlet indledningsvist bruge Pyro-rørledningen på det ribosomale databaseprojekt (RDP, [25] ; Slip 10) for at trimme og fjerne primere fra de partielle ribotags og begrænse sekvenser til 400 bp og = 500 bp, blev sekvenser behandles ved hjælp af pre.cluster kommando, som minimerer fejl indført ved pyrosekventering platform [26]. Dette trin forudsat at datasæt til analyse (tabel S2) med histogrammer de læste længde vist i figur S2

A

. Dataene fra alle prøverne blev behandlet ved hjælp MOTHUR [27] for at generere indekser for mangfoldighed, fortynding kurver (figur S2

B

) og til at foretage den Libshuff analyse af prøve lighed. MOTHUR blev kørt ved hjælp af de beregningsmæssige faciliteterne i Advanced Research Computing @ Cardiff (Arcca) Division, Cardiff University. Sammenligninger af bibliotekerne fra en person blev udført ved hjælp af RDP Bibliotek sammenligne værktøj. Analyse af ribotags blev også udført ved hjælp MEGAN [28], som input var csv output fra RDP s klassificeringen pipeline (ved hjælp af standardindstillinger og et konfidensniveau på 50%). Den sammenligning værktøj blev valgt og læser normaliseret mellem prøver og Bonferroni korrektion bruges til at fremhæve forskelle mellem prøverne. En tilpasning uafhængig analyse af den dato, blev også foretaget ved anvendelse af 5-mer og frekvens landskab distribution (fLAND) analyse [29] – [31]. Frembringelsen af ​​de 5-mer blev udført ved hjælp af en skræddersyet PERL script (skrevet af BED, efter anmodning) og PCA analyse blev foretaget i MATLAB på Arcca blev fLAND analyse udført ved hjælp af softwaren fLAND

Sammenhæng. analyse

Bias i mikrobiota mellem on-tumor og off-tumor prøver på tværs af patienter blev opsummeret for at identificere systematiske enheder, der enten var konsekvent beriget eller konsekvent udtømt i de to nicher. Alle pyrosekventering læser blev først kortlagt til den SILVA omfattende database over linie, kontrolleret kvalitet 16S /18S rRNA-sekvenser 300 nt (version SSUParc_100; [32]) under anvendelse BLAT V34 med standardparametre og cutoffs [33]. Vi antog, at hver læsning blev afledt fra en anden mikroorganisme, og at prøveudtagning af læser repræsenteret den taksonomiske spredning i den intestinale mikroflora. For hver prøve blev hver læse tildelt sin mest lignende sekvens i SILVA databasen og et resumé af de taksonomiske anmærkninger på de detekterede database sekvenser blev genereret. Hver taksonomisk clade blev vurderet til at afgøre, om det viste en højere brøkdel af læser i off-tumor eller on-tumor prøver til hver patient, og en konsistens score blev beregnet ved at tælle “1”, hvis clade var højere off-tumor, ” -1 “, hvis clade var højere på tumor, og” 0 “, hvis den del af læser on- og off-tumor var identisk (fx hvis clade ikke blev målt i denne patient). Endelig blev disse scoringer summeres, hvilket giver en samlet konsistens score mellem -6 og +6, der afspejler, hvor konsekvent clade blev beriget eller depleteret på tværs af alle patienter. Bemærk, at hver sekvens i SILVA-databasen har to taksonomiske anmærkninger, dvs. EMBL og RDP.

Resultater

DGGE fingeraftryk

Som et første udforskning, profiler af bakterielle 16S rRNA-generne blev dannet ved anvendelse DGGE for tumor og matchende tilstødende ikke-malign (off-tumor) slimhinde fra 6 CRC patienter (tabel 1). Som vist i figur 1, de mikrobielle samfund af tumorvæv og tilstødende “off-tumor” mucosa var markant anderledes og lignende resultater blev opnået, når RISA fingeraftryk blev anvendt på de samme prøver (Fig S1). Især dette resultat står i skarp kontrast med de tidligere bemærkninger, at colon mucosa mikrobiota er næsten identisk på tilstødende steder i raske forsøgspersoner [15], [16], [34] – [36]. Inspireret af denne slående observation, vi næste rettet til en microbiome sekventering tilgang til at kortlægge de microbiome ændringer på en høj opløsning i stedet for sekventering af individuelle karakteristiske bands, der kun repræsenterer de rigelige arter i en bestemt prøve.

FLX 454 titan pyrosekventering

for at definere kolon tumor microbiome på et dybt plan, vi forstærket og sekventeret V1-V3-regionen i de bakterielle 16S rRNA-generne (tabel S1), hvilket resulterede i alt 193,880 ribotags længde 401- 500 bp. Dataene viste høj dækning værdier ( 88%) og fortynding kurver angivet tilfredsstillende prøvetagning af de samfund ved 90% identitet (figur S2

B

, Tabel S2). Libshuff analyse viste, at alle online- og offline-tumor samfund var signifikant forskellige (p 0,0001) fra hinanden (tabel S3). Vigtigt er det, både tilpasning-afhængige og uafhængige metoder støttede observation af disse ændrede tumor microbiomes (figur 2, figur S2

C

D

; Tabel S3). Desuden mens DGGE og RISA kun gav mindre forskelle for patient D, subtil, men væsentlig, forskelle kan identificeres ved den dybe sekventering tilgang. Dette eksemplificerer tydeligt den overlegne opløsning, der kan opnås med sidstnævnte teknologi. Dataene viste en generel tendens til flere Bacteroidetes og færre Firmicutes fra i tumorvæv i forhold til at matche off-tumor slimhinde (figur S3). Men som kunne forventes de observerede microbiome skift viste en høj grad af variabilitet, blandt patienter (Figur S3A-F) og i visse tilfælde var endda i modstrid med den generelle tendens (figur S3

G

). Selvom

S. bovis

eller

C. septicum

infektioner har en kendt klinisk association med CRC, kun meget få sekvenser mappet til rRNA af disse to arter, og blev ikke observeret nogen pålidelig kolonisering af CRC væv. Dette kunne forklares ved, at sådanne opportunistiske patogener er overvejende til stede i forbigående adenom etape af CRC [37].

De 454 sekventering data blev normaliseret i MEGAN (Huson et al. 2009) og parset igennem RDP pyropipeline klassificeringen værktøj (Cole et al. 2009) til at generere en cSV-fil af taksonomisk overflod. Denne fil blev brugt som input til MEGAN at visualisere, hvor familier forskelle mellem ikke-maligne væv (

off

-tumor) og CRC væv (

på

-tumor) samfund er til stede. En høj opløsning billede af denne figur for “zoom-in” formål, kan downloades fra figur S2

E

.

Sammenhæng analyse

For at lokalisere den mest tvingende microbiome ændringer under dannelse af CRC, blev konsekvens mellem patienter beregnes for hver taxon individuelt ved at give den en score på “-1”, hvis den normaliserede antal sekvens læser af denne systematiske enhed i tumorvævet var højere end i matchende off-tumor slimhinde, “en”, hvis den systematiske enhed var mere rigelige i sund slimhinde og “0”, hvis det blev ikke påvist på alle i den pågældende patient. Opsummering disse scoringer tværs patienter resulterede i en konsistens score fra -6 til 6 for hver taxon (tabel 2 og S4, figur S4

A

og

B

). Det skal bemærkes, at nogle sekvenser er bedre kommenteret af EMBL end med RDP, og

omvendt

(se figur S4C), så vi rapporterer både stedet fortrinsvis stoler nogen af ​​disse taksonomiske anmærkninger. Denne fremgangsmåde viste, at CRC væv konsekvent var forbundet med overrepræsentation af underklasse af

Coriobacteridae

, især slægterne

Slackia

og

Collinsella

, der kan betragtes som gut kommensale. På den anden side, er medlemmer af

Enterobacteriaceae

, såsom

Citrobacter

,

Shigella

,

Cronobacter

,

Kluyvera

,

Serratia

Salmonella

spp. (score mellem 4 og 6, Tabel 2, Figur S4

A

og

B

) var underrepræsenteret i CRC væv. Selv om disse fund var konsistente, den relative forekomst af disse taxa afveg betydeligt fra til og fra tumor slimhinde fra de undersøgte patienter som vist i figur 3.

Relativ fordeling af udvalgte CRC over /under repræsenteret taxa blev beregnet som fraktion kommenteret sekvenser af det samlede antal læser i denne særlige prøve. Sammenhæng score for den angivne taxon (se tabel 2) er givet i parentes og afspejler, hvor konsekvent clader blev beriget tværs patienter A-F; grønne søjler angiver den del i

off

-tumor og røde bjælker angiver brøkdel af dette taxon

på

-tumor.

Diskussion

Det mest slående observation fra vores aktuelle undersøgelse var de dramatisk forskellige microbiomes i CRC væv og tilstødende ikke-malign slimhinde i 5 af de 6 undersøgte patienter. Til vores overraskelse, men vi fandt ingen konsekvent overrepræsentation af potentielle sygdomsfremkaldende bakterier i CRC væv. I modsætning hertil overrepræsenteret arter berørte medlemmer af slægterne

Coriobacteridae

,

Roseburia

,

Fusobacterium

Faecalibacterium

, der generelt betragtes som gut kommensale med pro-biotiske træk. Dette antyder, at de observerede mikrobielle forskydninger er forårsaget af de ganske dramatiske fysiologiske og metaboliske ændringer, der skyldes colon carcinogenese selv [38] – [40], og at disse arter kan betragtes som CRC passagerer. Faktisk nylige metabolomics undersøgelser viste ekstremt ændrede ernæringsmæssige betingelser i CRC tumormikromiljøet sammenlignet med ikke-malign mucosa [41]. De mest fremtrædende og konsistente resultater vedrørte en drastisk reduktion i glucose og pyruvat og en stigning i lactat (lav pH), aminosyrer, lipider og fedtsyrer. Den intra-patient variabilitet i microbiome ændringer kunne muligvis afspejle den intra-individuelle variation i CRC tumor mikromiljø [42], hvilket resulterer i den foretrukne rekruttering af forskellige klasser af tarm arter. Især reducerede antal af

Collinsella

spp. og

Roseburia

spp. er tidligere blevet fundet i ældre patienter med ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler sammenlignet med ikke-brugere (NSAID [43]. antyder, at disse bakterier har brug inflammatoriske nicher optimalt kolonisere tarmvæggen Interessant slægterne

Roseburia

,

Fusobacterium

Faecalibacterium

, som er moderat beriget med tumorer tilhører den store butyrat producerende tarmbakterier. butyrat menes at være beskyttende mod CRC ved at inducere en p21-afhængig cellecyklusstandsning hvilket resulterer i en øget apoptose på kræftfremkaldende celler [44]. virkningerne af butyrat er dog stadig under debat som tumor hæmning kan for eksempel være begrænset til de tidlige faser af carcinogenese. markant er det blevet vist, at

Faecalibacterium prausnitzii

secernerer anti-inflammatoriske faktorer, der blokerer NF-KB-aktivering og IL-8-produktion i en eksperimentel dyremodel for Crohns sygdom [45]. Desuden patienter med inflammatorisk tarmsygdom, som er en øget risiko for CRC, har været forbundet med lavere antal

F. prausnitzii

i den intestinale befolkning [46]. Endelig

Slackia

spp. er kendt for at konvertere dietary isoflavoner til mere potente antioxidanter [47] stand til at inducere apoptotiske veje i tumorceller [48]. Således i lyset af vores nuværende data, kunne vi drage den konklusion, at CRC mikromiljø fortrinsvis koloniseret af tarmbakterier med anti-tumorigene og anti-kræftfremkaldende egenskaber, som derved kan forhindre hurtig progression af denne sygdom. Imidlertid kunne man også hævde, at for eksempel butyrat giver en ekstra energikilde for tumorceller, mens dæmpe den inflammatoriske reaktion stopper det medfødte immunsystem i at angribe den spirende tumor. Således kan både tumor undertrykke eller tumorfremmende scenarier kan være mulige udfald af den differentierede kolonisering af CRC væv samt yderligere, detaljerede undersøgelser, vil være forpligtet til at belyse dette spørgsmål.

En anden bemærkelsesværdig observation vedrørte nedsat tilstedeværelse af medlemmer af

Enterobacteriaceae

, såsom

Citrobacter

,

Shigella

,

Cronobacter

,

Kluyvera

,

Serratia

og

Salmonella

spp. i tumorvæv af de undersøgte CRC patienter. Disse data kan antyde, at disse bakterier er en del af den indre microbiome af CRC patienter, men udkonkurreret af de ovennævnte kommensale-lignende bakterier upon sygdomsprogression. Selvom vi indser, at i mangel af en stor henvisning database af slimhinde microbiomes fra raske personer er det vanskeligt at drage konklusioner om denne observation, vil vi gerne benytte lejligheden til kort gennemgå hvorfor enterobakterielle tarmkolonisering kunne være forbundet med en øget risiko for CRC. Først metagenomisk opgørelser af den menneskelige tarm microbiome viste, at

Salmonella

,

Citrobacter

, og

Cronobacter

var blandt de lave rigelige tarm arter eller var endda helt fraværende hos raske personer [15], [49], som er fuldt på linje med deres patogene karakter [50]. Modsat dette bakteriel familie var påviseligt til stede i ikke-maligne colon mucosa prøver fra CRC patienter [36], mens Shen og kolleger for nylig viste, at

Shigella

spp viste en øget overflod i den indre (ikke-maligne) microbiome af adenom patienter [51]. Vigtigere er, har potentiale Enterobakterier at indlede CRC allerede blevet vist for

Citrobacter

arter i en dyremodel [52], og det menes, at denne øgede modtagelighed for CRC skyldes en asymptomatisk, men kronisk, inflammatorisk respons i colon mucosa [53]. Derudover flere enterobakterielt stammer producerer DNA skade genotoxins [54] og kan derved bidrage aktivt til akkumulering af mutationer, der karakteriserer adenom-carcinom sekvens [55]. I den forbindelse kan vores data yderligere tyder på, at på CRC progression, tumormikromiljøet ændringer på en sådan måde, at Enterobakterier erstattes af kommensale-lignende arter eller bakterier med foreslåede probiotiske egenskaber, der har øget adgang til og /eller kan mere effektivt foder i den ændrede tumormikromiljøet. Forsvinden CRC-kørsel sygdomsfremkaldende bakterier fra avancerede CRC tumorvæv kan være analog til, hvad der er blevet rapporteret for

Helicobacter pylori

under mavekræft progression [56].

Alt i alt, vores undersøgelse giver et vigtigt første glimt af CRC-associerede microbiome og indikerer en meget dynamisk forhold mellem tarmbakterier og udviklingslande tumorer. Ikke desto mindre, skal løses i fremtidige undersøgelser, herunder dyb microbiome analyse af udvidede grupper af tumor prøver fra forskellige sygdomsområder stadier, herunder adenomer og biopsier fra et stort sæt af patienter uden kræft til at tjene som reference database mange åbne spørgsmål. Desuden til diagnostiske formål, vil det være vigtigt at undersøge, hvordan de lokale tumor-associerede microbiome skift vedrører fækal mikrobiota sammensætning [57]. er behov for en mere detaljeret analyse af CRC (meta-) genomer og bakterielle transcriptomes at lokalisere de gener, der forårsager forskellen kolonisering i tumoren mikromiljø og for bedre at definere mikrobielle populationer højrisiko. Efterfølgende bør høj risiko og lav risiko bakterielle populationer valideres i (dyr) modeller for sporadisk CRC, og mekanismer for bakteriel indblanding i CRC skal unraveled nærmere. Alt-i-alt, dette sætter dagsordenen for en ny spændende æra i kolorektal cancer forskning, der integrerer mikrobiologi og mikrobiel økologi med tumor biologi. Dette vil føre os i retning af en øget forståelse af de drivende kræfter i CRC, såvel som nye microbiome-relaterede diagnostiske værktøjer og terapeutiske indgreb.

Støtte Information

Figur S1.

RISA fingeraftryk af CRC vævet og ikke-maligne tilstødende slimhinde. Den intergeniske spacerregion mellem 16S og 23S rRNA-generne blev amplificeret med konserverede primerpar (tabel S1) og analyseret ved anvendelse af en Agilent Bioanalyser. Patientkarakteristika kan findes i tabel 1; off, ikke-malignt væv; på, tumorvæv

doi:. 10,1371 /journal.pone.0020447.s001

(PDF)

Figur S2.

En

, Læs længder per prøve, med X

off og X

på kommer fra off-tumor og on-tumor prøver i emne X blev data fra de læste længder efterbehandling via RDP pyropipeline.

B

, Rarefraction kurver for hver prøve, prøven nøglen er den samme som brug for figur S1. Disse kurver blev dannet ved anvendelse MOTHUR, afskåret værdier vises.